ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM CAROLINA DE BUSTAMANTE FERNANDES

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1 Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Faculdade de Medicina Programa de Pós-Graduação em Medicina Doenças Infecciosas e Parasitárias ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM CAROLINA DE BUSTAMANTE FERNANDES Rio de Janeiro 2009

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3 ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM CAROLINA DE BUSTAMANTE FERNANDES Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis Rio de Janeiro Maio/2009

4 Bustamante, Carolina Análise de marcadores moleculares e de resistência in vitro às quinoleínas em isolados de Plasmodium facilparum. Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, xv, 202 f. : il. ; 31 cm. Orientador: Mariano Gustavo Zalis Dissertação (Mestrado) UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Doenças Infecciosas e Parasitárias, Referências Bibliográficas: f Antimaláricos. 2. Resistência. 3.Plasmidium falciparum. 4.pfcrt. 5. pfmdr1 Tese. I. Bustamante, Carolina. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Doenças Infecciosas e Parasitárias. III. Título.

5 ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM Carolina de Bustamante Fernandes Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia Aprovada por: Presidente, Prof. Dr. Prof. Dr. Prof. Dr. Maio/2009

6 ii A meus pais, Marcio Fernandes e Glaucia Bustamante, que desde sempre me conduziram ao caminho do saber. À minha família, em especial minha irmã Luisa e minha avó Ivana pelo constante apoio e estímulo no meu desenvolvimento pessoal. Ao meu namorado, Marco, pela dedicação, amor e incentivo.

7 iii AGRADECIMENTOS Essa tese foi construída e realizada com o apoio infinito de diversas pessoas e instituições. Deixo aqui meus sinceros agradecimentos: Ao Prof. Mariano Zalis, meu orientador, pela atenção, amizade, apoio e paciência durante todos esses anos, agradeço por me ensinar que sempre é possível ir além, mesmo tendo que dar um passo para trás a fim de alcançar dois à frente. Ao Laboratório de Infectologia e Parasitologia Molecular e a meus colegas de trabalho que me acompanharam de perto nessa jornada, agradeço pelo apoio e descontração de todos os dias. Sem dúvida, muitos se tornaram amigos e a esses sou grata, em especial, à Zalona, pelo apoio incondicional de todas as horas, dentro e fora do laboratório, por toda a ajuda nos procedimentos, correção da tese e pela constante amizade. À Camomila, companheira desde o primeiro semestre da faculdade, agradeço por todas as gargalhadas, descontração e pela amizade. A Rafael, pela rabugice engraçada que sinto tanta falta, agradeço por toda ajuda na parte estatística dessa tese. Ao querido Aspira, André, pela descontração de todos os dias. Aos outros membros do laboratório, mesmo os que estão longe ou os que traçaram outros caminhos: Anna Carla, Dani, Flávia, Luis, Martolina, Larissa, Camile, Alex, Érica, Omaira, Babs. À Elieth Mesquita e à minha segunda família de Porto Velho, que me receberam de braços abertos, agradeço por todos os momentos e pelo conhecimento que adquiri neste tempo.

8 iv Ao Prof. Amilcar Tanuri e seu laboratório, onde realizei todo o sequenciamento. Em especial à Monica e à Anna Flavia por toda paciência e ajuda. À tia Wilma, secretária da DIP, por ajudar na elaboração da estrutura da tese. Ao seminário Laveran & Deane sobre malária, pela semana de intenso aprendizado. À pós-graduação em Medicina Doenças Infecciosas e Parasitárias. À minha família, por todos os conceitos divididos, ensinados e aprendidos, pelo apoio e confiança em mim depositados em todos os momentos de minha vida. Agradeço, em especial à minha avó, que mesmo na distância, está sempre em meu pensamento e a meus irmãos, a constante alegria e muito amor. Aos meus pais, pela confiança que possuem em mim, desde a minha infância até os dias de hoje. São exemplos de determinação, dedicação, honestidade, muita felicidade e amor. Agradeço por todos os momentos em que estamos juntos, sempre nos passando segurança e tranqüilidade a fim de que realizássemos todos os nossos objetivos. À minha mãe, minha irmã e namorado pela paciência infinita na correção da tese.

9 v RESUMO ANÁLISE DE MARCADORES MOLECULARES E DE RESISTÊNCIA IN VITRO ÀS QUINOLÉINAS EM ISOLADOS DE PLASMODIUM FALCIPARUM Carolina de Bustamante Fernandes Orientador: Prof. Dr. Mariano Gustavo Zalis Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia. A malária é a doença parasitária de grande impacto na saúde pública, causando aproximadamente 500 milhões de casos clínicos e um milhão de óbitos. A emergência de parasitos resistentes representa um grande desafio para o controle da doença nas áreas endêmicas. Estudos sugerem que mutações pontuais, principalmente em proteínas transportadoras, são responsáveis pela redução da sensibilidade do parasito aos antimaláricos. Um estudo realizado por Mu e cols (2003) demonstrou que 11 genes tiveram uma associação significativa com a susceptibilidade in vitro à CQ e à QN de cepas de laboratório. Dois destes genes, pfcrt e pfmdr1 já foram bem caracterizados, enquanto pouco se conhece sobre os outros nove. Nesse estudo associamos os níveis de susceptibilidade in vitro de P. falciparum às mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, PfA0590w (G2), PfE0775c (G47) e Pf (G7) de amostras coletadas em Porto Velho, Rondônia, Brasil e em Ibadan, Nigéria. A avaliação da susceptibilidade in vitro à Cloroquina, Mefloquina, Amodiaquina e Quinina foi realizada pelo microteste e a análise das mutações por sequenciamento. Foi demonstrada resistência à Cloroquina em 96,5% dos isolados brasileiros e em 22,1% dos isolados nigerianos e resistência à Amodiaquina em 15% dos isolados brasileiros e 33,9% dos isolados nigerianos. As mutações K76T, N86Y, S263P e S241A nos genes pfcrt, pfmdr1, G47 e G2, respectivamente, foram associados à resistência à Cloroquina. Enquanto que mutações K76T, N86Y e N834N&1 no gene G7 foram associadas à resistência à Amodiaquina. Além disso, foi observada resistência cruzada entre as drogas Cloroquina e Amodiaquina e Amodiaquina e Mefloquina. Esse estudo demonstrou um aumento da resistência à Amodiaquina no Brasil e na Nigéria, e uma redução na susceptibilidade do parasito à Cloroquina no Brasil. Também ficou evidenciado que mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 estão associadas à susceptibilidade à Amodiaquina e à Cloroquina. Palavras-chave: Antimaláricos, resistência, malária, falciparum, pfcrt, pfmdr1 Rio de Janeiro Maio/2009

10 vi ABSTRACT ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AND OF IN VITRO RESISTANCE TO QUINOLEINES FROM PLASMODIUM FALCIPARUM ISOLATES Carolina de Bustamante Fernandes Orientador: Prof. Mariano Gustavo Zalis Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina (Doenças Infecciosas e Parasitárias), Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Aplicadas à Infectologia Malaria is a parasitic disease with major impact in the public health, causing approximately 500 million clinical cases and a million of deaths. The emergence of resistant parasites is one of the major challenges to control malaria in the endemic areas. The literature describes punctual mutations, mainly in transporter proteins, as responsible for the susceptibility decrease to antimalarial drugs. A study performed by Mu et. al. (2003) showed that 11 genes had a significant association with in vitro resistance to CQ and QN. Two of these genes, pfcrt and pfmdr1, are well characterized, albeit little is known about the other nine genes. In this study we have associated the in vitro susceptibility levels with the mutations in the pfcrt, pfmdr1, PfA0590w (G2), PfE0775c (G47) and Pf (G7) genes from P. falciparum samples collected at Porto Velho, Rondônia, Brasil and Ibadan, Nigeria. The evaluation of the in vitro susceptibility was performed by microtest and the mutations analysis by direct DNA sequencing of PCR products. Our in vitro test results showed resistance to Chloroquine in 96.5% of the Brazilian isolates and in 22.1% of the Nigerian isolates and resistance to Amodiaquine in 15% of the Brazilian isolates and in 33.9% of the Nigerian isolates. The mutations K76T, N86Y, S263P and S241A in the Pfcrt, pfmdr1, G47 and G2 genes respectively were associated to Chloroquine resistance while the mutations K76T, N86Y and N834N&1 in the G7 gene were associated to Amodiaquine resistance. Furthermore it has been demonstrated cross resistance between Chloroquine and Amodiaquine and Amodiaquine and Mefloquine. This study showed an increase resistance to Amodiaquine in Brazil and Nigeria and susceptibility reduction to Chloroquine in Brazilian parasites. Moreover it made evident that mutations in pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 genes are associated to Amodiaquine and Chloroquine susceptibility. Key words: Antimalarials, resistance, malaria, falciparum, pfcrt, pfmdr1 Rio de Janeiro Maio/2009

11 vii SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS E TABELAS... XII 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA AGENTE ETIOLÓGICO E VETOR CICLO BIOLÓGICO DO P. falciparum DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA MALÁRIA TRATAMENTO DA MALÁRIA POR P.falciparum MECANISMOS DE AÇÃO DAS QUINOLEÍNAS SENSIBILIDADE AOS FÁRMACOS DETERMINANTES MOLECULARES E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS Gene pfcrt e a resistência à Cloroquina Gene pfmdr1 e resistência a multidrogas Outros genes envolvidos na susceptibilidade às Quinoleínas JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS ÁREA DE ESTUDO E CASUÍSTICA AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DO PARASITO Preparo da suspensão das hemácias Diluição dos antimaláricos Preparo das placas de microcultura Contagem da parasitemina e determinação do IC AVALIAÇÃO DAS MUTAÇÕES GENÉTICAS Extração do DNA Plasmodial Amplificação do DNA Purificação do produto da amplificação Quantificação do produto purificado Concentração de DNA dos produtos da purificação Reação de Sequenciamento ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS QUIMIOSSENSIBILIDADE IN VITRO DAS AMOSTRAS Teste in vitro da CQ Teste in vitro da AQ Teste in vitro da QN... 55

