Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Departamento de química, Florianópolis-SC 2
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- Caio Amaro Sanches
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1 NANOPARTÍCULAS OBTIDAS A PARTIR DA PROTEÍNA ISOLADA DE SOJA (SPI) PELO MÉTODO DE COACERVAÇÃO EM ÁGUA: EFEITO DA FORÇA IÔNICA E DAS CONCENTRAÇÕES DE PROTEÍNA E SURFACTANTE. Samira J. Fayad 1 *, Betina G. Z. Ramos 2, Edson Minatti 1, Valdir Soldi 1 1 Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Departamento de química, Florianópolis-SC *samira@qmc.ufsc.br 2 Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, Departamento de ciências farmacêuticas, Florianópolis-SC Neste trabalho investigamos a obtenção de nanopartículas formadas pela SPI através da coacervação de suspensões aquosas em solução aquosa hostil. Tal método foi eficaz no preparo de partículas do biopolímero, com tamanho determinado por espalhamento de luz como sendo entre 200 a 400 nm. Investigamos o efeito de variáveis como concentração da proteína na suspensão aquosa, a concentração do surfactante Tween 80 e a força iônica na fase aquosa hostil. Os resultados preliminares são promissores, pois indicam um método eficaz e ecologicamente correto (sem solventes orgânicos) para o preparo de nanopartículas deste biopolímero. Estas partículas podem servir como matrizes para incorporação de fármacos, aditivos alimentares, fertilizantes, pesticidas e herbicidas, entre outros. Palavras-chave: Proteína Isolada de Soja, nanopartículas e espalhamento de luz. NANOPARTICLES MADE FROM SOY-BEAN PROTEIN ISOLATE BY COACERVATION IN WATER: EFFECT OF IONIC STRENGTH AND THE CONCENTRATIONS OF PROTEIN AND SURFACTANT We investigated the preparation of nanoparticles made from Soy Protein Isolate (SPI) through coacervation of SPI aqueous suspensions in hostile buffer. We succeed in obtaining particles with diameters ranging from 200 up to 400 nm using the coacervation method; we then explored the effects of SPI concentration before coacervation and the ionic strength and surfactant concentration of the hostile buffer. The preliminary results are promising and indicate a efficient and green (free of organic solvents) method to obtain nanoparticles from SPI. In addition, the observations from the emulsion/vaporization method also show that the protein can be easily crosslinked; thus, these particles may well be used as matrix for encapsulation of drugs, food additives, fertilizers, herbicides and others. Keywords: Soy Protein Isolate, nanoparticles, light scattering. Introdução Com mais de 90% de proteína, [01] a Proteína Isolada de Soja (SPI) é a forma mais refinada entre os derivados protéicos mais comuns. Encontra-se na forma de um pó de coloração creme e sabor suave, preparado a partir da fração protéica dos grãos de soja e separada dos componentes não-protéicos através de um processo de purificação baseado em sua solubilidade e reatividade química. [02,03] Após a retirada da casca e do óleo dos grãos de soja, uma farinha desengordurada é preparada, a partir da qual se obtém a SPI por meio de um processo de extração em fase aquosa que explora a variação da solubilidade da SPI em função do ph (Figura 1).
