Dalia dos Prazeres Rodrigues

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1 Perspectivas atuais e falhas no diagnostico antigênico de Salmonella spp: importância no reconhecimento dos sorovares circulantes, emergentes e exóticos Dalia dos Prazeres Rodrigues dalia@ioc.fiocruz.br A designação do gênero Salmonella adotada em 1900 por Lignières em homenagem a Daniel Salmon teve sua nomenclatura como orientação inicial dada a informações relacionadas às condições clínicas ou ao hospedeiro do qual o microrganismo era isolado. Entretanto, a diversidade inicial de sorovares que apresentavam etiologia não específica para um determinado hospedeiro, levou inicialmente a denominação do mesmo sorovar em hospedeiros distintos, em locais diferentes. A partir de 1920, um grupo de microbiologistas, liderados por Fritz Kauffmann em Copenhagen e Philip Bruce White em Londres unificaram a taxonomia, reconhecida pelo subcomitê de Salmonella da Sociedade Internacional de Microbiologia em 1933, como esquema de Kauffmann-White. A partir de então sua nomenclatura sofreu algumas modificações tendo por base a utilização de métodos clássicos e moleculares. Salmonella é o gênero de maior relevância na família Enterobacteriaceae e na atualidade este é dividido em duas espécies e seis subespécies ou subgêneros, S.enterica (subespécies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica) e S.bongori. A forma de redação, na nomenclatura atual apresenta o nome do sorovar iniciado com letra maiúscula, porém nunca itálico por ex. na subespécie enterica: Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Typhimurium, podendo ainda ser redigida de forma reduzida, Salmonella ser. Typhimurium ou Salmonella Typhimurium. Em outras subespécies são designadas por esta, seguida por sua formula antigênica, por ex. S.enterica subsp salamae ser. 50: z : e,n,x ou Salmonella sorotipo II 50: z : e,n,x. Em geral, acredita-se que Salmonella e Escherichia coli descendam de um ancestral comum a milhões de anos, durante o período terciário, em paralelo Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 1

2 com os invertebrados. E.coli e Salmonella difásica se adaptaram aos mamíferos, enquanto sorovares monofásicos permaneceram adaptados aos repteis. Em cada subespécie são reconhecidos diferentes sorovares, totalizando na atualidade 2.610, com base na caracterização de seus antígenos somáticos (O) e flagelares (H) e de acordo com a espécie e subespécie tendo a seguinte distribuição: Salmonella enterica subsp. enterica (1.547 sorovares); Salmonella enterica subsp salamae (513); Salmonella enterica subsp arizonae (100); Salmonella enterica subsp diarizonae (341); Salmonella enterica subsp houtenae (73); Salmonella enterica subsp. indica (13); Salmonella bongori (23), os quais não reconhecem a especie proposta Salmonella subterranea tendo sido a mesma inserida como sorovar da espécie bongori (Guibourdenche et al, 2010) Seu habitat natural pode ser dividido em três categorias com base na especificidade do hospedeiro e padrão clínico por ele determinado: altamente adaptadas ao homem incluindo S.Typhi e S.Paratyphi A, B e C, agentes da febre entérica; altamente adaptadas aos animais, S.Dublin (bovinos), S.Choleraesuis e S.Typhisuis (suínos), S.Pullorum e S.Gallinarum (aves), responsáveis pelo paratifo animal. A terceira categoria inclui a maioria dos sorovares que atingem o homem e animais, designadas salmonelas zoonóticas, responsáveis por doenças de transmissão alimentar, de distribuição mundial, sendo detectadas na maioria das espécies animais utilizados para consumo humano, além de animais silvestres e domésticos. A salmonelose é uma das zoonoses mais complexas em sua epidemiologia e controle, com padrões diferenciados de acordo com a região. Isto se deve a diferenças nos hábitos alimentares, práticas de elaboração de alimentos, criação de animais e padrões de higiene e saneamento. O controle das salmoneloses representa um desafio para a Saúde Pública, tendo em vista a emergência de novos sorovares e a reemergência de outros em determinadas áreas, tanto nos países emergentes quanto naqueles industrializados. O fator epidemiológico mais destacado nos animais é o estado de portador, onde a falta de sintomas e as dificuldades técnicas para sua detecção antes ou durante a inspeção dos produtos de origem animal. Considerando que a principal via de transmissão está na cadeia alimentar, sua presença em animais de produção aponta este microorganismo como o mais incidente Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 2

