UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO GABRIELA GONÇALVES BLATT UTILIZAÇÃO DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA, EM CAMADA DELGADA E DE ALTA EFICIÊNCIA NA SEPARAÇÃO, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MONO-, DI- E TRIACILGLICERÓIS DO BIODIESEL RIO DE JANEIRO 2014

2 GABRIELA GONÇALVES BLATT UTILIZAÇÃO DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA, EM CAMADA DELGADA E DE ALTA EFICIÊNCIA NA SEPARAÇÃO, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MONO-, DI- E TRIACILGLICERÓIS DO BIODIESEL Dissertação submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências. Orientadores: Prof. Luiz Antonio d Avila, Dr. Profª. Michelle Jakeline da Cunha Rezende, Dra. RIO DE JANEIRO 2014 ii

3 FICHA CATALOGRÁFICA Blatt, Gabriela Gonçalves Utilização da cromatografia líquida em coluna, em camada delgada e de alta eficiência na separação, isolamento e identificação dos mono-, di- e triacilgliceróis do biodiesel / Gabriela Gonçalves Blatt. Rio de Janeiro, xvii, 99 f.: il. Dissertação (Mestrado em Ciências) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, Orientadores: Prof. Luiz Antonio d Avila, Dr. Profª. Michelle Jakeline da Cunha Rezende, Dra. 1. Biodiesel. 2. Cromatografia líquida em coluna. 3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. I. d Avila, L.A., Rezende, M.J.C. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Química. Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. III. Título iii

4 GABRIELA GONÇALVES BLATT UTILIZAÇÃO DA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA EM COLUNA, EM CAMADA DELGADA E DE ALTA EFICIÊNCIA NA SEPARAÇÃO, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MONO-, DI- E TRIACILGLICERÓIS DO BIODIESEL Dissertação submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências. Luiz Antonio d Avila, Dr. (EQ-UFRJ) (orientador) Michelle Jakeline da Cunha Rezende, Dra. (IQ-UFRJ) (orientadora) Luiz Fernando Leite, Dr. (EQ-UFRJ) Daniella Rodrigues Fernandes, Dra. (IQ-UFRJ) Eliane D Elia, Dra. (IQ-UFRJ) Rio de Janeiro, 01 de Abril de 2014 iv

5 Aos meus familiares e amigos que tanto me apoiaram nesta longa jornada da minha vida. v

6 Agradecimentos Agradeço, Primeiramente a Deus, por viver este momento tão especial e alcançar mais um objetivo em minha vida. À todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos, que contribuíram imensamente em minha formação, ensinando e ajudando, com paciência e dedicação. Em especial, agradeço aos professores orientadores Luiz Antonio d Avila e Michelle Jakeline da Cunha Rezende pela orientação na elaboração desta Dissertação, aos membros da banca examinadora por aceitarem o convite, à Professora Débora França de Andrade, por toda a disponibilidade e ensinamentos, à Cristiane Gimenes e ao Tiago Bim Garcia de Souza, do Laboratório de Combustíveis UFRJ, por todo o apoio e conhecimentos compartilhados. Aos meus queridos pais Fernando e Rozilene, aos meus irmãos Juliana e Frederico, ao meu noivo Gilmar e a todos os meus familiares e amigos, que torceram e rezaram muito pelo meu sucesso, me apoiando e incentivando em todos os momentos. vi

7 Blatt, Gabriela Gonçalves. Utilização da cromatografia líquida em coluna, em camada delgada e de alta eficiência na separação, isolamento e identificação dos mono-, di- e triacilgliceróis do biodiesel. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, A utilização de biodiesel como combustível para alimentar motores de ignição por compressão já é uma realidade no mundo inteiro. Os mono- (MAG), di- (DAG) e triacilgliceróis (TAG) presentes no biodiesel são provenientes da reação incompleta de transesterificação e são seus principais contaminantes. A ANP estabelece os teores máximos para o glicerol livre, glicerol total, metanol ou etanol, MAG, DAG e TAG no biodiesel e o método indicado para a separação, identificação e quantificação tem como fundamento a cromatografia gasosa (CG). A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) vem sendo apontada como alternativa à CG por apresentar vantagens como: não necessidade de derivatização dos analitos de interesse e menor tempo de análise. Nesse trabalho foi desenvolvido um método para a separação e isolamento dos principais contaminantes presentes em biodiesel de soja, milho e canola, em alta e baixa conversão, a partir da técnica de cromatografia líquida em coluna, utilizando uma coluna de vidro empacotada com fase octadecilsilano (C-18) e uma mistura de metanol e 2-propanol:n-hexano (5:4, v/v) em diferentes proporções como fase móvel. A ordem de eluição dos acilgliceróis foi: MAG, EsMAG, DAG e TAG e está relacionada com o Número de Carbono Equivalente. Foram obtidas frações puras e/ou enriquecidas nas principais classes de constituintes (MAG, EsMAG, DAG e TAG), que podem ser utilizadas como padrões para o controle da qualidade do biodiesel. As análises por CLAE foram realizadas de acordo com o método desenvolvido por ANDRADE (2011). Foi utilizada uma coluna Thermo Scientific Acclaim TM de 250 mm de comprimento por 4,6 mm de diâmetro interno, com fase C-18 de 5 μm de tamanho de partícula com 120 Å de diâmetro de poro. A fase móvel foi composta por metanol e uma mistura de 2- propanol:n-hexano (5:4, v/v). O método desenvolvido é de fácil aplicação e pode ser implementado com vistas à obtenção de padrões pelos laboratórios de controle de qualidade de biodiesel para seu próprio abastecimento. Palavras-chaves: Biodiesel, Cromatografia Líquida em Coluna, Cromatografia Líquida de Alta Eficiência vii

