Produção de enzimas. EQB4383 Enzimologia Industrial. M.A.Z. Coelho

Transcrição

1 Produção de enzimas

2 ENZIMA proteína enzimática + quantidades variáveis de matéria contaminante proteica e não-proteica + preservantes. Matérias primas para Obtenção Enzimas: células microbianas células animais e vegetais Etapas Processo Produção de Enzimas Obtenção: fermentação, produção agro-pecuária ou cultivo in-vitro Recuperação: separação, extração e concentração; Purificação: pode incluir várias etapas ou não existir; Formulação: normalização do produto enzimático.

3 ESQUEMA GERAL DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS- (---) enzima intracelular, ( ) enzima extracelular

4 PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE TECIDOS As enzimas de tecidos requerem um processo de ruptura celular para a sua recuperação. A extração, é uma operação simples e de baixa incidência no custo de produção. As células animais, desprovidas de parede celular podem ser facilmente extraídas por esforços moderados de corte ou por choque osmótico. As células vegetais, providas de uma rígida parede celular de natureza celulósica, sensíveis aos esforços de corte, extraídas em moinhos convencionais. A produção em grande escala é pouco factível, dada a complexidade do sistema e ao alto custo dos meios de cultivo requeridos. Avanços significativos no desenho de equipamentos para a propagação de células e nos métodos de imobilização.

5 Enzimas Produzidas de Origem Animal Exemplos: Pancreatina, tripsina, pepsina, renina, quimiotripsina e catalase. Metodologia Geral de Produção Extraídas em solução aquosa antes de serem processadas. Tecidos são secos e triturados em partículas pequenas e finas Tecidos ainda úmidos são desintegrados (moinhos ou homogeneizadores) Materiais são então, extraídos com água ou solução tampão adequada Resíduos insolúveis removidos por filtração ou centrifugação (terra diatomácea é adicionada como auxiliar de filtração do extrato ou da solução de enzima bruta).

6 Pancreatina pâncreas de porco e apresenta atividade amilolítica, proteolítica e lipolítica. pâncreas de boi ou de carneiro que não contém quase amilase. Pâncreas frescos ou congelados são triturados com tecido duodenal Tripsina presente no duodeno inicia a ativação das enzimas A massa é seca em secadores à vácuo e depois desengordurada com extração com éter de petróleo Solvente eliminado com secagem dos flocos em secadores á vácuo e depois moídos obtendo-se um pó fino e peneirado

7 Renina Suco gástrico do quarto estômago do bezerro alimentado por leite, pois ao contrário poderá estar contaminada por pepsina. Contém um precursor inativo (pró-renina).

8 Pepsina mucosa do estômago de porco Mucosa é fatiada e misturada com ácido clorídrico ou fosfórico ph 2,0 por 16h a temperatura ambiente Eleva-se temperatura C/1 hora (pepsinogênio é levado à pepsina) Tecido não digerido é filtrado, e este é então seco em secador a vácuo a 40 C Pepsina de alta pureza é obtida através da concentração à vácuo do filtrado, resfriamento a 5-8 C e adição de etanol para atingir a concentração de 60% - Filtrada e seca a baixa temperatura

9 Catalase fígado e sangue de animais (boi e porco). Fígados são macerados submetidos a agitação em solução aquosa contendo 25% acetona a temperatura ambiente Concentração acetona aumentada 35%, massa obtida é filtrada e os sólidos descartados Mais acetona é adicionada (50%), para precipitar a catalase, recuperada através de filtração ou centrifugação. Precipitado pode ser seco ou ainda extraído em solução aquosa agitada por 1 hora removendo o material insolúvel. Solução de catalase pode ser submetida a filtração estéril e comercializada, com ou sem estabilizante (glicerol)

10 Enzimas Produzidas de Origem Vegetal Exemplos: Papaína, bromelina, ficina, malte que contém proteases, lípases, oxiredutases e hemicelulases e amilases. Produzidas em grande parte como sub-produtos da atividade agrícola. Papaína Látex do fruto verde do mamão - folhas,talos, pecíolos das flores e cascas, com exceção da raiz. Sensíveis a oxidação do ar - inativadas. Papaínas comerciais não são armazenadas por longos períodos. Extraída como suco prensado - purificada. Utilizada na clarificação da cerveja, amaciamento de carne e como auxiliar da digestão para pessoas que tem deficiência de enzimas proteolíticas.

11 Bromelina Talo e no fruto do abacaxi - menos maduros (porção mais baixa e central do talo). Ficina Látex de espécies de Fícus Obtenção é economicamente inviável, grande quantidade de matéria vegetal é necessária para a produção de pouca ficina.

