DISCRIMINAÇÃO DE CURVAS DE DISTRIBUIÇÃO DE MASSAS MOLARES
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- Mateus Cabral Galindo
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1 DISCRIMINAÇÃO DE CURVAS DE DISTRIUIÇÃO DE MASSAS MOLARES Rossano Gambetta 1*, Tito L. M. Alves, José C. C. S. Pinto 1 Suzano Petroquímica S.A. rossano.gambetta@suzano.com.br, Av. Ayrton Senna da Silva, 700 Mauá SP rasil, CEP ; Programa de Engenharia Química / COPPE, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Cidade Universitária, CP: 6850, Rio de Janeiro RJ, rasil tito@peq.coppe.ufr.br; pinto@peq.coppe.ufr.br Discrimination of molecular weight distributions curves Molecular weight distributions (MWD) of polymer materials constitute very often the key to understand polymerization reaction mechanisms and to control the final polymer properties. However, as MWDs are measured experimentally and are subect to perturbations, a fundamental question should be addressed: how different should two MWDs be for them to be regarded as different? In order to answer this question, statistical tools should be used. In the present work, a method is presented to allow for discrimination of MWDs based on rigorous statistical arguments. Also, it is shown the importance of replicate gel permeation chromatography (GPC) experiments, in order to evaluate the experimental variances and perform comparative analyses. The usefulness of this framework will be exemplified in a case study, where samples of biopolymers produced by Alcaligenes latus are compared before and after sample purification, in two different operational conditions, that are also, subect of discrimination. Introdução A análise de curvas de distribuição de massas molares (CDMMs) está no centro das discussões científicas desde o início do uso dos materiais poliméricos, uma vez que muitas das propriedades finais dos polímeros dependem diretamente dessas distribuições. Como as propriedades finais dos produtos são imprescindíveis para a especificação de produtos comerciais, buscando utilizar as informações das CDMMs obtidas fora de linha para inferir propriedades e interagir com processo. Procurando dessa forma melhorar a qualidade do produto, sea através da aplicação de predições da CDMM em tempo real apresentadas ao operador, ou como uma ferramenta para desenvolvimento de produtos ou processo, procurando minimizar a realização de testes em planta. [1] As CDMMs são, em geral, obtidas experimentalmente através de cromatografia por exclusão de tamanho, também conhecida como cromatografia de permeação em gel (GPC). A técnica consiste basicamente na separação de uma dada amostra de polímero por um conunto de colunas com base nos tamanhos das cadeias, seguida da quantificação da concentração de cada fração da amostra original. A quantificação pode ser feita com o auxílio das mais variadas tecnologias, como medidas de índice de refração, viscosidade ou espalhamento de luz. No entanto, apesar do uso da técnica de GPC ser muito comum, nunca foi proposto um critério formal para definir se uma CDMM é igual ou diferente a uma outra distribuição. Esse tipo de comparação é
2 muito importante quando se busca descobrir se uma condição de reação realmente modificou o produto, se uma operação unitária realizada sobre o polímero veio a modificá-lo, ou até mesmo se há uma evolução da CDMM ao longo do tempo de reação. Essa comparação é particularmente importante porque a técnica de GPC está sueita a muitas perturbações (perturbações de vazão e temperatura da fase móvel, de pureza da amostra, da qualidade das colunas, etc.), de maneira que a reprodutibilidade da técnica está usualmente na faixa de 10%, o que preudica certas comparações. Por isso, boa parte das vezes as comparações feitas e as conclusões advindas dessas comparações podem ser seriamente questionadas. Com base no que foi dito acima, no presente trabalho é proposta uma metodologia baseada em ferramentas estatísticas bem estabelecidas [] para responder de forma mais rigorosa sobre a