8 Blatt, Gabriela Gonçalves. Utilização da cromatografia líquida em coluna, em camada delgada e de alta eficiência na separação, isolamento e identificação dos mono-, di- e triacilgliceróis do biodiesel. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, The use of biodiesel as a fuel is a reality and many countries already use this biofuel in their energy systems. The mono- (MAG), di- (DAG) and triacylglycerols (TAG) present in biodiesel come from incomplete transesterification reaction and are its main contaminants. The ANP agency sets maximum limits for free glycerol, total glycerol, methanol or ethanol, MAG, DAG and TAG in biodiesel and the method of analysis is based on the gas chromatography (GC) technique. The High Performance Liquid Chromatography (HPLC) has been suggested as an alternative to GC method. HPLC technique have some advantages, such as: no need for analite derivatization and shorter analysis. In this work, a method was developed for the separation and isolation of the major contaminants in soybean, corn and rapeseed biodiesel, in high and low conversion, by liquid chromatography column using a glass column packed with octadecylsilane (C-18) phase and a mixture of methanol and 2-propanol:n-hexane (5:4, v/v) in different ratios as mobile phase. The elution order was MAG, FAME, DAG and TAG and it is related to the Number of Equivalent Carbon. Pure and/or enriched fractions of the major classes of constituents (MAG, FAME, DAG and TAG) were obtained. These fractions can be used as standards for the quality control of biodiesel. The HPLC analyzes were performed according to the method developed by ANDRADE (2011). It was used a Thermo Scientific Acclaim TM column of 250 mm length and 4.6 mm for internal diameter, with C-18 phase of 5 mm in particle size and 120 Å pore size. The mobile phase consisted of methanol and a mixture of 2 -propanol:n-hexane (5:4,v/v). The developed method is easy and can be implemented by quality control laboratories in order to obtain standards for their own supplies. Keywords: biodiesel, Liquid Column Chromatography, High Performance Liquid Chromatography viii

9 Sumário 1. Introdução Revisão bibliográfica O Biodiesel Os Óleos vegetais A Cromatografia A Cromatografia Líquida em Coluna A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) A Separação de classes lipídicas por processos cromatográficos Materiais e Métodos A Produção de biodiesel A Determinação do grau de conversão em biodiesel A Separação dos acilgliceróis por Cromatografia em Coluna A Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Analítica Resultados e Discussão Produção de biodiesel a partir de diferentes óleos vegetais e com percentuais de conversão distintos Análise dos óleos vegetais por CLAE Análise do biodiesel de soja, milho e canola por CLAE Separação dos principais constituintes do biodiesel por Cromatografia Líquida em Coluna Separação dos principais constituintes do biodiesel de soja de alta conversão Separação dos principais constituintes do biodiesel de soja de baixa conversão Separação dos principais constituintes do biodiesel de milho de alta conversão Separação dos principais constituintes do biodiesel de milho de baixa conversão Separação dos principais constituintes do biodiesel de canola de alta conversão Separação dos principais constituintes do biodiesel de canola de baixa conversão Recuperação das amostras de biodiesel após a cromatografia em coluna Análise das frações obtidas na Cromatografia Líquida em Coluna por CLAE Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de soja de alta conversão ix

10 Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de soja de baixa conversão Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de milho de alta conversão Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de milho de baixa conversão Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de canola de alta conversão Análise das frações obtidas na Cromatografia em Coluna do biodiesel de canola de baixa conversão Conclusões Perspectivas Referências x

11 Lista de Figuras Figura 1 Reação de transesterificação de triacilglicerol utilizando metanol. 3 Figura 2 Reações consecutivas da transesterificação do triacilglicerol. 4 Figura 3 Superfície da sílica e a superfície das fases estacionárias derivadas 12 da sílica. Figura 4 Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada. 18 Figura 5 Espectro de RMN 1 H do óleo de soja. 21 Figura 6 Espectro de RMN 1 H do óleo de milho. 22 Figura 7 Espectro de RMN 1 H do óleo de canola. 22 Figura 8 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de soja de alta conversão. 22 Figura 9 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de soja de baixa conversão. 23 Figura 10 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de milho de alta conversão. 23 Figura 11 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de milho de baixa conversão. 23 Figura 12 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de canola de alta conversão. 24 Figura 13 Espectro de RMN 1 H do biodiesel de canola de baixa conversão. 24 Figura 14 Cromatograma do óleo de soja. 27 Figura 15 Cromatograma do óleo de milho. 27 Figura 16 Cromatograma do óleo de canola. 28 Figura 17 Estruturas moleculares dos ésteres metílicos dos ácidos linolênico, 30 linoleico e oleico. Figura 18 Estrutura molecular do grupo octadecilsilano. 30 Figura 19 Cromatograma do biodiesel de soja de alta conversão. 31 Figura 20 Cromatograma do biodiesel de soja de baixa conversão. 31 Figura 21 Cromatograma do biodiesel de milho de alta conversão. 32 Figura 22 Cromatograma do bidiesel de milho de baixa conversão. 32 Figura 23 Cromatograma do biodiesel de canola de alta conversão. 33 Figura 24 Cromatograma do biodiesel de canola de baixa conversão. 33 Figura 25 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 35 coluna do biodiesel de soja de alta conversão por CCD. Figura 26 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 37 coluna do biodiesel de soja de baixa conversão por CCD. Figura 27 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 39 coluna do biodiesel de milho de alta conversão por CCD. xi

12 Figura 28 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 40 coluna do biodiesel de milho de baixa conversão por CCD. Figura 29 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 42 coluna do biodiesel de canola de alta conversão por CCD. Figura 30 Caracterização das frações recolhidas da cromatografia líquida em 44 coluna do biodiesel de canola de baixa conversão por CCD. Figura 31 Cromatogramas das frações 1 a 8 da cromatografia em coluna do 49 biodiesel de soja de alta conversão. Figura 32 Cromatogramas das frações 9 a 16 da cromatografia em coluna do 50 biodiesel de soja de alta conversão. Figura 33 Cromatogramas das frações 17 a 20 da cromatografia em coluna 51 do biodiesel de soja de alta conversão. Figura 34 Cromatogramas das frações 21 a 25 da cromatografia em coluna 52 do biodiesel de soja de alta conversão. Figura 35 Cromatogramas das frações 1 a 4 da cromatografia em coluna do 56 biodiesel de soja de baixa conversão. Figura 36 Cromatogramas das frações 5 a 12 da cromatografia em coluna do 57 biodiesel de soja de baixa conversão. Figura 37 Cromatogramas das frações 13 a 20 da cromatografia em coluna 58 do biodiesel de soja de baixa conversão. Figura 38 Cromatogramas das frações 21 a 26 da cromatografia em coluna 59 do biodiesel de soja de baixa conversão. Figura 39 Cromatogramas das frações 1 a 4 da cromatografia em coluna do 63 biodiesel de milho de alta conversão. Figura 40 Cromatogramas das frações 5 a 12 da cromatografia em coluna do 64 biodiesel de milho de alta conversão. Figura 41 Cromatogramas das frações 13 a 20 da cromatografia em coluna 65 do biodiesel de milho de alta conversão. Figura 42 Cromatogramas das frações 21 e 26 da cromatografia em coluna 66 do biodiesel de milho de alta conversão. Figura 43 Cromatogramas das frações 1 a 4 da cromatografia em coluna do 70 biodiesel de milho de baixa conversão. Figura 44 Cromatogramas das frações 5 a 12 da cromatografia em coluna do 71 biodiesel de milho de baixa conversão. xii