12 viii Teste in vitro da MQ AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA CRUZADA ENTRE OS ANTIMALÁRICOS ANÁLISE GENOTÍPICA Gene pfcrt Gene pfmdr Gene G Gene G Gene G ANÁLISE FILOGENÉTICA DAS AMOSTRAS CORRELAÇÃO ENTRE OS POLIMORFIMOS E OS VALORES DE IC 50 IN VITRO Correlação entre a atividade in vitro da CQ e os polimorfismos Correlação entre a atividade in vitro da AQ e os polimorfismos Correlação entre a atividade in vitro dos antimaláricos e os polimorfismos pelo teste de Kruskal- Wallis DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS ANEXO 1: Carta de colaboração com a Prof. Elieth Mesquita (CEPEM) ANEXO 2: Carta da aprovação do comitê de ética para as amostras da Nigéria Anexo 3: Carta de coleboração com o Dr. Christian Happi, Nigéria Anexo 4: Manuscrito do artigo

13 ix LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS µl Microlitro µm Micromolar A Alanina Artemisinine-based combination therapies - Combinação terapêutica com base em ACTs AQ ART derivados da Artemisinina Amodiaquina Artemisinina ASMQ Artesunato-Mefloquina ATP C CDC cols. CQ D DDT DNA dntp E EDTA F H Adenosina 5'-trifosfato Cisteína Center for Disease Control - Centro de Controle de Doenças Colaboradores Cloroquina Ácido Aspártico Dicloro-Difenil-Tricloroetano Ácido Desoxiribonucleico Desoxirribonucleotídeos trifosfatados Ácido Glutâmico Ethylenediamine tetraacetic acid - ácido etilenodiamino tetra-acético Fenilalanina Histidina

14 x HF HXA I IC 50 K kb kda L Mb MDR ml mm MQ N nm OMS PCR Halofantrina Hipoxantina tritiada Isoleucina Concentração inibitória de 50% dos parasitos Lisina Kilobase kilodalton Leucina Megabase Multidrug resistance - resistência à múltiplas drogas Mililitro Milimolar Mefloquina Asparagina Nanomolar Organização Mundial da Saúde Polymerase chain reaction - Reação em cadeia da polimerase Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter - transportador de pfcrt resistência à CQ do P. falciparum Plasmodium falciparum multidrug resistant - gene de resistência à multiplas drogas pfmdr1 do P. falciparum Plasmodium falciparum multiresistent protein - Proteína de resistência múltipla do pfmrp P. falciparum Pgh-1 Glicoproteína 1 Q Glutamina

15 xi QN R Quinina Arginina Restriction fragment length polymorphism - Polimorfismo do Tamanho do RFLP S SNP T TBE TCLE VD Y Fragmento de Restrição Serina Single nucleotide polymorphism - Polimorfismo de único nucleotídeo Treonina Tris/Borato/EDTA Termo de consentimento livre e esclarecido Vacúolo digestivo Tirosina

16 xii LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1 Ciclo do P. falciparum Figura 2 Mapa de risco da malária na Amazônia Lega... 8 Figura 3 Proporção de casos de malária, por espécie de plasmódio Figura 4 Casos de P. falciparum reportador na Nigéria Figura 5 Formação da hemozoína Formação da hemozoína no vacúolo Figura 6 digestivo Figura 7 Complexo formado pela ligação da CQ e o grupo heme Figura 8 Estrutura da proteína do pfcrt Figura 9 Representação da estrutura da Pgh Figura 10 Figura esquemática da placa de teste in vitro Figura 11 Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC 50 para CQ em nm Figura 12 Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC 50 para AQ em nm Figura 13 Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC 50 para QN em nm Figura 14 Distribuição das amostras dispostas pelo valor de IC 50 para MQ em nm Figura 15 Correlação entre os IC 50 s da AQ e da CQ no n total de amostras Figura 16 Correlação entre os IC 50 s da AQ e da CQ em amostras do Brasil Figura 17 Correlação entre os IC 50 s da AQ e da CQ em amostras Figura 18 da Nigéria Correlação entre os IC 50 s da AQ e da MQ em amostras do Brasil Figura 19 Árvore filogenética das amostras com seqüencia dos cinco genes Figura 20 Ramo superior da árvore filogenética Figura 21 Ramo inferior da árvore filogenética... 71

17 xiii Figura 22 Gráfico de IC 50 para CQ das amostras brasileiras e nigerianas e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e pfmdr Figura 23 Gráfico de IC 50 para CQ das amostras nigerianas e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e pfmdr Figura 24 Gráfico de IC 50 para CQ das amostras brasileiras e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e pfmdr Figura 25 Gráfico de IC 50 para AQ das amostras brasileiras e nigerianas e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, Pfcrt e Pfmdr Figura 26 Eletroferograma do seqüenciamento do pfcrt apresentando duas bases na mesma posição Figura 27 Gráfico de IC 50 para AQ das amostras nigerianas e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e pfmdr Figura 28 Gráfico de IC 50 para AQ das amostras brasileiras e as mutações observadas nos genes G2, G47, G7, pfcrt e pfmdr Tabela 1 Mutações em 15 códons associadas à resistência no gene pfcrt e os haplótipos encontrados em diferentes regiões geográficas.. 28 Tabela 2 Mutações e número de cópias do gene pfmdr1 associados à resistência à múltiplas drogas e os haplótipos encontrados em diferentes regiões do mundo Tabela 3 Concentração de cada droga e diluições Tabela 4 Limiares de resistência da CQ, AQ, QN e MQ Tabela 5 Sequência dos oligonucleotídeos Tabela 6 Média, intervalo de confiança e Variação de IC 50 da CQ Tabela 7 Média, IC 95% e variação do IC 50 da CQ em amostras sensíveis e resistentes Tabela 8 Média, intervalo de confiança e Variação de IC 50 da AQ Tabela 9 Média, IC 95% e variação do IC 50 da AQ em amostras sensíveis e resistentes Tabela 10 Média, intervalo de confiança e variação de IC 50 da QN... 56

18 xiv Tabela 11 Média, intervalo de confiança e Variação de IC 50 da MQ Tabela 12 Correlação das atividades in vitro da CQ, AQ, QN e MQ Tabela 13 Haplótipos do gene pfcrt em amostras da Nigéria e do Brasil Tabela 14 Frequencia da mutação K76T do gene pfcrt no Brasil e na Nigéria Tabela 15 Frequencia da mutação N86Y do gene pfmdr1 no Brasil e na Nigéria Tabela 16 Frequencia da mutação 834N&1 do gene G7 no Brasil e na Nigéria Tabela 17 Haplótipos do gene G47 em amostras da Nigéria e do Brasil Tabela 18 Freqüencia da mutação S437A do gene G2 no Brasil e na Nigéria Tabela 19 Resistência à CQ em função das mutações nos genes Tabela 20 Resistência à CQ em função das mutações nos genes em amostras da Nigéria Tabela 21 Resistência à AQ em função das mutações nos genes Tabela 22 Resistência à AQ em função das mutações nos genes em amostras da Nigéria Tabela 23 Teste de Kruskal-Wallis... 87

19 1 INTRODUÇÃO A malária é uma doença infecciosa grave, causada por um protozoário do gênero Plasmodium e transmitido através do repasto sanguíneo do mosquito-fêmea, gênero Anopheles (Cowman e Crabb, 2006). É considerada uma das doenças reemergentes mais graves, provocando cerca de 250 milhões de casos clínicos e um milhão de óbitos ao ano, em todo o mundo. Afeta principalmente crianças abaixo de cinco anos e estima-se que haja o óbito de uma criança a cada 40 segundos na África (Sachs e Malaney, 2002). A malária é um problema que, não só atinge a saúde da população, como também, incide diretamente no caráter sócio-econômico dos países. Em regiões endêmicas, a doença ocasiona ausência do trabalho e escolas, gerando estagnação econômica (Sachs e Malaney, 2002; Lewison e Srivastava, 2008). O parasito acomete o homem desde a pré-história. Provavelmente originário do continente africano, acompanhou a saga migratória do ser humano pelas regiões do Mediterrâneo, Mesopotâmia, Índia e Sudeste Asiático. Sua chegada às Américas, ainda hoje, é motivo de especulações (Dobson, 1994). Em 1880, o médico do exército francês Charles Alphonse Laveran, em exercício na Argélia, foi o primeiro a descrever parasitos da malária no interior dos glóbulos vermelhos humanos. Já em 1897, o médico britânico Ronald Ross, na Índia, elucidou o modo de transmissão do parasito, ao encontrar o protozoário no interior de um mosquito que exercera hematofagia em um portador da doença. O ciclo completo do desenvolvimento do parasito, no homem e na fêmea do Anopheles, foi descrito em seguida pelos pesquisadores italianos Amico Bignami,

20 2 Giuseppe Bastianelli e Batista Grassi, em estudos realizados entre 1898 e 1899 (Villalon et al., 2003). Como não há vacina contra a malária, o controle da doença depende do uso de antimaláricos e de medidas contra o vetor anofelino (Chatterjee et al., 2006). No entanto, a emergência de parasitos resistentes à maior parte dos antimaláricos disponíveis e mosquitos resistentes ao DDT (Dicloro-difenil-tricoloetano) tem se revelado como o maior obstáculo na contenção da doença (Diallo et al., 1999). Algumas drogas, como a cloroquina (CQ) e o Fansidar, não têm mais eficácia e outras, como a mefloquina (MQ), amodiaquina (AQ) ou até mesmo a quinina (QN), têm efeito reduzido sobre o parasito. Muito preocupante é o fato de que, em regiões endêmicas, o parasito possa ser resistente a dois ou mais fármacos, fenômeno conhecido como resistência a multidrogas (Wongsrichanalai et al., 2002). O monitoramento de parasitas resistentes a determinado fármaco é um fator determinante no controle da doença. Testes in vitro, onde o sangue do paciente parasitado é exposto a concentrações precisas do composto, são utilizados para determinar o grau de susceptibilidade do parasito à droga. Uma vez determinada sua susceptibilidade, é possível monitorar o efeito do medicamento e assim determinar a melhor escolha terapêutica para indivíduos de uma mesma região (WHO, 2006). O seqüenciamento possibilitou a busca por homologia de proteínas transportadoras que pudessem estar associadas à resistência aos antimaláricos e à identificação de marcadores moleculares, os quais permitem prever rapidamente a resposta dos parasitos às drogas (Wernsdorfer e Noedl, 2003). Estudos de mapeamento genético e associação de mutações com o perfil de susceptibilidade in vitro identificaram mutações nos genes pfcrt e pfmdr1, que atuam

21 3 nas respostas do parasito aos antimaláricos (Reed et al., 2000; Johnson et al., 2004). O fenótipo de resistência pode estar associado a apenas um gene predominante, no qual há mutações críticas que elevam o IC 50 em testes in vitro - é o caso do gene pfcrt. No entanto, pode ocorrer a interação de outros genes que contribuem para a escala variada de resposta in vitro, encontrada entre amostras de plasmódio (Su e Wootton, 2004). Em um estudo realizado por Mu e cols. (2003), baseado em ensaios in vitro de resposta à CQ, foi encontrada variação quantitativa de susceptibilidade associada aos alelos de genes codificadores de proteínas transportadoras, incluindo o pfmdr1 em adição ao efeito do pfcrt (Mu et al., 2003). Isto é, a correlação da resposta in vitro com os marcadores varia de acordo com a origem geográfica dos isolados. Ou seja, em algumas regiões e possível observar correlação entre certa droga e um marcador, no entanto, essa correlação pode não ser encontrada em relação à mesma droga e o marcador em outras regiões. Esse fato está possivelmente relacionado à seleção dos parasitos pelos antimaláricos utilizados no esquema terapêutico de cada região. Sendo assim, os esquemas terapêuticos de cada país selecionam uma coorte de marcadores moleculares distintos de uma região à outra.