3 e relevante agente etiológico de enteroinfecções. Isto resulta em milhões de dólares em perdas para a indústria, particularmente de bovinos, suínos e aves, tanto para o mercado interno quanto para exportação, onde em alguns países, a rigidez na inspeção representa uma necessidade constante de qualidade. Aspectos Gerais sobre os Antígenos de Salmonella spp. Quanto ao seu perfil antigênico, como a totalidade das espécies da família Enterobacteriaceae, Salmonella apresenta um antígeno comum, também designado de antígeno de Kunin. Sua presença usualmente não é avaliada tendo em vista que não representa um critério relevante para a diferenciação entre gêneros ou espécies. Alguns sorovares produzem um antígeno de superfície ou envoltório Vi de natureza polissacaridica (Félix& Pitt), o qual apresenta sua localização espacial externa à parede celular impedindo a detecção do antígeno somático. Usualmente encontra-se presente em cepas de S.Typhi, S.Paratyphi C e S.Dublin. São termolábeis podendo ser destruídos através do aquecimento da suspensão a 100 o C/10-15 minutos. Outrossim, o antígeno de parede ou antígeno somático ou antígeno O (Ohne) apresenta especificidade. Tem composição lipopolissacaridica, são resistentes ao calor e estáveis ao tratamento com álcool. Apresentam-se constituídos de três partes: porção lipídica, responsável pela toxicidade e características pirogênicas; porção basal ou core e o polissacarídeo, que confere a especificidade das formas lisas (S). É constituído de cadeias repetitivas, cujo arranjo espacial mostra sua natureza definida, a qual, aliada ao tipo de ligação, determina a especificidade dos antígenos O. Sua síntese é codificada por cerca de 20 genes (locus rfb) É reconhecido um número elevado de fatores antigênicos somáticos (67), os quais são utilizados para a identificação sorológica. Estes fatores embora estejam intimamente relacionados, nem sempre são antigenicamente idênticos. Sua caracterização é possível somente quando as cepas se encontram em fase lisa ( S - Smooth) onde apresentam colônias com superfícies homogêneas, brilhantes, bordos regulares indicativos de antígeno O completo. A ocorrência de mutação que afete sua porção basal, ou na síntese de sua cadeia resulta na perda da especificidade Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 3

4 do antígeno. Neste caso, são designadas rugosas R (Rough) de superfície e bordos irregulares sendo impossível a recuperação ou reconhecimento de suas características originais. São autoaglutináveis em solução salina, facilmente fagocitáveis e sensíveis a ação do complemento. No procedimento laboratorial para a confirmação antigênica, a aglutinação das células bacterianas (somática ou antígeno O ) por antissoros policlonais (±7) e específicos (65), apresenta como características ser lenta, formar grânulos finos não dissociáveis pela agitação, tendo em vista que a reação ocorre pela interelação entre a parede celular das células bacterianas. Os antígenos flagelares ou antígeno H (Hauch) tem sua composição protéica, designada flagelina. As diferenças antigênicas surgem devido a variações na estrutura primária, ou conteúdo de aminoácidos das diferentes moléculas de flagelina. Tem como característica importante a termolabilidade podendo ser destruídos a 100 o C/10 minutos, bem como após ação lenta do álcool 50 o GL e resistentes à solução de formol a 0,5%. Aglutinação flagelar apresenta como característica a formação de grumos espessos que se dissociam rapidamente através de agitação. Esta ocorre em tempo mais rápido do que aglutinação somática, devido ao elevado número de flagelos existente na célula, quando comparado à aglutinação somática, tendo em vista que a ligação se faz entre as células bacterianas. O arranjo espacial e características intrínsecas ao gênero possibilitam a produção de dois tipos de flagelos distintos. Em uma população bacteriana de uma cepa de Salmonella spp, que produza dois tipos distintos de flagelo, a freqüência de variação de células que apresentam um dos tipos ou fases é na ordem de Na maioria dos isolados de Salmonella, dois genes codificam antígenos flagelares: gene flic (>50 diferentes alelos) de extremidade altamente conservada no genero e que codifica os antígenos de fase 1, e o gene fljb (±30 alelos) tambem conservado no gênero e que codifica antígenos da fase dois. Estes genes são expressos por um mecanismo de variação de fase, onde flic está presente em todas as salmonelas possuindo um homólogo em E.coli enquanto fljb está localizado em uma região do genoma exclusivo de Salmonella e presente em quatro das seis subespécies. Em Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 4