13 Figura 45 Cromatogramas das frações 13 a 20 da cromatografia em coluna 72 do biodiesel de milho de baixa conversão. Figura 46 Cromatogramas das frações 21 a 27 da cromatografia em coluna 73 do biodiesel de milho de baixa conversão. Figura 47 Cromatogramas das frações 1 a 4 da cromatografia em coluna do 78 biodiesel de canola de alta conversão. Figura 48 Cromatogramas das frações 5 a 12 da cromatografia em coluna do 79 biodiesel de canola de alta conversão. Figura 49 Cromatogramas das frações 13 a 20 da cromatografia em coluna 80 do biodiesel de canola de alta conversão. Figura 50 Cromatogramas das frações 21 a 24 da cromatografia em coluna 81 do biodiesel de canola de alta conversão. Figura 51 Cromatogramas das frações 1 a 4 da cromatografia em coluna do 85 biodiesel de canola de baixa conversão. Figura 52 Cromatogramas das frações 5 a 12 da cromatografia em coluna do 86 biodiesel de canola de baixa conversão. Figura 53 Cromatogramas das frações 13 a 20 da cromatografia em coluna 87 do biodiesel de canola de baixa conversão. Figura 54 Cromatogramas das frações 21 a 25 da cromatografia em coluna 88 do biodiesel de canola de baixa conversão. xiii

14 Lista de Tabelas Tabela 1 Composição em ácidos graxos de alguns óleos vegetais. 8 Tabela 2 Conversão em biodiesel determinada por RMN 1 H. 25 Tabela 3 Informações dos componentes identificados por CLAE. 26 Tabela 4 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 36 soja de alta conversão. Tabela 5 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 38 soja de baixa conversão. Tabela 6 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 39 milho de alta conversão. Tabela 7 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 41 milho de baixa conversão. Tabela 8 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 43 canola de alta conversão. Tabela 9 Frações obtidas na cromatografia líquida em coluna do biodiesel de 45 canola de baixa conversão. Tabela 10 Percentual de recuperação do material após a cromatografia em 47 coluna do biodiesel de soja, milho e canola de alta e baixa conversão. Tabela 11 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 53 biodiesel de soja de alta conversão. Tabela 12 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 54 em coluna do biodiesel de soja de alta conversão. Tabela 13 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 60 biodiesel de soja de baixa conversão. Tabela 14 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 61 em coluna do biodiesel de soja de baixa conversão. Tabela 15 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 67 biodiesel de milho de alta conversão. Tabela 16 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 68 em coluna do biodiesel de milho de alta conversão. Tabela 17 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 74 biodiesel de milho de baixa conversão. xiv

15 Tabela 18 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 76 em coluna do biodiesel de milho de baixa conversão. Tabela 19 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 82 biodiesel de canola de alta conversão. Tabela 20 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 83 em coluna do biodiesel de canola de alta conversão. Tabela 21 Percentual em área de cada classe para as frações analisadas do 89 biodiesel de canola de baixa conversão. Tabela 22 Percentual de cada constituinte nas frações obtidas na cromatografia 91 em coluna do biodiesel de canola de baixa conversão. xv

16 Lista de Abreviaturas e Siglas AC Alta conversão ANP Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombutíveis ASTM American Society of Testing and Materials B2 2% de biodiesel ao óleo diesel B5 5% de biodiesel ao óleo diesel BC Baixa conversão CCD Cromatografia em camada delgada CDCl3 Clorofórmio deuterado CEN Comité Européen de Normalisation CG Cromatografia Gasosa CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência C-18 Grupo octadecilsilano DAG Diacilglicerol EFS Extração em fase sólida EsAG Éster de ácido graxo EsMAG Éster metílico de ácido graxo FR Fase reversa FRNA Fase reversa não aquosa 1L 1-Monolinoleína 2L 2-Monolinoleína 1Ln 1-Monolinolenina 2Ln 2-Monolinolenina 1,2LL 1,2-Dilinoleína 1,3LL 1,3-Dilinoleína 1,2LLn 1,2-Linoleoil-linolenoil-glicerol 1,3LLn 1,3-Linoleoil-linolenoil-glicerol 1,2LnLn 1,2-Dilinolenina 1,3LnLn 1,3-Dilinolenina L Monolinoleína Ln Monolinolenina LL Dilinoleína LLn Linoleoil-linolenoil-glicerol LnLn Dilinolenina LLL Trilinoleína LLLn Dilinoleoil-linolenoil-glicerol LLnLn Dilinolenoil-linoleoil-glicerol LnLnLn Trilinolenina MAG Monoacilglicerol MeL Éster metílico do ácido linoleico MeLn Éster metílico do ácido linolênico MeO Éster metílico do ácido oleico xvi

17 NLD NC NCE 1O 2O 1,2OL 1,3OL 1,2OLn 1,3OLn 1,2OO 1,3OO O OL OLL OLn OLLn OLnLn OO OOG OOL OOLn OOO PTFE R f RMN de 1 H TAG UV VLDL Número de ligações duplas Número total de carbono Número de carbono equivalente 1-Monooleína 2-Monooleína 1,2-Oleoil-linoleoil-glicerol 1,3-Oleoil-linoleoil-glicerol 1,2-Oleoil-linolenoil-glicerol 1,3-Oleoil-linolenoil-glicerol 1,2-Dioleína 1,3-Dioleína Monooleína Oleoil-linoleoil-glicerol Dilinoleoil-oleoil-glicerol Oleoil-linolenoil-glicerol Oleoil-linoleoil-linolenoil-glicerol Dilinolenoil-oleoil-glicerol Dioleína Dioleoil-gadoleoil-glicerol Dioleoil-linoleoil-glicerol Dioleoil-linolenoil-glicerol Trioleína Politetrafluoretileno Fator de retenção Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio Triacilglicerol Ultravioleta Very low-density lipoprotein xvii