22 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 AGENTE ETIOLÓGICO E VETOR Os agentes etiológicos da malária são protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa, ordem Eucoccidiidae, subordem Haemosporinae, família Plasmodiae, Gênero Plasmodium, com 172 espécies que infectam aves, répteis e mamíferos (Levine, 1988). Cinco dessas espécies infectam naturalmente o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium knowlesi (Singh et al., 2004). Entre as cinco espécies de plasmódio, a malária que é causada por P. falciparum, destaca-se como a forma mais maligna por ser responsável pela aderência dos eritrócitos infectados ao endotélio vascular (citoaderência), causando assim obstrução de pequenos vasos sanguíneos e complicações graves, como malária cerebral (Heddini, 2002; Kirchgatter e Del Portillo, 2005). P. vivax é menos letal, porém causa maior morbidade. É comum em áreas tropicais fora da África, visto que a maioria da população africana não possui o antígeno Duffy na superfície dos eritrócitos necessário para a invasão dessa espécie (Mendis et al., 2001). As espécies P. vivax e P. ovale possuem a habilidade de permanecer latente como hipnozoítos nos hepatócitos (Aguas et al., 2008). Por sua vez, as espécies P. malariae e P. falciparum não formam hipnozoítos, mas podem persistir por décadas no organismo do homem sem manifestar sintomas. A quinta espécie, P. knowlesi, originalmente descrita como infectante apenas de macacos, provou-se, infectar

23 5 também os humanos, tendo sido vinculada como infecção natural do homem na Malásia e no sudeste asiático (White, 2008a). O plasmódio é transmitido ao homem através de vetores da ordem Díptera, família Culicidae, gênero Anopheles. A espécie Anopheles darlingi é aquela de maior abundância no Brasil. Esse mosquito possui alto grau de antropofilia e é capaz de transmitir diferentes espécies de plasmódio (Povoa et al., 2000). Os anofelinos utilizam como criadouros preferenciais as águas limpas, quentes, sombreadas e de baixo fluxo, situação muito frequente na região amazônica (Deane et al., 1969). Na Nigéria, os vetores de maior distribuição e eficiência são An.arabiensis e An.gambiae (Matthews et al., 2007). 2.2 CICLO BIOLÓGICO DO P. falciparum O parasito possui um ciclo biológico complexo em que a transmissão ocorre através da fêmea do mosquito Anopheles. O parasito tem estágios sexuais obrigatórios os gametas masculinos fecundam os femininos no intestino intermediário do mosquito. O zigoto representa o único estágio diplóide do ciclo biológico do plasmódio. A meiose ocorre em até 3 horas após a fertilização e todos os estágios subseqüentes no mosquito e no humano são haplóides (Sinden e Hartley, 1985). Quando o mosquito ingere o sangue de um indivíduo infectado com parasitos geneticamente distintos, a fertilização e a recombinação entre os parasitos geram novos genótipos. A recombinação genética ocorre frequentemente em regiões geográficas com alta taxa de transmissão de malária, ao contrário de regiões onde essa taxa é baixa (Babiker et al., 1994; Paul et al., 1995).

24 6 O ciclo biológico do parasito possui três estágios, dois no humano (estágios exo-eritrocítico e eritrocítico, ambos assexuados) e um no mosquito (estágio sexuado ou esporogônico). As etapas do ciclo estão representadas na Figura 1. Figura 1: Ciclo do P. falciparum. A infecção nos humanos inicia-se quando a fêmea infectante do mosquito Anopheles, ao exercer hematofagia, inocula esporozoítos de sua glândula salivar nos capilares da pele (1). Em 30 minutos, os esporozoítos invadem os hepatócitos (2), onde se reproduzem assexuadamente, formando milhares de merozoítos (3). De 7 a 14 dias, os merozoítos rompem o hepatócito e são liberados na corrente sanguínea (4), onde invadem as hemácias (5) e sofrem maturações morfologicamente distintas, compreendendo três fases, respectivamente: trofozoíto jovem (6), trofozoíto (7) e esquizonte (8). Com a maturação completa, os eritrócitos se rompem, liberando novos merozoítos na corrente sanguínea (9). Em seguida, invadem novas hemácias, reiniciando o ciclo. Após sucessivas gerações de merozoítos, algumas formas se diferenciam em estágios sexuados, os gametócitos (10), que são formas infectantes para o mosquito. A infecção do vetor ocorre quando a fêmea do mosquito Anopheles, durante a hematofagia em indivíduo infectado, ingere os gametócitos femininos e masculinos (11). No estômago do mosquito, o gametócito masculino fecunda o gametócito feminino, gerando o zigoto (12), o qual se alonga, gerando o oocineto (13) que atravessa a parede estomacal (14) do inseto e se transforma em oocisto (15), cujo conteúdo se divide para formar esporozoítos (17). Estes migram para a glândula salivar do mosquito, estando assim prontos para infectarem um novo indivíduo (CDC, 2004).

25 7 2.3 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA MALÁRIA De acordo com os dados da OMS de 2008, a malária é difundida em aproximadamente 100 países, localizados nas regiões tropicais e subtropicais do planeta (WHO, 2008). Cerca de um terço da população mundial está exposta ao risco de transmissão da doença, sendo que 90% dos casos ocorrem na África subsaariana, fazendo, principalmente, vítimas as crianças e gestantes (WHO, 2001). Em outros países, os óbitos acorrem, geralmente, em pessoas não imunes e infectadas por P. falciparum, que não tiveram diagnóstico e tratamento adequados (Baird, 2005). O risco de aquisição da doença não é uniforme dentro de um mesmo país e é frequentemente desigual entre locais situados em uma mesma região, além de sofrer variações com as estações do ano e ao longo do tempo (CDC, 2004). A densidade populacional do parasito nas regiões endêmicas é resultado de um conjunto de fatores climáticos, tais como temperatura, umidade e pluviosidade, condições estas essenciais à sobrevivência e multiplicação do mosquito transmissor. Mesmo nas regiões tropicais e subtropicais não ocorre transmissão em locais de grande altitude, em estações frias, nos desertos, em algumas ilhas do Oceano Pacífico onde não há vetor e em lugares onde a transmissão foi erradicada (Costantini et al., 1996). Em regiões temperadas, como Estados Unidos da América (EUA) e Europa, houve erradicação bem sucedida da malária. Entretanto, o vetor Anopheles ainda está presente, sendo um potencial transmissor à população, se porventura imigrantes ou turistas chegarem contaminados a esses países (CDC, 2004).

26 8 No Brasil, a malária é a mais expressiva das endemias (Brasil/MS/FNS/SVS, 2005). Cerca de 99% dos casos clínicos estão concentrados na Amazônia Legal Brasileira, onde residem apenas 12% da população (Figura 2). Os Estados de maior incidência de malária são Amazonas (38%), Pará (25%) e Acre (22%), seguidos de Roraima (7%), Rondônia (5%), Maranhão (1%), Amapá (1%) e Mato Grosso (1%), com cerca de 460 mil casos reportados no ano de 2007 (Brasil/MS/FNS/SVS, 2008). Ver figura 2. Figura 2: Mapa de risco da malária na Amazônia Legal, Baixo risco: IPA < 10; médio risco IPA 10-49; alto risco IPA 50 (Brasil-MS/FNS/SVS, 2005). No Brasil, há transmissão de três espécies do parasito: P. vivax, P. falciparum e P. malariae (Brasil/MS/FNS/SVS, 2008). As infecções causadas por P. vivax são predominantes (79,6%) Figura 3. Houve redução dos casos de malária por P. falciparum de 25% em 2006, para 19% em 2007, provavelmente devido à ação rápida no tratamento e no diagnóstico realizado pelo governo e à alteração do esquema terapêutico para o tratamento da malária causada por P.falciparum (Brasil

27 9 MS/FNS/SVS, 2005). Além disso, o controle de P. falciparum ocorre de forma mais fácil porque essa espécie produz gametócitos mais tardiamente do que P. vivax (Price et al., 2007). Figura 3: Proporção de casos de malária, por espécie de plasmódio. Amazônia Legal, F+V = Infecção mista por P. falciparum e P. vivax (Brasil MS/FNS/SVS, 2008). A Nigéria está localizada na África Ocidental e possui a maior densidade populacional do continente africano as Nações Unidas estimam que a população, em 2005, era de 141 milhões. Suas maiores cidades encontram-se localizadas nas terras baixas do sul, a parte central do país é composta por colinas e planaltos e o norte consiste de terras baixas áridas. Seus países limítrofes são Benim, Níger, Chade e Camarões. Em comparação, sua área geográfica é pouco maior que o estado de Mato Grosso. A floresta e os bosques se localizam principalmente no terço sul do país, que é afetado por chuvas sazonais oriundas do Oceano Atlântico entre junho e setembro. À medida que segue para norte, o país se torna mais seco e a vegetação

28 10 mais semelhante à da savana. O terço norte do país está incluído na região semiárida do Sahel, que marca o limite sul do deserto do Saara. O país demarca um quarto de todos os casos de malária da África. Em 2007, houve cerca de três milhões de casos e óbitos, a maioria causada por P. falciparum. A transmissão ocorre de forma perene no sul do país e de forma sazonal no norte (Figura 4). Figura 4. Casos reportados/1000 na Nigéria. 2.4 TRATAMENTO DA MALÁRIA POR P.falciparum Na ausência de uma vacina antimalárica até a presente data, o controle da doença depende, quase que exclusivamente, da quimioterapia (Chatterjee et al., 2006), portanto, o diagnóstico rápido, seguido de tratamento imediato são os