2 Figura 1. Diagrama de solubilidade para a SPI em função do ph da solução [04]. Produto praticamente livre de carboidratos e de gordura, a SPI é constituída pelas proteínas de armazenamento da soja e compreende um conjunto de macromoléculas de tamanhos e estruturas variadas. A SPI é utilizada como alternativa nutricional, funcional ou econômica em substituição a outros tipos de proteínas tradicionais em alimentos como bebidas, produtos de panificação, cereais, carne de frango, carne de gado e produtos de pescado. [05] Devido a sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, os sistemas com nanopartículas de biopolímeros vêm sendo desenvolvidos visando inúmeras aplicações para fins terapêuticos e de liberação de fertilizantes e inseticidas. [06] Existem vários métodos relatados na literatura para a preparação de nanopartículas de biopolímeros. Independente do método de preparação os produtos são obtidos como suspensões coloidais aquosas. Todavia, durante o tempo de armazenamento, pode ocorrer a agregação das partículas no meio, procedendo na formação de precipitados, além de problemas de estabilidade química do biopolímero ou das demais matérias-primas presentes no meio. Consequentemente, a limitada estabilidade físico-química em função do tempo gera uma limitação para aplicações industriais das suspensões aquosas de nanopartículas. [06] O método de coacervação envolve a separação do material polimérico da sua solução através de alterações das características do meio que causam a dessolvatação da macromolécula, por exemplo, mudança de ph, aquecimento, adição de um não solvente, sal ou outro polímero incompatível ou alteração da carga do polímero envolvido. [07] Apesar de ser uma técnica muito utilizada, a coacervação é frequentemente prejudicada por resíduos de solventes e agentes coacervantes encontrados nas esferas. Na literatura, estão disponíveis muitos artigos de revisão referentes à nanopartículas direcionados principalmente aos diferentes métodos de preparação e às potencialidades terapêuticas destes sistemas. Entretanto, não são encontrados artigos direcionados especificamente à caracterização físico-química e à proposição das formas de associação de fármacos a nanocápsulas
3 e nanoesferas formadas por SPI. Este trabalho tem como objetivo investigar as metodologias de emulsificação/evaporação e coacervação para a obtenção de nanopartículas formadas pela SPI e efeitos de algumas variáveis nos métodos de preparação e nas características físico-químicas das partículas obtidas. Experimental Materiais A SPI (Supro 500E) utilizada foi fornecida pela The Solae Company, Brasil. O óleo mineral e o surfactante Tween 80 (monooleato de sorbitano etoxilado) foram adquiridos da VETEC Química Fina LTDA RJ, Brasil. O ácido acético glacial e o acetato de sódio usados para preparar a solução tampão e hidróxido de sódio usado para ajustar o ph das soluções poliméricas foram adquiridos da empresa Nuclear. Partículas preparadas pela técnica de coacervação Inicialmente, foram preparadas soluções aquosas de SPI (solução 1) em diferentes concentrações 0,1% a % (m/v) com ph ajustado para 10 através da adição de NaOH(aq) 1,5 mol L -1. Posterior ao ajuste de ph, as soluções permaneceram 24 horas sob agitação magnética a temperatura ambiente. Paralelamente, seguiu-se a preparação da solução tampão hostil, i.e., a solução com ph onde ocorre precipitação da SPI, conforme mostrado na Figura 1, e é usada para o processo de coacervação. A solução tampão ácido acético/acetato de sódio foi preparada com o ph ajustado para 5 pela adição de NaOH(aq) 1,5 mol L -1. Com esta solução tampão duas soluções de Tween 80 foram preparadas, respectivamente com % e 1,0% (m/m) de surfactante. Conforme o esquema da figura 2, depois de prontas as soluções, para cada formulação, 85 ml da solução tampão hostil foram submetidos a um dispersor (Quimis) sob uma velocidade de agitação de 6000 rpm e 3mL da solução 1 foram então adicionados por gotejamento. A mistura final permaneceu sob agitação por 1 minuto. Figura 2. Ilustração do método de coacervação.