18 1. Introdução A utilização de biodiesel como combustível para alimentar motores de ignição por compressão já é uma realidade no mundo inteiro. Além de ser menos agressivo ao meio ambiente, é uma fonte estratégica de energia renovável em substituição ao óleo diesel. O biodiesel é definido pelo Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (Programa Brasileiro de Biodiesel) como um combustível obtido pela mistura, em diferentes proporções, de diesel e ésteres alquílicos de óleos vegetais ou gorduras animais (PINTO et al., 2005). O biodiesel pode formar misturas com o diesel em qualquer proporção e, portanto, pode substituir parcialmente o óleo diesel em motores a diesel, trazendo uma série de vantagens ambientais, econômicas e sociais (GUARIEIRO et al., 2008). Os mono- (MAG), di- (DAG) e triacilgliceróis (TAG) presentes no biodiesel são provenientes da reação incompleta de transesterificação e são seus principais contaminantes. Dependendo da concentração em que estão presentes no biodiesel, os acilgliceróis não reagidos podem aumentar a viscosidade do combustível e, consequentemente, reduzir a eficiência da combustão. A Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombutíveis (ANP) estabelece os teores máximos para o glicerol livre, glicerol total, metanol ou etanol, MAG, DAG e TAG no biodiesel (DE QUADROS et al., 2011). O método indicado pela ANP para determinação do glicerol livre, glicerol total, MAG, DAG e TAG é o ASTM D6584, que tem como fundamento a cromatografia gasosa (CG) (ANP, 2012). A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) vem sendo apontada como alternativa à CG por apresentar vantagens como: não necessidade de derivatização dos analitos e menor tempo de análise (LÔBO e FERREIRA, 2009). A CLAE é uma técnica de separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis (TONHI et al., 2002). A quantificação de glicerol livre, MAG, DAG e TAG, de ácidos graxos livres e de ésteres alquílicos por técnicas cromatográficas requer a utilização de padrões desses 1

19 compostos para a sustentação do método analítico empregado. A aquisição desses padrões em grau de pureza cromatográfico possui custo razoavelmente elevado. A título de exemplificação, os MAG são produzidos industrialmente a partir da glicerólise de TAG a C e catalisadores alcalinos como NaOH, KOH e Ca(OH) 2 são usados para acelerar o processo. Após 4 horas de reação, o produto resultante é uma mistura de MAG, DAG, TAG, ácidos graxos livres e seus respectivos sais (sabão). O rendimento em MAG é bastante baixo, em torno de %, e o produto é purificado por destilação, podendo alcançar concentrações de aproximadamente 90 % (DOS SANTOS e REZENDE, 2012). Esse percentual de pureza é adequado para uso dessa classe de compostos como surfactantes não-iônicos nas indústrias farmacêuticas, de alimentos e de cosméticos. No entanto, para utilização como padrão analítico uma segunda etapa de purificação é requerida. A utilização da Cromatografia Líquida em Coluna pode ser uma alternativa a ser estudada para obtenção desses padrões, com alto grau de pureza, a partir de misturas. Para isso é necessário avaliar a viabilidade técnica, ou seja, desenvolver um método capaz de realizar a separação dos constituintes, em escala de bancada e piloto e avaliar se a implementação do método é economicamente viável. Nesse contexto, o principal objetivo desse trabalho foi empregar a Cromatografia Líquida em Coluna para a separação e isolamento dos principais contaminantes presentes no biodiesel, visando à obtenção de frações enriquecidas de cada classe. A partir das frações resultantes, pretende-se avaliar o seu uso como padrões de MAG, DAG e TAG para o controle de qualidade de biodiesel. Os objetivos secundários desse trabalho foram acompanhar a separação da Cromatografia Líquida em Coluna por Cromatografia em Camada Delgada e analisar por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência as frações obtidas na Cromatografia Líquida em Coluna. 2

20 2. Revisão bibliográfica 2.1. O Biodiesel O biodiesel é constituído por ésteres alquílicos obtidos principalmente a partir da transesterificação de óleos vegetais ou gordura animal. A reação é conduzida na presença de um álcool de cadeia pequena e de um catalisador adequado. Este biocombustível também pode ser produzido a partir da esterificação direta de ácidos graxos livres. A reação de transesterificação pode ser catalisada por ácido ou base, usando processo catalítico homogêneo ou heterogêneo. A estequiometria da reação requer 3 mols de álcool e 1 mol de triacilglicerol para fornecer 3 mols dos ésteres de ácidos graxos (EsAG) e 1 mol de glicerol. O processo global compreende uma sequência de três reações consecutivas e reversíveis onde os MAG e os DAG são produtos intermediários. A Figura 1 mostra a equação geral da reação e a Figura 2 mostra as três reações consecutivas e os produtos intermediários formados. Figura 1. Reação de transesterificação de triacilglicerol utilizando metanol. Os grupos R, R e R representam as cadeias hidrocarbônicas alifáticas saturadas ou insaturadas; podendo ser iguais ou diferentes. 3

21 Figura 2. Reações consecutivas da transesterificação do triacilglicerol. Os grupos R, R e R representam as cadeias hidrocarbônicas alifáticas saturadas ou insaturadas; podendo ser iguais ou diferentes. O álcool utilizado na reação de transesterificação, em geral, é o metanol. No Brasil, o etanol de cana-de-açúcar tem um grande potencial como fonte de álcool, uma vez que pode aliar sua não toxicidade com uma disponibilidade imediata. Porém, é menos reativo do que o metanol, e há alguns problemas tecnológicos na sua utilização industrial (PINTO et a.l, 2005). A produção de biodiesel pela rota metílica é mais econômica e mais produtiva se comparada à rota etílica, em função do menor consumo de metanol (razão molar óleo:álcool), maior conversão em biodiesel e a separação espontânea de ésteres metílicos da glicerina (BRANDÃO et al., 2006 apud CARTONI, 2009). A produção de biodiesel é afetada principalmente pelo tipo de catalisador (ácido ou base), razão molar óleo:álcool, temperatura de reação e conteúdo de impurezas, geralmente ácidos graxos livres e água. 4

22 A reação empregada industrialmente utiliza comumente hidróxido de potássio ou metilato de sódio como catalisador (CARTONI, 2009). Esses catalisadores homogêneos possuem custo relativamente baixo e fornecem alto nível de conversão em pouco tempo. Por outro lado, a sua utilização na transesterificação de óleos vegetais produz emulsão em virtude da neutralização dos ácidos graxos livres e da saponificação do triacilglicerol. A formação de emulsão consome parte do catalisador, diminui o rendimento em biodiesel e dificulta as etapas de separação e purificação do biocombustível (VICENTE, MARTÍNEZ e ARACIL, 2004). Com o objetivo de minimizar os problemas associados ao processo homogêneo convencional, estudos têm sido realizados empregando sistema catalítico heterogêneo para produção de biodiesel. Esses catalisadores simplificam e economizam as etapas de tratamento do produto, podem ser facilmente separados do sistema por filtração e podem ser também reutilizados. Dentre os catalisadores reportados na literatura, estão incluídas as enzimas imobilizadas, zeólitas, resinas de troca iônica, entre outros (PINTO et al., 2005). A presença de alguns metais no biodiesel, mesmo em baixas concentrações, pode diminuir sua estabilidade oxidativa, afetar o desempenho do motor, causar problemas de corrosão e indicar possíveis contaminações por transporte ou estocagem. A presença de Na e K no biodiesel, bem como de outros elementos comumente encontrados como contaminantes nos catalisadores, como Ca e Mg, indica que o catalisador pode não ter sido eficientemente eliminado. Esses elementos possuem a habilidade de provocar a corrosão dos motores. Além disso, a presença no biodiesel de elementos como Cu, Fe e Mn, pode indicar contaminações decorrentes do desgaste dos equipamentos utilizados na produção, transporte e armazenamento do combustível ou mesmo da matéria-prima (LYRA et al., 2010 apud RAINONE, 2011). Foi lançado no Brasil, em 2004, o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel. A Lei n , de 13 de Janeiro de 2005, introduziu o biodiesel na matriz energética brasileira, fixando um percentual mínimo de 2 % em volume de biodiesel (B2) no óleo diesel comercializado até 2008 e de 5 % (B5) até A Resolução ANP n 7 de 19 de março de 2008 antecipou a adição de 5 % de biodiesel ao óleo diesel para 1 de janeiro de 2010 (ANP, 2008). 5