29 11 principais componentes da estratégia de controle da doença (WHO, 2005). A eficácia dessa intervenção é dependente dos antimaláricos, que devem ser seguros, eficazes, disponíveis e aceitos pela população em risco (Talisuna et al., 2004). O uso racional desses compostos não só reduz o risco de sintomas graves e encurta o tempo da doença, como também contribui para a redução do desenvolvimento de parasitos resistentes (WHO, 2000). Os antimaláricos são baseados em produtos naturais ou compostos sintéticos produzidos a partir da década de 40 do século passado e são específicos para cada etapa do ciclo de vida do plasmódio. Existem fármacos chamados eritrocíticos, que atuam nas formas presentes nas hemácias. Já os compostos gametocíticos eliminam as formas sexuadas do parasita no indivíduo infectado, impedindo que o hospedeiro transmita a doença para novos mosquitos. Existem ainda os fármacos que agem sobre a forma hepática do parasito, os hipnozoítas. O antimalárico mais antigo e conhecido no ocidente é a QN, composto extraído da casca de várias espécies de árvores, do gênero Cinchona e natural do Peru. A casca era transformada em pó e servida em forma de bebida para curar a doença. Após a conquista do império Inca, a QN foi levada pelos espanhóis para a Europa e teve seu composto ativo isolado, em 1820, pelos químicos franceses Pierre Pelletier e Joseph Caventou, sendo sintetizado em laboratório na década de 40 (Foley e Tilley, 1998). A QN faz parte da família das quinoleínas, que incluem as 4- aminoquinoleínas, as 8-aminoquinoleínas e os alcoóis quinoleínicos (Steck et al., 1948). Durante a segunda guerra mundial, o fornecimento da droga foi interrompido devido às sucessivas invasões de regiões que cultivavam a Cinchona, o que estimulou a substituição da droga pela CQ (Coatney, 1949). Produzida desde 1934,

30 12 a CQ foi considerada o fármaco perfeito, altamente eficaz contra as formas eritrocíticas de P. falciparum, de baixo custo e ausente de efeitos colaterais (White et al., 1992). Devido a seu sucesso, a partir de 1946, passou a ser utilizada extensivamente em todas as regiões endêmicas de malária. A droga era utilizada como tratamento empírico, para qualquer febre e adicionada indiscriminadamente ao sal de cozinha como profilaxia. Com o uso abusivo, muitas vezes em concentrações sub-letais para o parasito e a alta pressão seletiva exercida pela droga, foram reportados os primeiros casos de falha terapêutica no final da década de 50 (Wellems, 1991). Os focos de resistência iniciais foram reportados em 1957, 1959 e 1960, em três lugares geograficamente distantes: Tailândia, Colômbia e Brasil, respectivamente. A partir desses focos iniciais, os parasitos resistentes se alastraram para o sul do continente americano e para o sudeste Asiático. Da Tailândia, difundiram-se para o Ocidente, atingindo o continente africano no final dos anos 70 (Cowman e Foote, 1990). Desde então, a disseminação da resistência à CQ foi lenta e está estabelecida, atualmente, na maioria das regiões onde existe malária. No entanto, ao longo do tempo, outras drogas foram desenvolvidas e passaram a substituir a CQ (Peters, 1985). A AQ foi introduzida em algumas regiões em 1951 e a Sulfadoxina- Pirimetamina (SP), em outras em Contudo, no início dos anos 70 foram reportados diversos casos de resistência a essas drogas. A MQ, um composto derivado do quinino, foi produzido, na mesma década, pelo exército norte americano com o objetivo principal de combater a resistência dos parasitos aos fármacos utilizados à época da guerra do Vietnã (Oduola et al., 1987). Quando a MQ passou a ser administrada em larga escala, surgiram os primeiros casos de falha terapêutica à droga (Nosten et al., 1991). A MQ é um composto que se liga às proteínas

31 13 plasmáticas, portanto, tem meia-vida longa, permanecendo em concentrações subterapêuticas no sangue, o que facilita a seleção de parasitos resistentes (White, 2004). Verificou-se também o fenômeno de resistência à droga em lugares onde esta nunca havia sido utilizada, sendo esse um possível fenômeno da pressão seletiva de outros fármacos (White, 1994). Os chineses, com o intuito também de proteger seu exército na guerra do Vietnã e de conseguir uma vantagem em relação ao exército norte-americano, desenvolveram em 1967 um projeto com o extrato de uma erva medicinal, a Artemisia annua, utilizada para o tratamento de febres desde 340 a.c (Wright, 2005). Em 1970, foi isolada a Artemisinina ou Quinghaosu e a partir dela foram sintetizados vários análogos como o Artesunato e o Arteméter. Esses compostos têm ação esquizonticida e atividade gametocida, limitando assim a transmissão da doença para outros hospedeiros (Hyde, 2002). As drogas também são ativas contra parasitos resistentes aos outros antimaláricos e sua aplicação no tratamento da malária é cada vez mais crescente. Não há relatos de falha terapêutica nos derivados da Artemisinina, contudo, foram reportados alguns isolados de P. falciparum da China e do Vietnã, com sensibilidade in vitro reduzida (Faye et al., 2007). A rápida disseminação de parasitos resistentes a todos os antimaláricos, em sua maioria utilizados como monoterapias, induziu os países a reverem seus esquemas terapêuticos. Ficou então estabelecido que o tratamento contra a malária devesse ser realizado com a combinação de dois antimaláricos, em regime terapêutico denominado de ACTs (Artemisinin-based combination therapies) (Olliaro et al., 1996; White e Olliaro, 1996; White et al., 1999a). Os novos esquemas terapêuticos seriam baseados na combinação de um composto derivado da

32 14 artemisinina com outro antimalárico de ação distinta. A utilização de um único fármaco no tratamento da malária ocasiona a seleção e a disseminação de parasitos resistentes. Já a combinação de dois antimaláricos que atingem alvos diferentes no parasito, é mais eficiente e diminui a probabilidade de surgimento de cepas resistentes (White, 2004). No Brasil, o esquema terapêutico para P. falciparum foi alterado recentemente. Até o ano de 2007, eram utilizados os antimaláricos QN associados com doxiciclina como primeira escolha terapêutica, seguido de MQ como segunda escolha para malária não grave. Devido à disseminação de parasitos resistentes, o Brasil aderiu à campanha da OMS para usar a combinação de antimaláricos. A partir de 2007, passou a utilizar o Coartem, combinação entre arteméter e lumefantrina, esse último antimalárico análogo à QN. O laboratório estadual, ligado à Fundação Oswaldo Cruz, lançou uma nova combinação de artesunato e de MQ, denominada de ASMQ, que também será utilizada no combate da malária na América Latina e na Ásia. Em 2003, o esquema terapêutico para tratar infecções por P. falciparum não complicadas, na Nigéria, ainda era de CQ, mesmo havendo falha terapêutica em cerca de 15%. A segunda escolha terapêutica era AQ para os casos de falha terapêutica com CQ. De 2003 em diante, o país adotou a política de combinação de antimaláricos da ONU (Organização das Nações Unidas), com a utilização, desde então, de arteméter-lumefantrina ou de artesunato-amodiaquina (WHO, 2005; WHO, 2008). No entanto, a distribuição desses medicamentos não é governamental e muitos médicos ainda prescrevem a CQ devido ao seu baixo custo, já que a população nigeriana em sua maioria é de baixa renda.

33 MECANISMOS DE AÇÃO DAS QUINOLEÍNAS Os principais antimaláricos são classificados de acordo com o seu alvo no parasito. As quinoleínas têm como alvo a síntese de hemozoína no vacúolo digestivo (Geary et al., 1986). A SP age em enzimas da rota bioquímica de síntese do DNA (Ferone, 1977). Ainda não foi estabelecido ao certo o alvo da artemisinina e seus derivados; acredita-se que seja um inibidor da Ca 2+ ATPase do retículo sarcoplasmático (Dyer et al., 1996). Os antibióticos, como a tetraciclina e a doxiciclina, agem no plastídeo, uma estrutura homóloga aos cloroplastos de plantas presente no parasito (Dahl e Rosenthal, 2008). O parasita da malária adquire a hemoglobina do hospedeiro para manter seu ciclo biológico. Essa molécula é uma fonte de aminoácidos e extremamente abundante no citoplasma dos eritrócitos humanos, é capturada do citoplasma do eritrócito pela invaginação da membrana, formando uma vesícula de transporte (Yayon et al., 1984). Esse processo ocorre através de uma estrutura tubular periférica denominada citostomo. As membranas, em duplicidade, formam uma vesícula de transporte, que posteriormente se fundem ao vacúolo digestivo (Figura 5).

34 16 Figura 5: Formação da hemozoína. A invaginação do citoplasma pelo Citostomo (C) forma a vesícula de transporte (VT) que posteriormente irá fundir-se ao vacúolo digestivo. MVP = Membrana do vacúolo parasitóforo; MP = membrana plasmática; RER = retículo endoplasmático rugoso; N= núcleo; CG = Complexo de Golgi; P = Plastídeo; M = Mitocôndria; h= heme; H = hemozoína (Bustamante et al., 2009). No vacúolo digestivo, a hemoglobina é digerida pela ação de proteases aspárticas (Plasmepsina I, II, IV) e histoaspárticas (Egan e Ncokazi, 2004). A reação de catálise culmina na liberação de peptídeos que posteriormente são degradados no citoplasma do parasito, originando aminoácidos necessários à sua sobrevivência. Outro composto originário da digestão da hemoglobina é o heme, (Ferridoprotoporfirina IX), um composto extremamente tóxico que se intercala na membrana do vacúolo digestivo, causando aumento da permeabilidade, estresse oxidativo e a morte do parasito (Eggleson et al., 1999; Kumar e Bandyopadhyay, 2005). Para evitar os danos causados pelo heme, o plasmódio desenvolveu um mecanismo de detoxificação através da formação de hemozoína, o pigmento malárico (Egan et al., 2002).