4 Determinação de distribuição de tamanho das partículas A determinação da distribuição de tamanho das nanopartículas foi realizada a 25 C empregando-se um equipamento Zetasizer Nano Malvern. As medidas de tamanho e distribuição de tamanho das partículas dispersas foram feitas através da técnica de espalhamento de luz dinâmico (DLS). Esta técnica baseia-se no princípio de que uma partícula em suspensão sofre movimento Browniano e seu tamanho pode ser obtido usando a relação de Stokes-Einstein, que relaciona o coeficiente de difusão e o raio hidrodinâmico da partícula. [08] Os valores do índice de polidispersidade (PDI) variam de 0, para uma amostra idealmente monodispersa, a 1, para uma amostra com uma distribuição de tamanho bastante larga. O PDI foi determinado através de medidas de DLS no ângulo de 173 e deriva da fórmula PDI 2 σ =, 2 Ð H onde σ é o desvio médio da distribuição de tamanho (em nm) e Đ H é o diâmetro médio (em nm) da partícula. [08] Determinação do potencial Zeta das partículas As medidas de potencial Zeta das nanopartículas foram realizadas a 25 C empregando-se um equipamento Zetasizer Nano Malvern. As medidas de potencial Zeta refletem o potencial elétrico da superfície das nanopartículas, o qual é influenciado pelas mudanças na interface com o meio dispersante, em razão da dissociação de grupos funcionais na superfície da partícula ou da adsorção de espécies iônicas presentes no meio aquoso da dispersão. [09] O potencial Zeta é medido aplicando-se um campo elétrico através da dispersão. As partículas que possuem um potencial Zeta migram para o eletrodo de carga oposta com uma velocidade proporcional ao valor de seu potencial. Esta velocidade é medida usando a técnica Laser Doppler Anemometry. [08] Resultados e Discussão Obtenção e caracterização de nanopartículas obtidas pelo método de coacervação Obtivemos nanopartículas de SPI através do método de coacervação. Investigamos a distribuição de tamanho e potencial de superfície das partículas em função de algumas variáveis no método de preparação, tal como descrito a seguir. 1. Análise da distribuição de tamanho das nanopartículas 1. a)efeito da força iônica da solução tampão hostil
5 A solução que promove a coacervação é a solução tampão hostil, que consiste em uma solução de surfactante tamponada em ph = 5. A força iônica do tampão pode ser ajustada e apresenta grande efeito no tamanho das partículas, como ilustrado na Figura 3(a). A figura indica que o diâmetro médio das partículas é menor quando a força iônica é pequena; quando I=20mM as partículas passam a ter dimensões micrométricas. A figura também indica que a concentração de SPI(aq) na Solução 1 não tem um efeito muito pronunciado no tamanho das partículas, ao menos na faixa estudada. O aumento da força iônica também leva ao aumento da polidispersidade em tamanho das partículas, como visto na Figura 3(b). As partículas obtidas com I=1mM são as menos polidispersas, enquanto que o índice de polidispersidade chega a 1 para as partículas preparadas com I=20mM. Estas observações sugerem que o aumento de força iônica promove a coalescência das partículas menores, produzindo um sistema mais polidisperso e com maior população de partículas maiores. A explicação para este comportamento pode ser encontrada se considerarmos a teoria DLVO para o mecanismo de estabilidade de dispersões coloidais. De acordo com este modelo, o potencial total de interação entre duas partículas em uma dispersão é o somatório do potencial de atração (Equação 1), que tem origem em forças atrativas do tipo van der Waals, e do potencial de repulsão, que está relacionado à presença de carga na superfície das partículas. [10] A magnitude do potencial de repulsão V R é determinante na estabilidade de uma partícula. Este potencial (Equação 2) é uma função do raio a da partícula, do potencial de superfície Ψ 0 e da distância H entre as partículas. O fator exponencial κ é o recíproco do comprimento de Debye κ -1, que reflete a largura da dupla camada elétrica difusa de íons que orbita a partícula. Quanto maior for κ -1, maior será a barreira de repulsão elétrica para o processo de coalescência de duas partículas. Entretanto, como demonstrado na Equação 3, o comprimento de Debye diminui com o aumento da força iônica. [10,11] Em outras palavras, o aumento da força iônica promove a contração da dupla camada elétrica difusa e, consequentemente, diminui o potencial de repulsão V R. Isto facilita a coalescência das partículas, justificando o tamanho e a alta polidispersidade nas formulações com I=20mM. V = V + V (Eq. 1) T A R V R 2 2 εra Ψ0 κh = e (Eq. 2) R εrε0 = 2 (Eq.3) κ 2πF I