equivalência entre duas diferentes distribuições obtidas experimentalmente. A equivalência é definida com base em testes de intervalos de confiança das médias (teste t) e das variâncias (testes F and χ ), calculadas a partir das médias e das variâncias obtidas das CDMMs avaliadas em triplicata. Fica evidente ao longo do trabalho que é necessário replicar as medidas experimentais da CDMMs sempre que possível, pois os erros obtidos ao longo das análises de GPC não são constantes nem são necessariamente os mesmos ao longo das seqüências de análises (e.g. dias diferentes de análise). A metodologia proposta é usada para fazer a comparação estatística entre as CDMMs de biopolímeros (poli((r)-3-hidróxi-butirato)) produzidos por bactéria (Alcaligenes latus), conforme originalmente apresentado por Gambetta [3]. Experimental Análise de GPC A avaliação da CDMM do polímero permite inferir as propriedades finais do polímero. É possível afirmar que diferentes CDMMs levam a diferentes propriedades finais do material. Uma vez que sea possível controlar a forma da CDMM do polímero, torna-se também possível controlar as propriedades finais do polímero. Uma das formas de obter a CDMM é através da cromatografia de permeação em gel (GPC). [4,5] No GPC, as moléculas de polímero são separadas segundo seu volume hidrodinâmico, ao passarem por um leito poroso constituído por partículas com diferentes tamanhos de poros. As quantidades separadas são medidas nesse trabalho por um detector de índice de refração, que é um detector genérico que responde a variações da maior parte dos solutos de forma confiável (embora não sea tão sensível quanto outros detectores mais específicos). [6] O detector de índice de refração é muito sensível à temperatura, de maneira que a temperatura de medição precisa ser controlada de forma precisa. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
3 As CDMMs foram obtidas a partir de um sistema composto por uma bomba de HPLC (Konic P580), operando com um fluxo de 1 ml/min e usando HFIP como fase móvel (0,01 M em TFA); um forno para colunas de HPLC (Phenomenex Thermashere TS-430) regulado em 35 o C; um detector de índice de refração diferencial (SDF RI00F); e um inetor manual (Rheodyne 775i com loop de 100 µl). O conunto de colunas de partículas de polímero phenogel (Phenomenex, com tamanho de partículas de 5 µm) era composto por uma pré-coluna (50 mm x 7,8 mm, leito linear) e quatro colunas (300 mm x 7.8 mm, com tamanhos de poros iguais a 50 Å, 10 4 Å, 10 5 Å e 10 6 Å), ideal para analisar massas molares de 100 a 1x10 7 g/mol. As curvas de calibração foram construídas usando-se soluções 0,3% (m/v) de padrões de PMMA ( M 1, 80, 1050, 050, 7630, 13500, 34500, 61500, , 51000, , e Da). As amostras foram preparadas com 1 ml do solvente em uma concentração de 0,6% (m/v). As soluções foram posteriormente filtradas (0,45 µm PTFE). A essas amostras filtradas, foram adicionados 1 ml do solvente usado para limpeza da seringa e do filtro. Uma curva de calibração típica, representando o tempo de retenção do sinal versus sua massa molar média ponderal, é apresentada na Figura 1. Uma CDMM típica (sinal versus tempo de retenção) é apresentada Figura. Os dados foram adquiridos do índice de refração do GPC, empregando o software EZchrom, também usado para construção da curva de calibração a partir das amostras de PMMA e para geração da curva de fração mássica versus massa molar a partir do sinal bruto de GPC medido no detector de índice de refração. Os tempos iniciais e finais de aquisição dos histogramas, assim como o número de fatias nos histogramas, foram mantidos iguais ao longo de todas as aquisições (sendo iguais a 5,34 min, 4,00 min e 1001 fatias, respectivamente), de forma a facilitar o trabalho posterior de comparação das CDMMs. Ao final de cada ineção no sistema GPC, foi obtida uma curva de massa versus massa molar média em massa (ou ponderal). w 7 6 y = -0,00198x 3 + 0,1715x - 5,0169x + 59,00365 R = 0,99640 log10(mw) Tempo de retenção (min) Figura 1 Curva de calibração típica do GPC, onde são apresentadas as massas molares médias ponderais dos padrões de PMMA contra seus respectivos tempos de retenção. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