35 17 Estudos recentes mostram que a digestão da hemoglobina pode ser iniciada antes da fusão entre a vesícula de transporte e o vacúolo digestivo. A análise da ultra-estrutura do parasito, na microscopia eletrônica conjunta dos estudos químicos, demonstrou a digestão da hemoglobina e a formação da hemozoína, além de indicar que a vesícula de transporte possui ph ácido, criado por bombas de prótons, ideal para iniciar a digestão da hemoglobina (Hempelmann e Egan, 2002). O heme, originário da digestão, forma um complexo com as proteínas da membrana da vesícula interna e assim desestabiliza a estrutura de camada dupla, ocasionando permeabilidade do vacúolo digestivo (Schmitt et al., 1993). A membrana interna é sacrificada para prover um ambiente hidrofóbico ideal na nucleação da hemozoína, assim como a formação de ligações de ferro-carboxilato dos dímeros de beta hematina (Hempelmann, 2007). O complexo formado pelo heme e a membrana interna também serve de molde para o crescimento do cristal de hemozoína (Egan, 2008). Esse processo é conhecido por biocristalização, em que ocorre um grande esforço de controle da nucleação e do crescimento de cristais (Figura 6).

36 18 Figura 6: Formação da hemozoína no vacúolo digestivo. A VT se funde ao vacúolo digestivo liberando hemoglobina no citoplasma, que é degradada por catálise (1). Da reação são liberados peptídeos (3a), heme (3b) e os fragmentos de membrana (2). Os fragmentos da membrana interna da VT irão formar um ambiente lipofílico ideal para a formação da hemozoína (4). O grupo heme forma dímeros (5) e por biocristalização ocorre a formação da hemozoína (6,7,8) (Bustamante et al., 2009). As aminoquinoleínas e seus derivados interagem com a formação da hemozoína, inibindo ou diminuindo a formação desse cristal (Egan et al., 2000; Egan e Ncokazi, 2005). A CQ pode interagir com os dímeros de heme, formando um complexo heme-cq (Figura 7) e uma vez formado o complexo, a biocristalização é bloqueada com a permanência do heme em sua forma livre e tóxica, causando estresse oxidativo e a consequente morte do parasito (Loria et al., 1999; Kumar e Bandyopadhyay, 2005). A QN também afeta a formação da hemozoína, porém, causa um decréscimo da formação e não o bloqueio da formação, como faz a CQ

37 19 (Egan e Ncokazi, 2005). Pouco se sabe sobre a ação da MQ e da AQ, mas acreditase que o mecanismo de ação seja semelhante ao da CQ e QN. Figura 7: A. Complexo formado pela ligação da CQ e o grupo heme. B. Estrutura química da CQ (Egan, 2006) 2.6 SENSIBILIDADE AOS FÁRMACOS A ineficácia crescente de muitos quimioterápicos empregados habitualmente no tratamento da malária, caracterizando resistência em P. falciparum, é um fato amplamente documentado por estudos já realizados em diversas partes do mundo (WHO, 2001). Com a disseminação de parasitos resistentes, especialmente à CQ em diversas regiões, o problema da eficácia terapêutica na malária emergiu como uma questão de saúde pública de grande relevância, já que causa disseminação da doença em novas áreas e sua reemergência, onde antes havia sido erradicada (Talisuna et al., 2004). O monitoramento da susceptibilidade dos parasitas a um determinado composto é um fator determinante no controle da malária. Com esse conhecimento, pode-se aplicar o melhor protocolo terapêutico, garantindo, assim, a cura da doença

38 20 e a interrupção da pressão seletiva sobre parasitas resistentes ao fármaco utilizado previamente (WHO, 2001) Os métodos tradicionais de avaliação da sensibilidade de P. falciparum a antimaláricos se baseiam, sobretudo, em testes in vitro e/ou in vivo. Os testes in vivo consistem no tratamento de um grupo de indivíduos parasitados, com concentrações pré-determinadas da droga, seguido de monitoramento da resposta clínica e/ou parasitológica durante um determinado período. O teste permite a avaliação das interações entre parasito e hospedeiro, refletindo uma situação clínica e epidemiológica real. No entanto, pode apresentar problemas éticos de acompanhamento do paciente por todo o processo e no controle individual de ingestão do medicamento. Os testes in vitro, por sua vez, baseiam-se na coleta de sangue de um paciente parasitado, de onde os parasitas são expostos às quantidades precisas de um determinado composto em uma placa de microcultura. O teste avalia o grau de inibição de crescimento e/ou morte parasitária, refletindo o nível de susceptibilidade dos parasitas a um determinado fármaco e a uma determinada concentração. Os testes in vitro são laboriosos, porque requerem uma estrutura de laboratório, muitas vezes incomum em campo; é um teste invasivo de coleta de sangue de pacientes, difíceis de serem reproduzidos, e que não considera a questão da policlonalidade das amostras (WHO, 2005). Durante a última década, a procura de métodos alternativos que permitam prever, rapidamente, a resposta dos parasitas aos antimaláricos, tem sido primariamente centrada na procura de marcadores moleculares que possibilitam, a partir de uma reação em cadeia da polimerase (PCR), ou seguida de incubação com uma enzima de restricção (PCR-RFLP) ou de sequenciamento, a detecção da(s) mutação(ões) causadora(as) da resistência a um determinado composto.

39 DETERMINANTES MOLECULARES E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS A disponibilidade da sequência completa de nucleotídeos de P. falciparum possibilitou a aplicação de diversas metodologias baseadas no genoma do parasito. Este contém ~23 megabases (Mb) de nucleotídeos responsáveis por codificarem ~5400 genes localizados em 14 cromossomos. O parasito também possui um plastídeo circular de 3 kilobases (kb) e genoma mitocondrial de 6 kb. Aproximadamente, 60% dos genes preditos codificam proteínas hipotéticas, o que caracteriza um desafio aos pesquisadores que desejam decifrar a função do gene e sua interação com as proteínas. Até o momento, foram utilizadas diversas técnicas para decifrar a função gênica do parasito - micro-arranjos, expressão gênica, sequenciamento, transformação gênica, entre outros - e todas essas técnicas vêm incrementando o conhecimento sobre os mecanismos de resistência do parasito aos antimaláricos (Gardner et al., 2002). Os eventos genéticos que conferem resistência aos antimaláricos são espontâneos e raros, e acredita-se que sejam independentes do uso da droga: o fármaco apenas irá selecionar os parasitos que forem resistentes. Esses eventos são mutações no gene ou mudanças no seu número de cópias. Tanto um quanto outro estão relacionados ao alvo da droga no parasito, podendo afetar uma bomba de influxo/efluxo, alterando a concentração do antimalárico no parasito (White, 2004). Em modelos experimentais, as mutações que conferem resistência podem ser selecionadas ao se expor um grande número de parasitos a concentrações subterapêuticas da droga. A resistência, então, é selecionada em concentrações da

40 22 droga suficientes para eliminar parasitos sensíveis, mas não os resistentes (Peters, 1984). As características farmacocinéticas dos antimaláricos podem influenciar na seleção de parasitos resistentes, já que muitas drogas (lumefantrina, halofantrina, atovaquona e MQ) são lipofílicas, hidrofóbicas e apresentam absorção variada, o que ocasiona a existência de concentrações diferentes da droga no organismo de um indivíduo, facilitando, assim, a seleção da resistência (White, 1992; White et al., 1999b). A meia-vida da droga, também, é outro fator importante na seleção de parasitos resistentes. Dessa maneira, quanto maior a meia-vida de uma droga, maior será a probabilidade de parasitos recém adquiridos encontrarem uma concentração parcialmente efetiva (isto é, seletiva) da droga (Watkins e Mosobo, 1993). Alguns antimaláricos, como a artemisinina e seus derivados, nunca apresentam concentração intermediária que selecione parasitos, porque tais drogas são rapidamente eliminadas, o que já não ocorre em outras, como a MQ, pois há eliminação em semanas ou meses. A resistência do parasito a um fármaco também pode ocorrer de forma cruzada, isto é, quando a tolerância adquirida pelo parasito a um composto, ocorre como resultado da exposição direta de outro, de estrutura química semelhante (White, 2004). A resistência aos antimaláricos se dissemina, porque é uma vantagem para a sobrevivência do parasito na presença de um fator adverso do ambiente (droga) e, portanto, resulta em maior chance de transmissão de parasitos resistentes do que sensíveis. A probabilidade da transmissão dos resistentes, previamente selecionados, irá depender da capacidade de adaptação sobre o estresse no tratamento do parasito, já que a mutação pode ocasionar uma desvantagem na fitness do parasito (White et al., 1999b). Outro fator que altera a probabilidade de transmissão dos parasitos resistentes é o nível de imunidade do indivíduo. Uma

41 23 pessoa infectada com plasmódio pode possuir uma população tanto de resistentes, quanto de sensíveis a certo antimalárico, mas uma vez que o indivíduo é tratado, a droga pode exterminar os sensíveis, restando apenas os resistentes. A pequena população de parasitos restantes pode ser por sua vez, eliminada pela ação do sistema imunológico do indivíduo. Outro fator que altera a probabilidade da transmissão dos parasitos resistentes é a competição intra-específica entre os sensíveis e os resistentes coexistentes em um mesmo indivíduo (White, 2004). A literatura descreve a importância das mutações e da superexpressão de certos transportadores, principalmente daqueles que pertencem à superfamília ABC, na resistência aos antimaláricos (Peel, 2001; Bodo et al., 2003; Klokouzas et al., 2003) Gene pfcrt e a resistência à Cloroquina Desde que parasitos da malária desenvolveram resistência à CQ, houve grande empenho para a melhor compreensão dos mecanismos biológicos e moleculares da resistência. Os parasitos resistentes à CQ acumulam menos droga do que os sensíveis, conseqüentemente, a menor concentração da droga no vacúolo digestivo não bloqueia a formação da hemozoína e o parasito sobrevive, mesmo se o indivíduo estiver se tratando com CQ (Sanchez et al., 2003). No caso dos parasitos sensíveis, a CQ permanece acumulada no vacúolo digestivo, devido a um mecanismo de captura de prótons, em que essa droga, como base fraca, se difunde passivamente através de membranas. A CQ, ao entrar em contato com gradientes de phs ácidos, torna-se mono ou diprotonada (Kumar e Bandyopadhyay, 2005). Uma vez possuindo carga, a droga passa a ser impermeável às membranas e

42 24 permanece acumulada no vacúolo digestivo (Homewood et al., 1972). A CQ também possui alta afinidade de ligação ao heme, o que explica a alta concentração da mesma em parasitos resistentes e, uma vez presa no vacúolo digestivo, a droga pode atingir concentrações milimolares (Chou et al., 1980; Bray et al., 1999). Como parasitos resistentes acumulam menos droga do que os sensíveis, os pesquisadores passaram a especular a possibilidade de a CQ estar sendo repelida do vacúolo digestivo de parasitos resistentes, fenômeno este atribuído a uma proteína na membrana do vacúolo digestivo, codificada pelo gene pfcrt (Sanchez et al., 2005; Bray et al., 2006; Sanchez et al., 2007a). A descoberta deste gene foi realizada através de um experimento de cruzamento genético entre uma cepa do parasito resistente e uma sensível (Wellems et al., 1990). A partir de então, identificou-se um segmento de ~330kb no cromossomo 7, responsável pela segregação da resistência à CQ (Su et al., 1997). Estudos subsequentes foram capazes de caracterizar um gene de 13 exons, codificando uma proteína de 48 kda de 10 domínios transmembranares neste cromossomo a que denominaram de pfcrt (P. falciparum CQ Resistance Transporter) Ver figura 8 (Fidock et al., 2000; Cooper et al., 2002; Martin e Kirk, 2004).