23 Para garantir a qualidade do biodiesel é necessário estabelecer padrões de qualidade, fixando teores limites dos contaminantes que não venham prejudicar a qualidade das emissões da queima, bem como o desempenho, a integridade do motor e a segurança no transporte e manuseio. Devem ser monitoradas também possíveis degradações do produto durante o processo de estocagem e transporte (LÔBO e FERREIRA, 2009). A qualidade do biodiesel pode sofrer alteração de acordo com a estrutura química dos seus ésteres constituintes; ou devido à presença de contaminantes provenientes da matéria-prima, do processo de produção ou formados durante a estocagem do biodiesel. A estrutura química dos ésteres pode variar no tamanho da cadeia carbônica e na quantidade e posição de insaturações. Dependendo da eficiência do processo de produção do biodiesel, podem estar presentes em maior ou menor quantidade: glicerol livre, acilgliceróis não reagidos, sabão, álcool residual, resíduo de catalisador e água. A absorção de umidade e os processos de degradação oxidativa durante o armazenamento do biodiesel contribuem para a presença de água, peróxidos e ácidos carboxílicos de baixa massa molecular (LÔBO e FERREIRA, 2009). O glicerol é um co-produto da reação de transesterificação de óleos e gorduras. A determinação do glicerol residual serve como parâmetro para avaliar a eficiência do processo de purificação do biodiesel. Altas concentrações de glicerol no biodiesel provocam problemas de armazenamento, formação de depósitos, entupimento dos bicos injetores do motor e emissão de aldeídos. O glicerol combinado, que inclui MAG, DAG e TAG, é proveniente da reação incompleta dos acilgliceróis, e pode ser utilizado para avaliar a eficiência da conversão de óleos e gorduras em biodiesel. Dependendo da concentração em que podem estar presentes no biodiesel, os acilgliceróis não reagidos podem aumentar a viscosidade do combustível e, consequentemente, reduzir a eficiência da combustão (LÔBO e FERREIRA, 2009). O padrão de qualidade americano é normatizado pela ASTM (American Society of Testing and Materials), através da norma ASTM D6751, enquanto o padrão adotado pela União Europeia é feito através da norma EN do CEN (Comité Européen de Normalisation). Ambas são utilizadas como referência ou base para outros padrões de qualidade. As normas européia e americana utilizam a Cromatografia Gasosa (CG) para 6

24 a determinação de glicerol livre e de acilgliceróis não reagidos em biodiesel (LÔBO e FERREIRA, 2009). A Resolução ANP n 14 de 11 de maio de 2012 estabelece para o biodiesel o teor mínimo de ésteres (96,5 % em massa) e os teores máximos de glicerol livre (0,02 % em massa), glicerol total (0,25 % em massa), MAG (0,80 % em massa), DAG (0,20 % em massa), TAG (0,20 % em massa) e metanol/etanol (0,20 % em massa). O método indicado pela ANP para determinação do glicerol livre, glicerol total, MAG, DAG e TAG é o ASTM D6584, que tem como fundamento a CG (ANP, 2012). Para a análise de biodiesel, diferentes métodos cromatográficos foram propostos. Foram realizadas comparações entre técnicas cromatográficas, uso de derivatizantes e entre sistemas de detecção. As técnicas cromatográficas propostas foram a cromatografia em camada delgada com detecção por ionização em chama (utilizada para a determinação de ésteres metílicos, MAG, DAG e TAG, porém com baixa precisão, sensibilidade à umidade e alto custo do equipamento), a CG em altas temperaturas (utilizada para a análise de ésteres metílicos, MAG, DAG e TAG na mesma corrida) e a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) (LÔBO e FERREIRA, 2009). FOGLIA et al. (2004) compararam o uso da CLAE e da CG na análise de gliceróis em biodiesel. Não foram encontradas diferenças significativas entre os resultados obtidos, porém os autores apontaram algumas desvantagens quanto à utilização da CG para análise de gliceróis em biodiesel. Entre as desvantagens estão a necessidade de derivatização (o que torna a CG mais limitada no monitoramento do processo de transesterificação), a necessidade de uso de padrões internos de gliceróis, a não especiação de alquilésteres e de gliceróis residuais, o uso de diferentes padrões em função da matéria-prima empregada na produção de biodiesel e a limitação na determinação dos alquilésteres. A CLAE vem sendo apontada como alternativa por apresentar vantagens como: não necessita de derivatização, possui menor tempo de análise e pronta quantificação de alquilésteres, ácidos graxos livres, TAG, 1,2- e 1,3-DAG, 1- e 2-MAG, o que permite seu emprego no monitoramento da reação de transesterificação (LÔBO e FERREIRA, 2009). 7

25 2.1.1.Os Óleos vegetais Os óleos vegetais são predominantemente compostos por triacilgliceróis com uma pequena quantidade de outros componentes (2 a 5 %). Os triacilgliceróis são compostos de uma molécula de glicerol unida a três ácidos graxos por uma ligação éster. O tipo e a concentração de ácidos graxos variam de acordo com o óleo vegetal (KLOPROGGE, DUONG e FROST, 2005). A Tabela 1 mostra a composição em ácidos graxos de alguns óleos vegetais (PINTO et al., 2005). Tabela 1. Composição em ácidos graxos de alguns óleos vegetais. Óleo Vegetal (xx:y) Palmítico 16:0 Esteárico 18:0 Palmitoleico 16:1 Oleico 18:1 Linoleico 18:2 Ricínico 12-OH-oleico Outros ácidos Coco 5,0 3,0-6, ,0 Oliva 14, ,4 10,0 - - Algodão 28,6 0,9 0,1 13,0 57,2-0,2 Milho 6,0 2,0-44,0 48,0 - - Soja 11,0 2,0-20,0 64,0-3,0 Colza 3,5 0,9 0,1 54,1 22,3-9,1 Girassol 6,4 2,9 0,1 17,7 72,8-0,1 Mamona - 3,0 3,0 3,0 1,2 89,5 0,3 Linhaça 6,1 4,9-18,6 14,5-55,9 xx é o número de átomos de carbono e y é o número de insaturações (PINTO et al., 2005) A Cromatografia A cromatografia é um método de separação. A técnica está baseada na distribuição dos componentes de uma mistura, em virtude de suas diferentes interações intermoleculares, entre duas fases, uma fase móvel e uma fase estacionária. A distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um processo de equilíbrio dinâmico e as moléculas dos analitos ora estão retidas na fase estacionária ora deslocando-se com a fase móvel (AQUINO NETO e NUNES, 2003). A grande 8