6 Polidispersidade 0,9 0,6 0,3 0,1 0,2 0,3 0,4 (b) 0, I/mM ,1 0,2 0,3 0,4 (a) D/nm I/mM Figura 3. (a) Diâmetro e (b) polidispersidade em função da força iônica da solução tampão hostil com % (m/m) de Tween b)efeito da concentração de surfactante na solução tampão hostil Outra variável de ajuste no preparo das emulsões foi a concentração do surfactante Tween 80 na solução tampão hostil (na força iônica I=1mM). A Figura 4(a) apresenta os valores do diâmetro médio das partículas de SPI obtidas em diferentes [SPI(aq)], para dois sistemas com diferentes concentrações do surfactante % e 1,0% (m/m) de Tween 80 na solução tampão hostil. A Figura 4(b) apresenta a polidispersidade em tamanho dos mesmos sistemas. Embora o efeito do aumento da concentração de surfactante não seja muito pronunciado, leva à diminuição do tamanho médio e da polidispersidade nas formulações com até 0,2% SPI e ao aumento do tamanho e da polidispersidade nas formulações mais concentradas. Este comportamento é justificado pelo seguinte mecanismo: as moléculas de Tween são adsorvidas na superfície das partículas formadas durante a coacervação. Quando a concentração de proteína é pequena, as moléculas de Tween atuam como agentes de estabilização estérica, prevenindo a coalescência. O excesso de Tween na fase aquosa, não
7 adsorvido na região interfacial, atua como um agente de estabilização por depleção. Ambos processos levam a partículas menores. Se a concentração de SPI for maior a população de partículas aumenta e, durante a coacervação, uma mesma molécula de Tween 80 pode ser adsorvida nas superfícies de duas ou mais partículas, levando a um processo de floculação-coagulação via ponte de Tween 80. Ainda, o aumento da concentração de SPI leva ao aumento da área superficial para adsorção de surfactante; isto diminui a estabilização por depleção, pois há menos moléculas de Tween dissolvidas na fase aquosa. Ambos os processos levam a um aumento do tamanho das partículas. 400 [Tween 80]/% 1,0 (a) 0,4 [Tween 80]/% 1,0 (b) D/nm 200 Polidispersidade 0,3 0,2 0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,1 0,2 0,3 0,4 Figura 4. (a) Diâmetro e (b) polidispersidade em função da concentração de SPI na presença de diferentes concentrações de Tween 80 na solução tampão hostil. 2. Análise do potencial Zeta das partículas Uma partícula carregada atrai uma camada compacta de íons de carga oposta que são adsorvidos na superfície. Esta camada de íons é conhecida como camada de Stern e seu potencial elétrico como potencial de Stern (Ψ o ). A ação deste campo elétrico atrai uma camada difusa de íons ao redor da partícula, até a dissipação do potencial em distâncias maiores. Esta é chamada de dupla camada elétrica difusa, ou camada de Gouy-Chapman.[12] A interação entre partículas carregadas é governada predominantemente pela sobreposição das duplas camadas elétricas difusas e, portanto, do potencial de Stern. Este potencial se dissipa ao se afastar da superfície da partícula e pode ser descrito pelo modelo de Poisson Boltzmann, que dá o potencial a uma distância H do plano de Stern. [12] H ( H ) e κ 0 Ψ = Ψ (Eq. 4)
8 Entretanto, não há método experimental para a medida direta do potencial de Stern. O que se mede é o potencial elétrico na unidade eletrocinética, i.e., da partícula, dos íons e moléculas do solvente inclusos no plano de cisalhamento quando submetidos a um potencial elétrico. Este potencial eletrocinético é conhecido como potencial Zeta, ζ. Em geral, dispersões com partículas de potencial Zeta alto são consideradas estáveis, enquanto que partículas com valor menor tendem a coalescência e coagulação. 