4 Sinal Tempo de retenção (min) Figura Sinal típico de uma corrida de GPC obtido diretamente do software de aquisição de dados. Comparação entre CDMMs Propõe-se aqui uma metodologia de comparação de CDMMs. A comparação entre as CDMMs baseou-se nos cálculos dos intervalos de confiança das médias e variâncias, fornecidos pelos testes t e χ. [] Como todos os cromatogramas foram construídos com os mesmos intervalos de discretização (fatias do histograma), uma média e uma variância podem ser associadas a cada valor medido. Conseqüentemente é possível construir intervalos de confiança para a média com um determinado grau de confiança. Os intervalos de confiança, obtidos para cada fatia do histograma, podem ser utilizados para comparar duas diferentes CDMMs. Isso torna possível saber se uma determinada fatia do histograma de uma CDMM é equivalente ou não à fatia observada em outra CDMM. O teste t usado para estimar o intervalo de confiança das médias para uma dada fatia da CDMM (µ ), com um intervalo de confiança α (em %), é dado pela Equação 1 [] onde X t ( ) ( ) ( ). t α 100 α ; n 1 ( 1 ; n ) 00 X 00 < 1 + n s. s µ (1) n X é a média amostral, s é o desvio-padrão amostral, n é o número de amostras e t ( P ; fd ) é o valor tabelado da distribuição-t com probabilidade P e fd graus de liberdade (número de amostras menos um). O teste χ pode ser usado para estimar o intervalo de confiança das variâncias para uma dada fatia da CDMM ( σ ), com coeficiente de confiança α (em %). Nesse caso, o intervalo de confiança é dado pela Equação [] ( ) s. n 1 χ ( ( 100 α 1 ) ; n 1) 00 s. σ < χ ( n 1) (( 100 α ) ; n 1) 00 () Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
5 onde s é a variância amostral e ( P; fd ) χ é o valor tabelado da distribuição χ com probabilidade P e fd graus de liberdade (número de amostras menos um). O teste de equivalência entre dois pontos de duas diferentes CDMMs é realizado comparando-se os limites inferior e superior de cada um dos pontos e verificando se os intervalos se interceptam. Para que isso sea verdadeiro quando se avaliam dois intervalos A e quaisquer, devese satisfazer simultaneamente às duas condições expostas nas Equações 3 e 4 inf < sup A (3) sup > inf A (4) onde inf e sup indicam respectivamente os pontos limites inferiores e superiores de um dado intervalo. As quatro situações que podem ocorrer quando se compararam dois diferentes intervalos estão representadas na Tabela 1. Uma vez que todos os pontos das CDMMs tenham sido testados quanto a sua equivalência, é possível calcular a fração mássica equivalente entre as CDMMs, multiplicando-se os resultados dos testes lógicos de equivalência (0 para falso e 1 para verdadeiro) pela respectiva fração mássica contida na CDMM. A fração mássica resultante dos testes de equivalência das médias representa o quanto da curva de distribuição propriamente dita pode ser dita indistinta, tomando como base as médias dos pontos que compõe as curvas de distribuição comparadas. A fração resultante do teste da variância representa o quanto que as condições experimentais entre os experimentos se mantiveram, em termos dos erros experimentais, similares em cada ponto das curvas de distribuição comparadas. Tabela 1 Situações possíveis de ocorrer na comparação entre diferentes intervalos. Situação dos intervalos Teste lógico A A A A inf < sup A Verdadeiro Verdadeiro Falso Verdadeiro sup > inf A Verdadeiro Verdadeiro Verdadeiro Falso inf < sup A e sup > inf A Verdadeiro Verdadeiro Falso Falso Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