5 algumas ocasiões é possivel verificar o isolamento de cepas que se apresentam trifásicas, geneticamente descritas como possuidoras do gene flagelina, flpa, presentes em um plasmídeo. Os genes que codificam a flagelina de Salmonella spp. normalmente são altamente conservados em seus 5 'e 3', enquanto a região central é geralmente muito variável. Na prática a determinação de ambas as fases realizada por aglutinação rápida com antissoros policlonais (12 polivalentes e 85 monovalentes), muitas vezes ocorre ausencia de expressão de uma de suas fases impossibilitando a caracterização do sorovar. Esta pode ocorrer em alguns sorovares, quando sub-populações de células, cada uma possuidora de um dado antígeno ou conjunto de antígenos associado com seus flagelos, é capaz de produzir um terceiro ou quarto tipo de flagelos. Para sua identificação muitas vezes se faz necessária a imobilização de uma das fases para a caracterização da fase desconhecida, a qual é designada de "técnica de inversão de fase". O não reconhecimento desta pode resultar em erro no diagnóstico conclusivo do sorovar, dificultando muitas vezes ações de controle efetivas. Entretanto considerando-se a complexidade dos antigenos flagelares a não utilização da totalidade de antissoros monovalentes poderá levar a resultados incorretos de sua estrutura antigênica, como por ex. g,m; g,t; g,p; g,q; g,p,s; g,z 61 ; m,t. Caracterização Antigênica de Salmonella: A sorotipificação constitui uma importante ferramenta epidemiológica complementar na identificação de Salmonella permitindo determinar a prevalência/emergência ou apontar tendências de um sorovar em distintas zonas geográficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infecção e vias de transmissão. A identificação dos sorovares é definida pelo esquema de Kauffmann & White e envolve a identificação dos antígenos somáticos e flagelares. A identificação da estrutura somática é baseada no reconhecimento dos sorovares, representados por letras maiúsculas. Ex. grupo A (O:2), grupo B(O:4); grupo C 1 (O:6,7), grupo C 2 (O:6,8,20), grupo D (O:9), grupo E 1 (O:3,10), grupo E 2 (O:3,15), grupo E 4 (O:1,3,19),etc. Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 5

6 Alguns fatores identificam o grupo antigênico, por ex. O:4, O:9. Outros têm pouco ou nenhum valor discriminatório e se apresentam normalmente associados por representarem um complexo como O:12 (12 1, 12 2, 12 3 ), com O:2, O:4 e O:9 por ex. S. Paratyphi A (O:1,2,12), S.Typhimurium (O:1,4,5,12) e S.Enteritidis (O:1,9,12). Determinados antígenos surgem como conseqüência de uma modificação da estrutura, por exemplo: O:1 resulta da inserção de uma cadeia de galactose no polissacarídeo; O:5 de uma reação de acetilação da abequose, presente nas unidades repetidas do polissacarídeo responsável pela especificidade, como por ex. sorovar S.Typhimurium como O:4,12 e O:1,4,5,12. Na caracterização dos antígenos flagelares, devemos levar em conta que alguns sorovares de Salmonella dispõem de apenas uma fase flagelar, sendo designadas monofásicas: S.Enteritidis (9,12: g,m: -), S.Typhi (9,12 [Vi]:d: -); porém a grande maioria dos sorogrupos apresentam duas fases flagelares ou seja são cepas difásicas, como S.Typhimurium (1,4,5,12: i: 1,2) e S.Hadar (6,8: z 10 : e,n,x) que expressam a fase 1 (antígenos i ou z 10 ) e fase 2 (antígenos 1,2 ou e,n,x respectivamente), sendo também reconhecidas cepas desprovidas de flagelos (imóveis). Deve-se ter em consideração a ocorrência de variações fenotípicas como a variação capsular (V-W), a qual impede aglutinação somática e da variação flagelar (OH-O) a qual pode resultar na perda de uma de suas fases, sendo, na maioria das vezes, recuperadas. Entretanto a ocorrência de variação genotípica ou variação da estrutura somática (S-R), além de determinar alterações quanto à morfologia colonial, muitas vezes não perceptível, resulta na impossibilidade de caracterização antigênica conclusiva dos sorovares de Salmonella spp. No computo geral é importante considerar que na perspectiva atual a sorotipagem representa um método de tipagem essencial para o diagnostico de Salmonella. É altamente reproduzível e discriminatória se empregada corretamente, representando uma ferramenta básica para adoção de medidas efetivas de controle da salmonelose. Acredita-se que, futuramente, esta será substituída por métodos de seqüenciamento, múltiplas PCR ou ainda metodologias, com base na avaliação do DNA, que venham a surgir. Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 6

7 A utilização, na atualidade, de técnicas moleculares representa um conjunto de ferramentas complementares ao diagnóstico laboratorial, que podem ser empregadas em seu rastreamento e relevantes ferramentas para o controle deste microorganismo na cadeia de produção de alimentos. Entretanto, sua utilização exige que a caracterização antigênica tenha sido empregada de modo correto, a fim de impedir que o elevado investimento de recursos resulte em fracasso no controle de Salmonella spp. nas diferentes etapas da cadeia produtiva. Av. Brasil, 4365 Pav. Rocha Lima Manguinhos - CEP Rio de Janeiro- RJ 7