2. a)efeito da força iônica da solução tampão hostil Como as equações 3 e 4 sugerem, o aumento da força iônica promove a contração do comprimento de Debye e a diminuição do potencial Zeta. Isto foi verificado experimentalmente, tal como exibido na Figura 5. O potencial Zeta de todas as partículas é negativo, indicando que mesmo em ph = 5 a carga residual das cadeias de SPI é negativa. Observa-se ainda que, para uma mesma força iônica, o aumento da concentração de SPI leva a um aumento do potencial Zeta, indicando a formação de partículas com maior densidade de carga superficial ζ/mv -15 0,1-10 0,2 0,3-5 0, I/mM Figura 5. Potencial Zeta em função da força iônica da solução tampão hostil com % (m/m) de Tween 80. Como exibido na figura, o aumento da força iônica levou a diminuição do potencial Zeta; este fator favoreceu a coalescência das partículas e, como já exibido anteriormente, produziu partículas maiores e mais polidispersas. 2. b)efeito da concentração de surfactante na solução tampão hostil A Figura 6 mostra o efeito do aumento da concentração de proteína no potencial Zeta das partículas em soluções tampão hostil (na força iônica I=1mM) feitas com duas concentrações de surfactante Tween 80. Como visto anteriormente, o aumento da concentração de proteína leva ao aumento do potencial Zeta das partículas, devido ao aumento da quantidade de carga superficial. O efeito do aumento da concentração de surfactante é o de aumentar o potencial Zeta nas soluções com concentração de SPI <0,4%. Como já discutido, as moléculas de Tween adsorvem na
9 superfície das partículas. O impedimento estérico causado pelos segmentos das moléculas de surfactante desloca alguns íons do plano de cisalhamento e da camada de Stern, diminuindo a neutralização do potencial de superfície. Isto é observado através do aumento do potencial eletrocinético. Já em concentrações maiores de proteína o potencial Zeta medido foi ligeiramente menor quando a concentração de Tween 80 era de 1% (m/m). Neste caso, o efeito anterior pode ter sido compensado pelo aumento do diâmetro médio das partículas, tal como anteriormente demonstrado. Conforme a equação de Hückel (Equação 5), o potencial eletrocinético é diretamente proporcional à carga Q E da unidade eletrocinética e decresce com o aumento do raio a das partículas. [12] Como o aumento da concentração de surfactante levou ao aumento do tamanho das partículas obtidas com as soluções de concentrações de SPI mais alta, produziu partículas com menor potencial eletrocinético. ζ = E (Eq. 5) 4π a( εq 1+ κa ) [Tween 80]/% 1,0 ζ/mv ,1 0,2 0,3 0,4 Figura 6. Potencial Zeta em função da concentração de SPI na presença de diferentes concentrações de Tween 80 na solução tampão hostil. Conclusões O método de coacervação foi eficaz no preparo de nanopartículas de SPI com tamanho entre 200 a 400 nm. O aumento da força iônica na fase aquosa hostil levou à diminuição do potencial Zeta e ao aumento da distribuição de tamanho das partículas. O aumento da concentração do surfactante Tween 80 na fase aquosa hostil causou aumento do diâmetro médio e da polidispersidade e diminuição do potencial Zeta das partículas nas formulações com maior concentração de SPI. Já em concentrações menores de proteína, houve diminuição do tamanho e da polidispersidade e aumento do potencial Zeta com o aumento da concentração de surfactante. Na faixa estudada, a concentração de proteína não tem efeito pronunciado na distribuição de tamanho das partículas, porém, leva ao aumento do potencial Zeta das mesmas. Agradecimentos
10 CNPq, UFSC e The Solae Company. Referências Bibliográficas 1. A. Akesowan. Afr. J. Biotechnol. 2008, 7 (24), , 2. P. Lodha; A. N. Netravali. Ind. Crops Prod. 2005, 21, R. Kumar, et al. Ind. Crops Prod. 2002, 16, C. M. M. D. J. Lakemond, et al. J. Agric. Food. Chem. 2000, 48, The Solae Company. Disponível em: < Acesso em 4 fevereiro S. R. Schaffazick, et al. Quim. Nova. 2003, 26, P. J. Watts; M. C. Davies; C. D. Melia. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1990, 7, Malvern Instruments. Disponível em: < Zeta_potential/Zeta_potential_LDE.htm>. Acesso em 15 maio Z. Dong; Q. Wang; Y. Du. J. Membr. Sci. 2006, 280, D. Myers. Surfaces, Interfaces, and Colloids: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Ed.; New York, D. J. Shaw. Introduction to Colloid and Surface Chemistry, Butterworth-Heinemann, Ed.; M. J. Schick; A. T. Hubbard. Emulsions And Emulsion Stability, Taylor & Francis Group, LLC, Ed.; Santa Barbara, 2006.
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