26 variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias torna a cromatografia uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação (DEGANI, CASS e VIEIRA, 1998). A separação entre dois ou mais componentes resulta da diferença de distribuição entre as duas fases. Quanto mais fortemente um componente interage com a fase estacionária, mais alta é a porcentagem das moléculas desse componente que ficam retidas, provocando um retardamento na eluição das mesmas. O componente menos retido na fase estacionária tem uma porcentagem mais alta de moléculas na fase móvel. O conjunto das moléculas dos componentes que interagem menos com a fase estacionária se move através do sistema na direção do fluxo, a uma velocidade mais alta que o outro, resultando em uma eluição dos componentes em regiões separadas (bandas) da fase estacionária (AQUINO NETO e NUNES, 2003). Quando a fase estacionária apresenta característica mais polar que a fase móvel, é chamada de cromatografia em fase normal. Quando a fase estacionária apresenta característica mais apolar que a fase móvel, é chamada de cromatografia em fase reversa (PAVIA et al., 2009) A Cromatografia Líquida em Coluna A cromatografia líquida abrange uma diversidade de técnicas de separação, todas com o envolvimento de uma fase móvel líquida. Na cromatografia líquida em coluna, a fase estacionária é constituída por partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos geralmente de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior (DEGANI, CASS e VIEIRA, 1998). As interações intermoleculares entre os solutos e a fase estacionária são responsáveis pela retenção dos analitos na coluna cromatográfica. A diferença na magnitude dessas interações determina a resolução e, portanto, a separação dos solutos individuais. As forças de interação intermolecular responsáveis pela distribuição dos componentes de uma amostra entre as fases móvel e estacionária são (AQUINO NETO e NUNES, 2003, ROCHA, 2001): 9

27 a) Forças de dispersão de London: ocorre nas regiões hidrocarbônicas das moléculas (regiões apolares), são fracas e de pequeno alcance. Uma molécula perturba a densidade eletrônica da outra, fazendo aparecer dipolos momentâneos que se orientam e originam esta interação fraca; b) Interações de dipolo-dipolo induzido: uma molécula que contenha um dipolo permanente induz um dipolo atrativo numa molécula apolar; c) Interações de dipolo-dipolo: orientação atrativa de dipolos presentes em moléculas próximas. As moléculas em movimento vão modificando sua posição espacial e mesmo conformacional, para maximizar a atração mútua; d) Ligações de hidrogênio (pontes de hidrogênio): atração dipolar específica de um átomo de hidrogênio ligado a um átomo mais eletronegativo (O, N, S) e um átomo eletronegativo; e) Interação iônica: interação eletrostática forte entre íons de cargas opostas; f) Interação complexante: geralmente associada à interação das moléculas de interesse com uma fase estacionária que contém um grupo capaz de formar quelatos. O mecanismo de separação da cromatografia líquida em coluna se baseia na competição que existe entre moléculas do analito e moléculas da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície da fase estacionária. Para que a molécula do analito possa ser adsorvida na fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da superfície. Se a fase estacionária possui uma superfície polar, grupos apolares terão pouca afinidade por essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel; por isso, não serão retidos. Grupos funcionais polares capazes de interagir por ligações de hidrogênio terão forte afinidade pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis, por exemplo, moléculas aromáticas, irão apresentar interação dipolo-dipolo induzido com a superfície da fase estacionária e, portanto, também serão retidas; o grau de retenção dependerá da polarização de cada molécula ou grupo funcional. 10

28 Vários tipos de fase estacionária são usadas em cromatografia em coluna. A escolha da fase estacionária depende dos tipos de compostos a serem separados. A celulose, o amido e os açúcares são usados para separação de materiais polifuncionais obtidos de plantas e animais (produtos naturais), que são muito sensíveis a interações ácido-base. O silicato de magnésio é muito usado para separar açúcares acetilados, esteróides e óleos essenciais. A sílica e o florisil são relativamente brandos para a maior parte dos compostos e são usados para muitos grupos funcionais - hidrocarbonetos, álcoois, cetonas, ésteres, ácidos, azo-compostos, aminas, entre outros. A alumina ácida é utilizada para separar ácidos carboxílicos e aminoácidos e a alumina básica é utilizada para separar aminas (PAVIA et al., 2009). A sílica (óxido de silício, fórmula geral SiO 2.H 2 O) foi o material empregado nas primeiras separações cromatográficas e evoluiu ao longo dos anos devido as suas propriedades favoráveis, e hoje, com características muito mais avançadas, continua sendo o material mais apropriado para as separações cromatográficas (MALDANER, COLLINS e JARDIM, 2010). A superfície da sílica é constituída por grupos silanóis (Si-OH) e estruturas siloxano (Si-O-Si) (BRAMBILLA, 2007). A utilização de sílicas funcionalizadas com grupos orgânicos imobilizados na sua superfície tem recebido grande destaque como fase estacionária em processos de cromatografia. Atualmente, na cromatografia em fase reversa são utilizados como fase sólida os derivados da sílica: metila (-CH 3 ), octila (- C 8 H 17 ), octadecila (-C 18 H 37 ) e fenila (-C 6 H 5 ) (PAVIA et al., 2009). A superfície da sílica e a superfície das fases estacionárias derivadas da sílica são apresentadas na Figura 3. 11

29 Figura 3. Superfície da sílica e a superfície das fases estacionárias derivadas da sílica. A utilização de Cromatografia Líquida em Coluna de vidro com fase estacionária do tipo octadecilsilano (C-18) para a separação das classes constituintes do biodiesel não foi relatada na literatura A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Desde o início da cromatografia líquida, em 1950, até os dias atuais, muitos avanços foram alcançados e todos foram impulsionados pelo desenvolvimento contínuo de novas partículas de fase estacionária que fossem capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e estáveis química e mecanicamente. Nos últimos 40 anos, a CLAE tem sido a técnica analítica mais desenvolvida, difundida e empregada em laboratórios de análise de indústrias químicas e farmacêuticas, em áreas médicas e em outros campos da ciência e até em órgãos governamentais (MALDANER e JARDIM, 2009). Associada a essa expansão, na última década, o desenvolvimento da CLAE tem sido direcionado à necessidade de análises mais rápidas, porém sem o comprometimento da eficiência cromatográfica. Para isso, a redução do tamanho das partículas da fase estacionária e das colunas foi a alternativa mais atrativa, porém ficou 12