43 25 Figura 8: Estrutura da proteína codificada pelo gene pfcrt. Os pontos pretos, o vermelho e o amarelo representam as mutações associadas à resistência. Cada uma possui a numeração do códon onde é encontrada. Os pontos brancos representam a sequencia de aminoácido e em azul estão definidos os domínios transmembranares (Valderramos e Fidock, 2006). O alelo resistente do gene pfcrt transfectado em uma cepa sensível à CQ foi capaz de reduzir a sensibilidade e o acúmulo da droga no vacúolo digestivo, fato este que estabeleceu o papel central do gene pfcrt na resistência a CQ (Johnson et al., 2004). Ao longo do tempo, uma série de mutações foi associada ao fenótipo de resistência, no entanto, a substituição de uma lisina (K) por uma treonina (T) no códon 76 (K76T), destaca-se, por ser considerada uma mutação crucial que discrimina parasitos resistentes dos sensíveis. Uma vez que o parasito possua o alelo Lys76 (K76), jamais apresentará susceptibilidade acima de 100 nanomolar (nm), ou será resistente à CQ. Os que possuem o alelo 76Thr (76T), geralmente, têm fenótipo de resistência, no entanto, alguns estudos reportaram a presença dessa mutação em parasitos sensíveis. Acredita-se que essa observação seja

44 26 resultado da interação de duas ou mais mutações, a do códon 76 e uma outra no códon 163 (Ser163Arg), por exemplo (Cooper et al., 2002; Johnson et al., 2004). Outros polimorfismos nos códons Ala220Ser (A220S), Asp326Ser, Ile356Thr e Arg371Ile do gene pfcrt, também, foram associados à resistência in vitro à CQ, junto com outras 15 mutações encontradas em isolados de campo e parasitos selecionados in vitro (Jiang et al., 2006). Embora a mutação A220S seja menos freqüente do que a K76T, ela é altamente prevalente entre parasitos CQR (Durrand et al., 2004). Existem três modelos que explicam o mecanismo de resistência do gene pfcrt: efluxo da CQ através de um transportador dependente de energia; escapamento da droga por um poro na membrana do vacúolo digestivo contra seu gradiente de concentração; e um poro que permite o movimento passivo de formas protonadas da droga para fora do vacúolo digestivo. O modelo proposto por Johnson e cols. (2004), no qual o gene pfcrt é um canal por onde a CQ escapa do vacúolo digestivo, sugere que parasitos sensíveis contendo lisina (K76), um aminoácido de carga positiva no códon 76 do gene pfcrt, repelem a CQ, pois esta, também de carga positiva, consequentemente bloqueia a saída da droga da membrana do vacúolo digestivo (Johnson et al., 2004). Quando a lisina é substituída pela treonina no códon 76, a carga positiva é perdida e a CQ escapa do vacúolo digestivo e, portanto, de seu alvo heme. Quando a CQ é adicionada à solução de parasitos junto com a Halofantrina (HF), uma base fraca e muito lipofílica, sua concentração decai completamente, já que a HF se liga com maior afinidade ao heme, indicando que o mecanismo de captura de prótons não é o único atuando na alta concentração da CQ no vacúolo digestivo (Bray et al., 2006).

45 27 Em contraste, outro modelo sugere a aquisição de um processo de efluxo dependente de energia, expelindo a droga do vacúolo. Sanchez e cols. (2003) compararam o acúmulo da CQ no exterior e interior do vacúolo digestivo e a cinética de absorção dessa droga em parasitos resistentes e sensíveis e concluíram que os parasitos resistentes são capazes de acumular CQ no vacúolo digestivo por um processo conhecido como trans-estimulação, sugerindo um mecanismo dependente de energia, possivelmente, envolvendo Adenosina 5'-trifosfato (ATP) (Sanchez et al., 2003; Sanchez et al., 2005; Sanchez et al., 2007b). A trans-estimulação é bloqueada pelo Verapamil e ocorre também quando a CQ pré-carregada no parasito é substituída por outros antimaláricos como AQ e QN e pelo bloqueador de cálcio Quinidina. Contrariando os modelos anteriores, Bray e cols. (2006) propuseram um terceiro, ao investigar o acoplamento energético do processo de efluxo da CQ (Bray et al., 2006), no qual não ocorre nenhum efeito no efluxo da droga quando os parasitos resistentes são privados de glicose ou diante da presença de um inibidor eletroquímico de gradiente de prótons. O esperado nessa situação seria uma redução do efluxo da droga, se o gene pfcrt estivesse agindo como uma bomba ou como um transportador dependente de energia, o que não ocorreu. Então, concluiuse que a força energética estaria na forma de gradiente de próton eletroquímico através da membrana do vacúolo digestivo, já que, ao se colapsar esse gradiente, parasitos sensíveis e resistentes apresentaram acúmulo semelhante da droga no vacúolo digestivo. O modelo sugere, portanto, que o gene pfcrt é um poro aquoso que permite o extravaso passivo de formas protonadas da droga. Os cinco haplótipos de aminoácidos encontrados nos códons 72 a 76 do pfcrt estão relacionados com a origem geográfica do parasito (Tabela 1). Parasitos

46 28 sensíveis possuem haplótipo Cys-Val-Met-Asn-Lys (CVMNK) e são encontrados em quase todas as regiões do mundo. Os parasitos resistentes que possuem haplótipo Cys-Val-Ile-Glu-Thr (CVIET) são originários da África e da Ásia. No sudeste asiático, por sua vez, são encontrados parasitos com o haplótipo Cys-Val-Ile-Asp-Thr (CVIDT), no Pacífico se encontram dois haplótipos diferentes: Cys-Val-Ile-Lys-Thr (CVIKT) e Ser-Val-Met-Asn-Thr (SVMNT) e por fim, há, nas Américas, o haplótipo SVMNT (Su et al., 1999; Wootton et al., 2002; Chen et al., 2003) Tabela 1: Mutações em 15 códons associados à resistência no gene pfcrt e os haplótipos encontrados em diferentes regiões geográficas Região Todas Ásia e África Sudeste Asiático Posição do pfcrt e o aminoácido codificante Linhagem CQS C M N K H A L L I A Q N T I R (HB3, Honduras) CQR Dd2 (Indochina) C I E T H A L L I S E S T T I 734 (Cambodia) C I D T H F I L T S E N S I R 2300 (Indonesia) C I K T H A L L I S E S T I I PH2 (Filipinas S M N T H T L Y I A Q D T I R Pacífico América do Sul 7G8 (Brasil) S M N T H A L L I S Q D T L R CQR = Resistentes à Cloroquina e CQS = Sensíveis à Cloroquina (Valderramos e Fidock, 2006). Como os experimentos moleculares vieram depois de um longo período de pressão da CQ, é difícil saber qual era o genoma do parasito antes do uso da droga. Ao modificar o esquema terapêutico, muitos países retiraram a pressão desse antimalárico sobre os parasitos, portanto, tem-se observado um aumento da prevalência do haplótipo sensível à CQ, possivelmente devido a uma perda na fitness do parasito causada pelas mutações no gene (Temu et al., 2006). O gene pfcrt também pode estar envolvido na resposta a outros antimaláricos, como QN, AQ e MQ. Cooper e cols. (2007) realizaram um experimento em que expuseram parasitos sensíveis (linhagem 106/1) a doses letais de CQ e observaram

47 29 a sobrevivência de parasitos com novas mutações (K76N ou K76I), que mais tarde, apresentaram, não apenas um aumento de 8 a 12 vezes no IC 50, como também, um aumento na sensibilidade à QN e redução de sensibilidade à Quinidina (Cooper et al., 2007). Em outro experimento, em que o alelo de um parasito sensível à CQ (linhagem GC03) foi substituído por um alelo de uma linhagem resistente, observouse aumento da susceptibilidade à QN e à MQ (Sidhu et al., 2002). Outro estudo reporta que os polimorfismos no gene pfcrt também podem atuar na resposta à AQ (Echeverry et al., 2007) Gene pfmdr1 e resistência a multidrogas O fenótipo de resistência às múltiplas drogas foi originalmente identificado em linhagens de células cancerígenas e está associado à super expressão de certos transportadores da superfamília ABC (Borst et al., 1999; Bodo et al., 2003). Um desses transportadores é conhecido como MDR (resistência à multidrogas) e codifica uma proteína denominada de P-glicoproteína (Pgh), responsável por eliminar drogas e manter a concentração do composto citotóxico abaixo do nível letal (Bodo et al., 2003). A extrusão da droga é mediada por hidrólise de ATP, sugerindo a dependência de energia na ação da Pgh (Deeley e Cole, 1997). O MDR não é seletivo e pode reconhecer a estrutura de substratos não relacionados e translocar muitos compostos hidrofóbicos distintos (Zeng et al., 1999). Devido à similaridade de redução do acúmulo da CQ em parasitos resistentes e células tumorais, pesquisadores procuraram por homologia entre os dois genomas e identificaram um ortólogo em P. falciparum, posteriormente denominado de pfmdr1 (Peel, 2001; Klokouzas et al., 2003), que é um gene codificador da proteína Pgh-1

48 30 de ~162kDA, localizada na membrana do vacúolo digestivo (Figura 9). O domínio de ligação do ATP da Pgh-1 está localizado na porção do citoplasma do vacúolo digestivo, surgindo o transporte de substratos na direção do vacúolo digestivo (Foote et al., 1989; Wilson et al., 1993) Com o objetivo de caracterizar as propriedades de transporte da Pgh-1 e sua interação com os antimaláricos, Saliba e cols. (2008) avaliaram a expressão de cinco diferentes formas polimórficas do gene em oocistos de Xenopus laevis (Saliba et al., 2008). Concluíram que a proteína é apta a translocar CQ, QN e HF e o transporte varia entre o haplótipo selvagem e seus variantes polimórficos. O haplótipo selvagem transporta CQ e QN, mas não HF, enquanto que seus variantes transportam HF, mas não CQ e QN para o vacúolo digestivo, indicando que polimorfismos no gene pfmdr1 alteram a especificidade do substrato na proteína (Volkman et al., 1993). Figura 9: Representação da estrutura da Pgh-1. codificada pelo gene pfmdr1, uma transportadora da família ABC, com 12 domínios transmembranares representados em azul. Os pontos brancos simbolizam os aminoácidos da seqüencia e as mutações associadas à resistência estão representadas por pontos vermelhos. Cada um destes pontos vermelhos têm sua localização numerada. (Valderramos e Fidock, 2006).