6 Resultados e Discussão A seguir é apresentado um exemplo, onde a metodologia acima exposta foi aplicada para validar um procedimento de purificação aplicado a duas amostras de biopolímero obtidas em diferentes condições de operação. No caso, diferentes fontes de carbono (glicerol e sacarose) foram usadas no cultivo da bactéria. Em seguida foi questionado se essas amostras duas amostras poderiam de fato representar diferentes polímeros. Na Tabela estão apresentadas as designações das amostras empregadas no presente estudo. Todas as curvas de GPC foram obtidas em triplicata, de forma a tornar possível a avaliação dos erros. Tabela Designação das amostras de biopolímeros empregadas ao longo do exemplo. Amostra Condição do processo A,, C Cultivo em sacarose D, E, F Cultivo em glicerol A metodologia utilizada nessa validação segue o fluxograma exposto na Figura 3. As triplicatas originadas em cada um dos cultivos tiveram sua equivalência testada, de forma a poder afirmar que o procedimento de purificação é eficiente e não induz modificações nas CDMMs do material. Num segundo momento, á com as CDMMs agrupadas de acordo com sua origem (AC e DEF), buscou-se através dos testes estatísticos caracterizar se os dois grupos de CDMMs representavam polímeros iguais ou diferentes. Figura 3 Seqüência da análise dos dados. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
7 As amostragens foram realizadas num ponto onde os cultivos, em sacarose e glicerol, apresentavam um percentual de polímero acumulado de 8,8% e 3,9% respectivamente. Essas amostras, depois de processadas segundo o procedimento de purificação proposto, atingiram um grau de pureza médio de 87,1% e 88,0% respectivamente. As CDMMs das amostras purificadas foram obtidas segundo a metodologia de GPC descrita anteriormente. Na Tabela 4 são apresentadas as equivalências das médias e das variâncias calculadas para as combinações, duas a duas, das amostras A, e C, com um coeficiente de confiança de 95% e número de réplicas de 3 ( t ( 0.975;) = 4.303, χ ( 0.975;) = 7.378, χ ( 0.05;) = 0.051). Na situação exposta na Tabela 3, é possível afirmar que todas as amostras são equivalentes, sendo possível agrupá-las num único conunto de 9 medições. Tabela 3 Equivalência das médias e variâncias das CDMMs das amostras A, e C. Amostras Equivalência das médias Fração mássica Equivalência das variâncias Fração mássica A e 99,7 100,0 96, 96,6 A e C 100,0 100,0 98,5 99,1 e C 99,8 99,9 98,0 98,5 Na Tabela 5 são apresentadas as equivalências das médias e das variâncias calculadas para as combinações, duas a duas, das amostras D, E e F, com um coeficiente de confiança de 95% e número de réplicas de 3 ( t ( 0.975;) = 4.303, χ ( 0.975;) = 7.378, χ ( 0.05;) = 0.051); no entanto, um problema interessante surgiu nessa análise. Observa-se que a amostra D não é equivalente às outras duas amostras (E e F), que por sua vez se mostraram equivalentes. Além disso, pelo fato das equivalências das variâncias estarem próximas de 100%, pode-se afirmar que não ocorreram modificações ao longo do tempo no funcionamento do sistema GPC. Portanto, alguma perturbação sistemática ocorreu durante a análise da Amostra D. Na Figura 4 é possível observar a não equivalência apresentada na Tabela 4. Observe que a técnica proposta é capaz de capturar pequenas mudanças de forma de CDMM, o que é admirável. Uma vez que se chegou à conclusão que a amostra D apresentava algum desvio permanente (causado provavelmente pelo procedimento de purificação, á que a amostra D apresenta um ombro ligeiramente superior na região de baixas massas molares), optou-se por continuar a análise sem usar os dados referentes à amostra D. É importante salientar que alguns analistas ficariam tentados a considerar a Amostra D semelhante às demais, o que não é possível fazer em bases estatísticas rigorosas. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