12 Cardosina é uma protease diferente das demais de origem vegetal, sendo do tipo aspártico, que apresenta condições ótimas em ph ácido, por isso, é denominada de coalho vegetal. Esta presente nas flores de cardo (Cynara cardunculus). extração da enzima ocorre com a adição de água a amostra seca sob agitação, filtração com lã de vidro, centrifugação e diálise do extrato.

13 Malte Malte de cevada e outros cereais proteases e lípases hemicelulases (sintetizadas durante a germinação do grão) oxiredutases amilases (- amilase - grão durante a germinação e, - amilase - grão antes de sua germinação).

14 PRODUÇÃO DE ENZIMAS MICROBIANAS Microorganismos produtores - bactérias, os fungos filamentosos e as leveduras. Microrganismos mais importantes na produção de enzimas extracelulares industriais - gênero Bacillus e Aspergillus (80-85% do mercado de enzimas extracelulares) Maioria das enzimas comerciais são enzimas degradativas (catabolismo metabolitos primários) - produzidas de forma parcial ou totalmente dissociada do crescimento.

15 Classes de Enzimas Enzimas Constitutivas Ligadas aos aspectos centrais do metabolismo. São produzidas continuamente independente da presença ou não de substrato. Enzimas Induzidas Vão sendo sintetizadas em proporções baixas, mas significativas, até que um substrato ou um produto derivado de sua degradação induza um grande aumento na síntese enzimática. Encontram-se em maior proporção.

16 Enzima constitutiva ou induzida Mecanismo posterior de Controle Na presença de uma fonte de carbono rapidamente assimilável como a D- glicose, a síntese de muitas enzimas se encontra reprimida- Repressão por um catabólito. Organismo utiliza a glicose sem gasto de energia na síntese de enzimas úteis para degradar outras fontes de carbono mais complexas. Pode ser muito difícil deduzir se a síntese transitória de uma enzima é o resultado de uma indução, de uma repressão ou da combinação de ambos os mecanismos. A síntese de certas enzimas pode ser reprimida pela presença de compostos que contenham enxofre, nitrogênio e outros. Exemplo: síntese da proteinase extracelular de Bacillus subtilis é reprimida pela presença no meio de cultivo de certos compostos que contenham nitrogênio, como o glutamato e o aspartato.

17 Preparo do inoculo Tratamento da matéria prima Recuperação da enzima levando em conta localização (intra ou extra celular Purificação

18 Meios de Cultivo Meio sintético ou matérias primas naturais. Substâncias naturais complexas (melaços, licor de arroz, milho e outros cereais, soro de leite, hidrolisados proteícos, farinhas amiláceas e celulósicos). Os mecanismos de controle que operam sobre a síntese enzimática (indução e repressão catabólica) devem ser considerados na formulação do meio, levando em consideração a presença de indutores, no caso da produção de enzimas indutíveis, (ex: amido para amilase, uréia para urease, xilose para xilose isomerase), e a eliminação de substratos que causem inibição no caso do cultivo em batelada.

19 Cinética de produção de celulases de Trichoderma reesei em batelada, mostrando a instabilidade da fração endoglucanase.

20 CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ENZIMAS (Modelo Ludecking & Piret) Metábolitos primários = Metabólitos secundários = Intermediárias = e diferentes de 0 (-amilase de Bacillus subtilis, a glucoamilase de Aspergillus niger e a lactase de Escherichia coli) v= dp/dt = dx/dt + X associada não-associada ao ao crescimento crescimento

21 PRODUÇÃO DE ENZIMAS COM MICRORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS Produção de enzimas com microrganismos manipulados por técnicas modernas de recombinação genética - tecnologia denominada clonagem genética, clonagem molecular ou DNA recombinante. - Produzir enzimas de organismos superiores em sistemas microbianos; - Transferir a capacidade produtiva de uma cepa mais adequada do ponto de vista sanitário ou econômico; - Melhorar o nível de produção e a pureza da enzima produzida. - Principal problema de se utilizar esta técnica em produção comercial esta a nível de estabilidade genética do microrganismo.

22 Exemplo de Enzimas produzidas usando microorganismos Geneticamente modificados A renina de origem animal substituição por renina microbiana (de Mucor miehii) foi apenas parcial. Sua produção por tecnologia de DNA recombinante tem sido estudada por companhias como Celltex, Genex, Genencor e Códon - com cepas de Escherichia coli - enzima não é excretada. A Genecor reportou a produção de renina animal extracelular com cepas Aspergillus nidulans. Outros centros descrevem a produção de renina excretável com cepas de Saccharomyces e Kluyveromyces. Recentemente, a empresa holandesa Gist-Brocades introduziu no mercado renina animal produzida por cepas clonadas de Kluyveromyces marxianus.