49 31 O gene pfmdr1 foi ainda associado à susceptibilidade à MQ, QN, CQ e ART. Reed e cols. (2000) realizaram experimentos de transformação e de permuta alélica para examinar o papel das mutações na susceptibilidade a diversas drogas. Foram geradas diferentes linhagens, com combinações distintas de três mutações (Ser1034Cys, Asn1042Asp e Asp1246Tyr). A inserção do alelo, contendo as três mutações na linhagem sensível à CQ, não alterou a susceptibilidade à droga, indicando que as mutações no gene pfmdr1 são insuficientes para conferir resistência à CQ. Entretanto, a transfecção do alelo não mutante na linhagem 7G8 (CQR), resultou numa redução drástica do IC 50 da CQ, implicando que, embora as mutações no gene não sejam suficientes para conferir resistência à CQ, podem agir na modulação do nível da resistência. Além disso, a remoção das três mutações da linhagem 7G8 resultou na reversão da sensibilidade à QN. No entanto, a transfecção das mesmas, na linhagem 7G8, originou parasitos resistentes à MQ e contrariamente, aumentou a sensibilidade à ART, indicando correlação entre mutações no gene pfmdr1 e a susceptibilidade à MQ e à ART. No mesmo experimento, a inserção de uma única mutação (Asp1246Tyr) foi capaz de aumentar mais ainda o IC 50 à MQ e HF (Reed et al., 2000). A tabela 2 indica os códons mutantes do gene pfmdr1 e a respectiva mudança de aminoácidos em parasitos oriundos de diversas regiões do mundo:

50 32 Tabela 2: Mutações e número de cópias do gene pfmdr1 associados à resistência à múltiplas drogas e os haplótipos encontrados em diferentes regiões do mundo Número Posição do aminoácido no pfmdr1 de cópias Região Linhagem (Origem) Todas Tipo selvagem (3D7, Holanda) N Y S N D 1 Ásia e África FCB (Sudeste Asiático) N Y S N D 2 K1 (Tailândia) Y Y S N D 1 América do Sul 7G8 (Brasil) N F C D Y 1 O tipo selvagem é encontrado em todas as regiões do mundo (Todas) enquanto que os mutantes podem ser encontrados na Ásia, África e América do Sul. Tabela adaptada de Fidock e cols. (2000) (Fidock et al., 2000). Alguns estudos também encontraram associação entre a presença da mutação Asn86Tyr (N86Y) e a resistência à CQ em isolados africanos. O alelo Ans 86 (N86), inclusive, está envolvido na tolerância in vivo à lumefantrina e pode, portanto, funcionar como um marcador molecular (Sisowath et al., 2005; Sisowath et al., 2007). Por fim, em um estudo na América do Sul realizado por Zalis e cols. (1998), encontrou-se uma forte correlação entre mutações no gene pfmdr1 e resistência à CQ, porém não à QN (Zalis et al., 1998). A amplificação ou super expressão do gene pfmdr1 influencia a susceptibilidade a diferentes antimaláricos (Price et al., 2004). Observou-se que a amplificação gênica tem papel importante na resistência: o aumento do número de cópias do gene é um grande determinante da resistência in vitro e in vivo à MQ, podendo também determinar a sensibilidade a ART in vitro e capaz de influenciar o aumento do IC 50 da QN. Em outro estudo, Jiang e cols. (2008) estudaram o número de cópias e sua correlação com a resposta às drogas, e verificaram que esse comportamento está associado ao aumento do IC 50 de ART e MQ e diminuição do IC 50 de CQ (Jiang et al., 2008).

51 Outros genes envolvidos na susceptibilidade às Quinoleínas Diferentes clones de P. falciparum, contendo os mesmos alelos e com o mesmo perfil polimórfico, possuem uma vasta gama de susceptibilidade aos antimaláricos, indicando, portanto, a ação de outros genes na resistência dos parasitos. Foi verificado que quanto maior é o IC 50, maior é o acúmulo de mutações no genoma do parasito na resistência a CQ e a QN. Em outro estudo, Ferdig e cols. (2004) encontraram a ação de um novo gene (Pgnhe-1), além do gene pfcrt e do gene pfmdr1 atuando na resistência à QN (Ferdig et al., 2004). Como proteínas transportadoras estão associadas com a resistência a drogas em diversos microorganismos, Mu e cols. (2003), procuraram por transportadores no genoma de P. falciparum e encontraram 49 destes em 97 linhagens oriundas de diferentes regiões geográficas. Em sua análise, Mu e cols. (2003). associaram 11 transportadores ligados à resposta à QN e a CQ (pfcrt, Pfmdr-1 e PFA0590w PF , PF , PF , PF , PFE0775c, PF , PF , PFL0620c). No mesmo estudo, os autores também perceberam que a combinação das mutações nos 11 transportadores é responsável por diferentes níveis de susceptibilidade às drogas. Uma observação interessante, no mesmo experimento, foi a associação entre padrões de polimorfismos e a suscetibilidade de parasitos de regiões geográficas distintas (Mu et al., 2003). Isto é, enquanto algumas mutações apresentaram associação com a resposta à QN e/ou CQ em parasitos africanos, a mesma associação foi muito fraca ou nula em parasitos de outras regiões geográficas, o que indica a importância da pressão da droga exercida nos parasitos oriundos de diferentes políticas de tratamento adotadas pelos países. Assim sendo,

52 34 essa pressão seleciona uma combinação de mutações, podendo estar associadas à suscetibilidade às drogas em algumas regiões e não em outras. Anderson e cols. (2005), utilizando uma abordagem estatística diferente, analisaram a associação entre os polimorfismos previamente descritos por Mu e cols. (2003) e a susceptibilidade à droga em isolados coletados de pacientes da Tailândia. Ao contrário do estudo de Mu e cols. (2003), não encontraram nenhuma associação entre os nove novos transportadores e a resposta à QN e CQ. Essa nãocorrelação pode ser devida à origem geográfica das amostras. Em adição, foi encontrada associação entre o gene G7 com a suscetibilidade ao Artesunato (Anderson et al., 2005). Estudos recentes encontraram associação entre o gene pfmrp (G2) e a susceptibilidade à QN (Mu et al., 2003; Klokouzas et al., 2004; Ursing et al., 2006; Henry et al., 2008a). Esse gene codifica uma transportadora da família ABC e tem papel importante no transporte de glutationa na membrana plasmática do parasito, e a redução na susceptibilidade à CQ e à QN foi significantemente associada às mutações nos códons 191 e 437 (His191Tyr e Ser337Ala) (Henry et al., 2008a). Ferdig e cols. (2004) identificaram um papel importante do cromossomo 13 na resistência a QN, assim como o efeito do cromossomo 9 que interage com o cromossomo 13. Um segmento nesse cromossomo contém um gene que codifica uma permutadora de Na + /H +, a Pfnhe-1, associada à regulação do ph na transmembrana do vacúolo digestivo e do citosol. O número de repetições da sequência de aminoácidos Asp-Asn-Asn-Asn-Asp (DNNND) na proteina Pfnhe-1 está relacionado com a susceptibilidade à QN. Estudos subseqüentes examinaram o ph do citosol e do vacúolo digestivo e a atividade da proteína Pfnhe-1 em diferentes linhagens de parasitos, observando-se que o ph do citosol elevado está associado

53 35 com o aumento da atividade da proteína Pfnhe-1 e com o elevado nível de resistência à QN, devido a interação entre os cromossomos 13 e 9. Essa associação, por sua vez, não foi identificada em relação à CQ (Ferdig et al., 2004).

54 3 JUSTIFICATIVA A compreensão dos mecanismos de resistência aos antimaláricos é fundamental no entendimento da ação das drogas, no desenvolvimento de novos alvos terapêuticos e na descoberta de biomarcadores que servem como uma ferramenta no diagnóstico e na epidemiologia molecular da resistência do parasito aos antimaláricos. A capacidade de resistência a drogas em parasitos retrata um grande impasse na quimioterapia da malária. Este fenótipo, frente a diferentes classes de drogas citotóxicas, está freqüentemente associado com as mutações em um ou mais membros de proteínas da superfamília ABC que são transportadoras transmembranas dependentes de energia. Estes transportadores incluem a proteína Pgh-1, codificada pelo gene pfmdr1. A fim de verificar se outros transportadores também poderiam estar associados ao fenótipo de resistência às drogas, Su e cols. (dados não publicados) procuraram por estas proteínas no genoma do plasmódio e identificaram 22 mutações em sete proteínas transportadoras. Em seguida, foi realizado o teste in vitro para CQ e QN e observou-se que quanto maior era o IC 50, maior era a freqüência de mutações, havendo consideravelmente mais mutações em parasitos resistentes do que em sensíveis. Em seguida, Mu e cols. (2003) identificaram nove novos transportadores, além do pfcrt e do pfmdr1 com associação à resposta in vitro à CQ e à QN. Verificou-se que essa associação variava de acordo com a origem geográfica das amostras, sendo mais significativa em algumas regiões do que em outras. O gene G2, por exemplo, teve associação significativa à resposta in vitro à CQ na Ásia, mas