8 Amostras Tabela 4 Equivalência das médias e variâncias das CDMMs das amostras D, E e F. Equivalência das médias Fração mássica Equivalência das variâncias D e E 8,4 69,0 98,8 98,4 D e F 85,7 76,9 98,7 98,8 E e F 100,0 100,0 99,1 98, D Limite de dois desv. pad. EF Limite de dois desv. pad. Fração mássica [-] E E E E E E+08 M w (g.mol -1 ) Figura 4 CDMMs das amostras D e EF, com seus respectivos limites de dois desvios padrões. Após agrupar as CDMMs referentes as amostras A, e C (conunto de 9 amostras) e as amostras E e F (conunto de 6 amostras), respectivamente, referentes aos cultivos em sacarose e glicerol, suas médias e variâncias foram recalculados, assim como os intervalos de confiança, com um coeficiente de confiança de 95%, e um número de réplicas iguais a 9 ( t ( 0.975;8) =.306, χ ( 0.975;8) = , χ ( 0.05;8) =.180) e 6 ( t ( 0.975;5) =.571, χ ( 0.975;5) = 1.833, χ ( 0.05;5) = 0.831). Foi então possível calcular as equivalências apresentadas na Tabela 5. Tabela 5 Equivalência das médias e variâncias das CDMMs das amostras AC e EF. Equivalência das médias Equivalência das variâncias Amostras Fração mássica Fração mássica AC e EF 6,6 8,9 0,3 0,77 Os resultados obtidos na Tabela 5, e que podem ser observados na Figura 5, mostram que as CDMMs não são equivalentes entre si, sendo então possível afirmar de forma inequívoca que a bactéria A. latus produz diferentes homopolímeros P(3H) quando exposta a diferentes fontes de Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
9 carbono. Os principais parâmetros das CDMMs apresentadas na Figura 5, índice de polidispersão e as massas molares médias mássica e numeral, podem ser vistas na Tabela 6. Fração mássica (-) Cultivo em sacarose Limite de dois desv. padr. Cultivo em glicerol Limite de dois desv. padr. Equivalência pelo teste t 1 Equivalência pelo teste t (S=1, N=0) E E E E E E+08 M w (g.mol -1 ) Figura 5 CDMMs obtidas nos cultivos em glicerol e sacarose, com seus respectivos limites de dois desvios padrões. Tabela 6 Parâmetros principais das CDMMs obtidas de sacarose e glicerol. M n (Da) M w (Da) Pd Sacarose ,7 Glicerol ,08 Na Figura 6 são apresentados os erros relativos obtidos ao longo das análises de GPC das amostras agrupadas AC e EF, onde é possível observar que o erro se mantém abaixo de 10% a maior parte do tempo. Contudo, a magnitude relativa do erro aumenta de forma pronunciada quando o sinal começa a se aproximar da linha de base Erro relativo [%] E E E E E E+08 M w [g.mol -1 ] AC EF Figura 6 Erros relativos obtidos nas análises de GPC das amostras agrupadas AC e EF. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
10 Conclusões Foi proposta uma metodologia estatística rigorosa para comparação de curvas de distribuição de massas molares de amostras poliméricas. A metodologia está baseada na obtenção de réplicas de análises de GPC e aplicação de testes t, F e χ às diferentes fatias do cromatograma. O procedimento foi aplicado a amostras de biopolímeros bacterianos, permitindo identificar de forma rigorosa que o procedimento de limpeza de uma das amostras não foi reprodutível e que os materiais produzidos a partir de diferentes fontes de carbono são distintos. Adicionalmente, foi observado que os erros de análise podem variar significativamente para as diferentes faixas de pesos moleculares, não sendo uniformes. Por ser estritamente matemático, o procedimento proposto pode ser facilmente automatizado em uma rotina de computador, de forma a tratar uma grande quantidade de dados sem a intervenção humana. Além disso, o procedimento pode ser claramente estendido a toda e qualquer situação que envolva distribuições populacionais, onde sea possível obter réplicas das análises. Referências ibliográficas 1. M. Embiruçu; E. L. Lima; J. C. Pinto. Polymer Science and Engineering 1996, 36, 4, D. M. Himmelblau; K.. ichoff, Process Analyses and Simulation: Deterministic System. John Wiley & Sons, Inc., New York, R. Gambetta, Tese de Doutorado, Coordenação dos Programas de Pós-graduação de Engenharia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, A. Peter. Int. GPC Symp. 1996, R. Gambetta; J. A. Oliveira; T. L. M. Alves; J. C. Pinto in Anais do 8 o Congresso rasileiro de Polímeros, Águas de Lindóia, D. A Skoog; F. J. Holler; T. A. Nieman, Princípios de análise instrumental. 5 a edição. ookman, São Paulo, 00. Anais do 9 o Congresso rasileiro de Polímeros
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