30 limitada por um período por causa da elevada pressão resultante desta concomitante redução, que não é compatível com os sistemas cromatográficos convencionais (MALDANER e JARDIM, 2009). As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para separações em escala preparativa. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10 a 25 cm e preparativas em torno de 25 a 30 cm. O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, eletroquímicos, entre outros (DEGANI, CASS e VIEIRA, 1998). O alto nível de desenvolvimento e expansão alcançado pela cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) ao longo das últimas décadas, deve-se principalmente a sua vasta aplicabilidade, que engloba o desenvolvimento de novos produtos, o controle da qualidade desses produtos e, também, as possíveis contaminações provenientes desses produtos e dos disponíveis no mercado há anos (MALDANER, COLLINS e JARDIM, 2010). A ampla aplicabilidade da CLAE-FR foi o que impulsionou as pesquisas em busca do aprimoramento desta técnica, principalmente referente ao desenvolvimento de novas fases estacionárias. As fases estacionárias empregadas em CLAE-FR consistem de uma camada orgânica apolar ligada quimicamente ou imobilizada ou apenas sorvida a um suporte na cromatografia. (MALDANER, COLLINS e JARDIM, 2010) A Separação de classes lipídicas por processos cromatográficos Hamilton e Comai, em 1984, descreveram um método para a separação de lipídeos neutros e ácidos graxos livres utilizando a extração em fase sólida (EFS) seguida da CLAE com detecção ultravioleta de baixo comprimento de onda. Na EFS, primeira etapa, a separação dos fosfolipídeos de lipídeos neutros e ácidos graxos foi realizada em cartuchos de sílica (600 mg) com 12 ml de solução de clorofórmio:ácido acético 100:1 como eluente (fase móvel), obtendo a fração 1 (onde foram eluídos os 13

31 lipídeos neutros e ácidos graxos). O segundo eluente utilizado foi 5 ml de solução de metanol:clorofórmio 2:1, obtendo a fração 2 (onde foi eluída fosfatidiletanolamina). Para obter a fração 3 foi utilizado 5 ml de solução de metanol:clorofórmio:água 2:1:0,8 (onde foi eluída fosfatidilcolina). As recuperações de ésteres de colesterol, TAG, ácidos graxos e fosfolipídeos da coluna de sílica foram superiores a 95 %. Na CLAE, a primeira fase móvel utilizada, hexano:2-propanol:ácido acético 100:0.5:0.01, resultou na separação incompleta do éster de colesterol e triacilgliceróis, mas excelentes separações de ácidos graxos e de colesterol. A segunda fase móvel, hexano:cloreto de n- butila:acetonitrila:ácido acético 90:10:1,5:0,01, resultou na completa separação das quatro classes de lipídeos. Esta fase móvel também separou individualmente triacilgliceróis e ácidos graxos com base no número de ligações duplas. Kaluzny et al.(1985) desenvolveram um método rápido para o isolamento de lipídeos com elevado rendimento e pureza. O método envolve a seletividade no isolamento dos compostos, alterando o suporte da fase sólida, o solvente ou ambos. O procedimento foi realizado utilizando três cartuchos de aminopropilsilano previamente condicionados com n-hexano. A mistura de lipídeos foi solubilizada em clorofórmio e aplicada no cartucho um. A mistura de solventes clorofórmio:2-propanol (2:1, v/v) foi adicionada no cartucho, ocorrendo a eluição de todos os lipídeos neutros da amostra (Fração I). Com a adição de uma solução 2 % ácido acético em éter dietílico ocorreu a eluição dos ácidos graxos (Fração II) e em seguida, com a adição de metanol ocorreu a eluição dos fosfolipídeos (Fração III). A fração que continha os lipídeos neutros (Fração I) foi seca sob nitrogênio, solubilizada em n-hexano e adicionada ao cartucho dois. Com a adição de n-hexano ao cartucho, os ésteres de colesterol foram eluídos (Fração IV). Um novo cartucho (cartucho três) foi posicionado abaixo do cartucho dois (utilizando um adaptador). Com a adição de 1 % éter dietílico em n-hexano e 10 % cloreto de metileno em n-hexano ocorreu a eluição dos TAG (Fração V) e com a adição de 5 % acetato de etila em n-hexano ocorreu a eluição do colesterol (Fração VI). Os cartuchos foram separados e com a adição de 15 % acetato de etila em n-hexano e clorofórmio:metanol (2:1, v/v) no cartucho dois, foram eluídos os DAG (Fração VII) e os MAG (Fração VIII), respectivamente. As recuperações foram próximas a 100 % para todas as classes lipídicas, evidenciando a eficiência do método proposto. Pinkart, Devereux e Chapman (1998) desenvolveram um método com elevado rendimento e rápida separação de classes de lipídeos encontrados em microorganismos, 14

32 que utiliza cartuchos de EFS de aminopropilsilano (500 mg, Alltech) como fase estacionária e lipídeos extraídos da cianobactéria Spirulina platensis. O método apresentou recuperação de 91 a 99 % de fosfolipídeos, TAG, DAG, MAG e ésteres. A recuperação de polihidroxialcanoatos foi de 69 % e de esteróis de 82 a 84 %. Em 1999, Holcapek et al. utilizaram a CLAE-FR para a determinação de compostos durante a produção de biodiesel a partir de óleo de colza. Os TAG individuais, DAG, MAG e ésteres metílicos dos ácidos linoleico, oleico e linolênico e ácidos graxos livres foram separados em 25 minutos, utilizando um gradiente linear combinado com fase móvel aquosa-orgânica e não-aquosa: 70 % de acetonitrila + 30 % de água em 0 minuto, 100 % de acetonitrila em 10 minutos, 50 % de acetonitrila + 50 % de 2-propanol:n-hexano (5:4, v/v) em 20 minutos, sendo mantida esta concentração por mais 5 minutos. Outro método com gradiente linear de fase móvel não-aquosa (de 100 % de metanol a 50 % de metanol + 50 % de 2-propanol:n-hexano (5:4, v/v) em 15 minutos), foi utilizado para o monitoramento da conversão de TAG de óleo de colza em ésteres metílicos de ácidos graxos e para a quantificação de TAG residuais no biodiesel final. Perona e Ruiz-Gutierrez, em 2003, desenvolveram um método para a separação, identificação e quantificação por CLAE-FR das espécies moleculares do VLDL (do inglês, very low-density lipoprotein) humano (TAG, DAG e MAG). Os lipídeos neutros foram separados por EFS e foram injetados em um sistema de CLAE-FR, com um sistema de eluição constituído por acetona e acetonitrila (gradiente inicial de 20 % de acetona + 80% de acetonitrila, aumentando para 45 % de acetona em 12 minutos e então 80 % de acetona após 60 minutos, mantido até o final da análise). O método permitiu a separação de quatro MAG, dezoito DAG e vinte e quatro TAG, incluindo a resolução de isômeros posicionais de DAG. Ruiz et al. (2004) utilizaram a EFS para a análise das principais frações lipídicas (lipídeos neutros, ácidos graxos livres e lipídeos polares) de uma amostra de músculo de porco. O método empregado foi aquele desenvolvido por Pinkart, Devereux e Chapman (1998), porém com algumas alterações. Neste método modificado, gordura intramuscular foi dissolvida em n-hexano:clorofórmio:metanol (95:3:2) e adicionada a uma coluna de 500 mg de aminopropilsilano (Varian, Harbor City, EUA), previamente condicionada com n-hexano. Os lipídeos neutros foram eluídos com 5 ml de 15