55 37 não nas Américas; o gene G7 foi associado à resposta in vitro à CQ na África, no entanto não houve esta associação nas Américas. As amostras estudadas por Mu e cols. (2003) eram provenientes de cepas de laboratório, que permaneceram sem a pressão seletiva da droga em cultivo. O número pequeno de amostras geograficamente semelhantes dificulta o estudo da relação entre as mutações genéticas e a resposta in vitro em cada região endêmica. Portanto, é necessário um estudo que, em lugar de cepas de laboratório, utilize isolados de campo originários de duas regiões geograficamente distintas, que tiveram pressão seletiva de antimaláricos diferentes. Em nosso estudo as amostras foram selecionadas no Brasil e na Nigéria, por serem países que tiveram escolhas terapêuticas distintas até Foram selecionados os marcadores moleculares pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 para análise de relação das mutações genéticas e da resposta in vitro, não apenas à CQ e à QN, mas também à MQ e à AQ. A associação das mutações com a susceptibilidade in vitro a essas duas últimas drogas não foi analisada em outros estudos. Como são quinoleínas e, portanto, estruturalmente semelhantes, é possível obter-se uma associação significativa entre as mutações e a resposta in vitro a essas drogas. Embora o tratamento de P. falciparum de primeira linha tenha sido modificado no Brasil e na Nigéria, a compreensão dos mecanismos de resistência aos antimaláricos ainda é escasso, principalmente em relação a outros antimaláricos diferentes da CQ. Portanto, a melhor compreensão de genes associados à resistência a todos os antimaláricos pode realçar o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resistência e a descoberta de biomarcadores que atuam como ferramentas de diagnóstico da resistência aos antimaláricos.

56 4 OBJETIVOS O principal objetivo do presente estudo é determinar se os níveis de resistência do P. falciparum aos antimaláricos in vitro estão associados às combinações de mutações nos genes pfcrt, pfmdr1, G2, G7 e G47 em duas coleções de plasmódio obtidas no Brasil e na Nigéria. Os objetivos específicos desse trabalho são: Determinar a presença das mutações K76T (pfcrt), N86Y (pfmdr1), S437A (G2), N834N&1 (G7) e V241L e S263P (G47) em isolados de P. falciparum obtidos dos pacientes. Comparar a freqüência das mutações com o perfil de susceptibilidade in vitro dos antimaláricos CQ, AQ, MQ e QN. Associar as combinações polimórficas dos cinco genes ao perfil de susceptibilidade in vitro. Comparar o perfil de susceptibilidade e a associação das mutações entre Nigéria e Brasil.

57 5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 ÁREA DE ESTUDO E CASUÍSTICA Esse é um estudo retrospectivo a partir de uma coleção de 150 amostras de um banco de dados do Centro de Pesquisa de Patologias Tropicais CEPEM/IPEPATRO, em Porto Velho, Rondônia e do Laboratório de Pesquisa de Malária da Universidade de Medicina do Ibadan, em Ibadan, Nigéria. As amostras do CEPEM foram coletadas entre 2006 e meados de 2008, como parte de um banco de dados do projeto Interações Moleculares do Receptor da Célula Vermelha com Ligantes de P. falciparum" (CEP n 045/06), bem como, de outro projeto: Determinantes Moleculares da Resistência de P. falciparum a drogas antimaláricas (CEP n 046/06). Em anexo, segue a carta de colaboração com a Prof. Elieth de Afonso Mesquita do CEPEM (Anexo 1). As amostras nigerianas foram coletadas entre 2006 e 2007 como parte do projeto Molecular determinants of drug response and resistance in P. falciparum from Africa and South America aprovado pelo UI/UCH Institutional Review Committe da Universidade do Ibadan, na Nigéria. Em anexo, segue a carta de aprovação do projeto pelo comitê de ética (Anexo 2) e a carta de colaboração com o Dr. Christian Happi (Anexo 3).

58 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IN VITRO DO PARASITO O teste in vitro dos parasitos provenientes do Brasil e da Nigéria foi realizado pelo método de microteste com incorporação de hipoxantina tritiada (HXA), em ambos os países, segundo protocolo previamente estabelecido (Desjardins et al., 1979). Os parasitos da Nigéria foram testados, apenas, para os antimaláricos CQ e AQ, já que usualmente não possuem QN e MQ para o teste in vitro enquanto que, os do Brasil tiveram o teste in vitro realizado com os antimaláricos CQ, AQ, QN e MQ. Todos os fármacos foram obtidos do Walter Reed Army Institute of Research, Washington, EUA. O teste in vitro foi realizado diretamente após a coleta de sangue do paciente, sem adaptação do parasito em cultivo Preparo da suspensão das hemácias A coleta de sangue do paciente se procedeu por punção venosa com tubo vacuntainer contendo heparina. Em seguida o tubo vacuntainer foi centrifugado para a separação do plasma das hemácias. O plasma foi retirado do tubo e o sangue posteriormente lavado duas vezes com meio de cultivo RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute médium). Após a lavagem, 250 µl de sangue foram adicionados a um microtubo de 1,5 ml e 100 µl foram adicionados ao papel de filtro (Whatman International Maidstone, UK). Outra alíquota de 700 µl foi adicionada a um tubo falcon de 15 ml para o teste in vitro. Nesse tubo foram adicionados 13,3 ml de meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 0,5% de Albumax e também sangue não parasitado do tipo O negativo para o ajuste da parasitemia para 1% e hematócrito de

59 41 1,5% Diluição dos antimaláricos Os antimaláricos CQ e QN foram solubilizadas a 1mg/mL em água MilliQ a fim de se preparar o filtrado. A MQ e a AQ foram solubilizados a uma 1mg/mL, em Metanol (Metanol Absoluto, Biolab, BR). Após esse procedimento, realizou-se uma diluição das drogas de 1:4 em meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina e Gentamicina para a preparação da solução mãe. Após essa diluição, realizou-se a preparação da solução estoque, em que se diluiu o filtrado em 1:10 com meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 10% de Albumax. Para MQ e AQ foi realizada novamente uma diluição 1:10 com meio RPMI 1640 da Gibco, adicionado de bicarbonato de sódio e L-glutamato, Hepes, Bicarbonato, Hipoxantina, Gentamicina e 10% de Albumax. A tabela com a concentração das drogas em cada procedimento de diluição encontrase e a seguir (tabela 3). Tabela 3: Concentração de cada droga em cada diluíção Diluição CQ QN MQ AQ Peso molecular 515,9g 361g 414,77g 464,8g [ ] no filtrado 1mg/mL 1938 µm 2770 µm 2410,9 µm 2151 µm [ ] na solução mãe 4x 484,5 µm 692,5 µm 692,74 µm 537,75 µm [ ] na solução estoque 1 10x 48,45 µm 69,25 µm 60,27 µm 53,77 µm [ ] na solução estoque 2 10x NR NR 6,027 µm 5,377 µm NR não realizado. [ ] - concentração

60 Preparo das placas de microcultura Após a preparação da solução estoque dos antimaláricos, as placas de 96 poços foram preparadas com a droga em duplicata e o sangue parasitado do paciente. A solução estoque do antimalárico foi adicionada nos primeiros poços (poços A) em duplicata e a droga foi diluída em 1:3 em cada poço seguinte (B, C, D, E, F e G) a fim de se obter diluições seriadas dos antimaláricos. A concentração final variou de 6,64 a 4845 nm para Cloroquina, de 9,49 a 6925 nm para Quinina, de 0,826 a 602,7 nm para Mefloquina e de 0,736 a 537 nm para Amodiaquina. A última fileira de poços (H) foi reservada para o controle do crescimento do parasito, não possuindo, assim, adição de qualquer um dos fármacos. Após a adição dos antimaláricos foi adicionada em cada poço as suspensões de hemácias preparadas anteriormente (parasitemia de 1% e hemotócrito de 1,5%), inclusive na última fileira de poços. As placas foram incubadas por 48 horas em microaerofilia a 37 C. A HXA foi utilizada para estimar o crescimento do parasito. Para tanto, 50 µl de HXA foi adicionado em cada poço, 24 horas após o início do experimento. Ao final de 48 horas, a placa foi congelada a 20 C para a lise celular. Após a transferência dos parasitos para um filtro de fibra de vidro utilizando um coletor de células, foi determinada a quantidade de HXA incorporada no parasito com o uso do contador Liquid Cintilation Wallac Beta Plate 1205 (Perkin-Elmer). A figura 10 apresenta o desenho da placa com a concentração dos antimaláricos em cada poço. O experimento e as concentrações utilizadas foram baseados em estudos realizados anteriormente (Zalis et al., 1998; Vieira et al., 2004).

61 43 Placa de 96 poços com as concentrações e as disposições das drogas em nm Cloroquina Quinina Mefloquina Amodiaquina A SD SD 602,7 602,7 SD SD B SD SD 200,9 200,9 SD SD C 538,3 538,3 SD 769,4 769,4 SD 66,96 66,96 SD 59,66 59,66 SD D 179,4 179,4 SD 256,4 256,4 SD 22,32 22,32 SD 19,88 19,88 SD E 59,81 59,81 SD 85,49 85,49 SD 7,44 7,44 SD 6,629 6,629 SD F 19,93 19,93 SD 28,49 28,49 SD 2,48 2,48 SD 2,209 2,209 SD G 6,64 6,64 SD 9,49 9,49 SD 0,826 0,826 SD 0,736 0,736 SD H CTRL CTRL SD CTRL CTRL SD CTRL CTRL SD CTRL CTRL SD Figura 10: Acima, Placa de 96 poços com a disposição dos fármacos e suas concentrações finais em cada poço. Abaixo, direita, placa de microteste com os fármacos nas concentrações finais e o sangue do paciente. À esquerda, Placas em condições de microaerofilia na estufa a 37 C. SD: Sem droga; CTRL, controle Contagem da parasitemina e determinação do IC 50 A concentração inibitória de crescimento 50% (IC 50 ) é uma medida de efetividade do composto de inibir uma função biológica. A medida quantitativa indica o quanto da droga é necessário para inibir o crescimento biológico do parasito pela metade. Ou seja, o IC 50 corresponde à concentração que inibe 50 % do crescimento do parasito e é determinado através da curva dose-resposta obtida do experimento in vitro. Os limiares in vitro de resistência aos antimaláricos que discriminam parasitos sensíveis dos resistentes foram considerados de acordo com a literatura e seus