33 clorofórmio e os ácidos graxos livres com 5 ml de éter dietílico:ácido acético (98:2). Os lipídeos polares foram eluídos em duas frações distintas, com 2,5 ml de metanol:clorofórmio (6:1) e com 2,5 ml de acetato de sódio em metanol:clorofórmio (6:1). No método modificado foi evidenciada a presença quase indetectável de lipídeos polares na fração constituída pelos lipídeos neutros. Türkan e Kalay, em 2006, utilizaram a CLAE-FR com detector UV a 210 nm para monitorar a formação dos principais compostos durante a reação de transesterificação de óleo de girassol com metanol catalisada por lipase. Os TAG individuais, DAG, MAG, ácidos graxos e seus ésteres metílicos correspondentes foram separados utilizando acetonitrila:acetona como fase móvel e um processo de eluição combinando os modos isocrático e por gradiente. Foram descritos métodos para a utilização de CLAE-FR na elucidação dos mecanismos de três lipases imobilizadas na produção de biodiesel (Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM e Novozym 435). Andrade, Mazzei e d'avila, em 2011, realizaram a separação dos acilgliceróis do biodiesel B100 por EFS utilizando cartuchos aminopropilsilano e caracterizaram os principais componentes do biodiesel por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa não aquosa (CLAE-FRNA), utilizando como fase móvel metanol e 2- propanol:n-hexano (5:4, v/v) e detector UV a 205 nm. Os resultados obtidos comprovaram que a CLAE é um método eficiente para o monitoramento do processo de produção de biodiesel, sendo capaz de identificar o grau de conversão obtido na reação de transesterificação. A EFS permitiu a separação dos EsMAG e dos acilgliceróis (principais contaminantes do biodiesel). Os EsMAG e os acilgliceróis (MAG, DAG e TAG) foram eluídos utilizando n-hexano e uma mistura de clorofórmio:metanol (2:1, v/v) como solvente, respectivamente. 16

34 3. Materiais e Métodos 3.1. A Produção de biodiesel Os três óleos vegetais empregados neste trabalho foram: óleo de soja, óleo de canola e óleo de milho, todos comerciais da marca Liza (Cargill, São Paulo) e sem qualquer tipo de tratamento. O álcool utilizado para a reação de transesterificação foi o metanol anidro (obtido da TEDIA, Rio de Janeiro - Brasil). O catalisador utilizado foi o carbonato de potássio (obtido da VETEC, Rio de Janeiro - Brasil). Para o isolamento do biodiesel foi utilizado acetato de etila (obtido da TEDIA, Rio de Janeiro - Brasil), cloreto de sódio (obtido da VETEC, Rio de Janeiro - Brasil), sulfato de sódio anidro (obtido da VETEC, Rio de Janeiro - Brasil) e água destilada. A massa molecular de cada óleo foi calculada de acordo com ANDRADE (2011), sendo 876 g/mol a massa molecular do óleo de soja, 898 g/mol a massa molecular do óleo de milho e 935 g/mol a massa molecular do óleo de canola. Para a produção do biodiesel, 3 mol % do catalisador foram transferidos para o balão reacional contendo o álcool (metanol) e o óleo vegetal em uma razão molar 1:3 ou 1:9 de óleo vegetal:metanol. A mistura foi mantida à pressão ambiente, sob agitação magnética e temperatura constante durante 15 ou 90 minutos. Terminado o tempo de reação, o meio reacional foi resfriado e o produto bruto isolado por extração com solvente. A fase orgânica foi submetida a lavagens sucessivas com água destilada e tratada com sulfato de sódio anidro. O solvente foi retirado por intermédio de evaporador rotatório A Determinação do grau de conversão em biodiesel A conversão em ésteres metílicos de ácidos graxos foi calculada por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de 1 H) conforme descrito por GELBARD et al. (1995). Este método é simples e confiável quando comparado aos métodos cromatográficos usuais. Consiste na análise direta dos espectros de RMN de 1 H do produto de reação, a partir da proporção relativa de sinais específicos. O solvente 17

35 empregado na análise por RMN de 1 H foi o clorofórmio deuterado (CDCl3, = 7,27 ppm, s). O sinal relativo aos hidrogênios do grupo -CH 2 -carbonila ( = 2,3 ppm, t) é observado tanto na molécula de triacilglicerol e ácido graxo, quanto no monoacilglicerol, diacilglicerol e nos ésteres metílicos correspondentes. Entretanto, o sinal relativo aos hidrogênios do grupo -OCH 3 ( = 3,7 ppm, s) é característico dos ésteres metílicos. Desta forma, a conversão em ésteres metílicos pode ser determinada pela razão dos valores de integração destes sinais A Separação dos acilgliceróis por Cromatografia em Coluna A separação dos acilgliceróis (MAG, DAG e TAG) do biodiesel por cromatografia em coluna foi realizada em uma coluna de vidro contendo 20 cm de altura por 1,5 cm de diâmetro de fase octadecilsilano (C-18) (LiChroprep RP-18, com tamanho de partícula de m, obtido da MERCK, Darmstadt - Alemanha). A fase móvel foi composta pelos solventes metanol (A) e 2-propanol:n-hexano (5:4, v/v) (B) (ambos obtidos da TEDIA, Rio de Janeiro - Brasil) em diferentes proporções. A Figura 4 apresenta uma representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada. Figura 4: Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada. 18