Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 1 Métodos básicos em microbiologia

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1 2013 Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 1 Métodos básicos em microbiologia Escola Superior Agrária Instituto Politécnico de Coimbra Manuela Abelho

2 Índice Introdução... 2 Cultura e isolamento de microrganismos... 2 Protocolo 1.1 Preparação e distribuição de um meio de cultura sólido... 4 Protocolo 1.2 Obtenção de um inóculo por diluições decimais sucessivas... 5 Protocolo 1.3 Sementeira por incorporação... 5 Protocolo 1.4 Sementeira por espalhamento em placa... 6 Protocolo 1.5 Isolamento por riscado em placa... 6 Caracterização cultural e bioquímica de microrganismos... 6 Protocolo 1.6 Caracterização cultural de colónias... 8 Protocolo 1.7 Elaboração de um esfregaço e coloração de Gram... 8 Elaboração de um esfregaço... 8 Coloração de Gram... 8 Protocolo 1.8 Actividade da catalase (hidroperoxidase)... 9 Protocolo 1.9 Actividade da citocromo-oxidase... 9 Avaliação quantitativa de populações... 9 Protocolo 1.10 Contagem em placas Protocolo 1.11 Câmaras de contagem

3 Protocolos de Microbiologia Ambiental Parte 1 Métodos básicos em microbiologia Introdução Devido ao seu tamanho microscópico, os microrganismos são normalmente invisíveis a olho nu (a excepção ocorre quando, ao crescerem em populações com milhões de indivíduos, se tornam macroscopicamente observáveis, como acontece por exemplo com as colónias de bactérias ou de leveduras, com os micélios dos fungos filamentosos ou com algumas das suas estruturas de reprodução, como os cogumelos). Mas cada célula microbiana é microscópica e por esse motivo a microbiologia é fundamentalmente uma ciência laboratorial. A maioria dos estudos laboratoriais ocorre em culturas puras, podendo assim estudar-se várias características morfológicas ou bioquímicas da espécie em estudo. Mas na natureza, os microrganismos não se encontram isolados dos outros seres vivos; de facto, a maioria ocorre em comunidades diversas com outros microrganismos e com seres macroscópicos, quer plantas quer animais, em meio terrestre, em meio aquático e em meio aéreo. Como são microscópicas, as células microbianas encontram-se aderidas a superfícies vivas (células ou tecidos de seres macroscópicos), a superfícies orgânicas (por exemplo, matéria orgânica morta) ou a superfícies minerais. Assim, a sua observação em ambiente natural torna-se muito difícil, se não mesmo impossível na maioria dos casos. Cultura e isolamento de microrganismos Os microrganismos estão presentes na natureza em comunidades mais ou menos complexas. No entanto, para o estudo de muitas características dos microrganismos é necessário o seu isolamento em culturas puras. A cultura e o isolamento de microrganismos são duas operações básicas em microbiologia. O crescimento de comunidades microbianas em meios de cultura no laboratório, permite a obtenção de culturas puras culturas que contêm apenas um tipo de microrganismo ou de culturas mistas culturas que têm mais do que um tipo de microrganismo. O isolamento promove a separação de um microrganismo a partir de comunidades mistas. Os meios de cultura possibilitam a multiplicação de microrganismos em laboratório sob condições controladas, o que permite o seu isolamento e caracterização morfológica e bioquímica. As exigências metabólicas do mundo microbiano são muito diversificadas, pelo que os meios de cultura utilizados devem corresponder às exigências específicas do tipo de microrganismo que se quer cultivar. Em relação à sua composição química, os meios de cultura quimicamente complexos permitem a multiplicação da maioria dos microrganismos heterotróficos. Já em relação ao seu estado físico, os meios de cultura sólidos permitem não só a multiplicação, mas também o isolamento de microrganismos, de forma a obter culturas puras. As culturas puras podem ser obtidas através de vários métodos e visam o desenvolvimento de uma população a partir de uma única célula inicial: Método de estrias ou de riscado em placa (Figura 1.1): é um método de isolamento bastante rápido que consiste no espalhamento de uma pequena porção de inóculo, colhida com uma ansa, que é sucessivamente riscada na superfície de um meio de cultura sólido. A execução do riscado pode ser feita de várias formas; o importante é que pelo menos uma célula 2

4 fique isolada das restantes de forma a obter-se uma colónia derivada da multiplicação dessa célula original, isto é, constituída por células geneticamente iguais. Método das diluições decimais sucessivas (Figura 1.2): consiste na realização de diluições decimais (1 para 10) sucessivas da amostra, em condições de esterilidade, e posterior sementeira de quantidades conhecidas das mesmas em caixas de Petri. A diluição tem como objectivo a obtenção de menos densidade celular por unidade de volume, de forma que, após sementeira, pelo menos algumas células fiquem isoladas originando colónias formadas por células iguais entre si. A sementeira (operação que consiste em distribuir uniformemente o inóculo em meio de cultura apropriado) pode ser efectuada por vários métodos, sendo os mais comuns o espalhamento à superfície e a inoculação por incorporação. Figura 1.1. Exemplo de um riscado em placa. Fonte: (consultado em 24-Janeiro-2011). 3

5 Figura 1.2. O método das diluições decimais sucessivas. Fonte: (consultado em 24-Janeiro-2011). O crescimento dos microrganismos em meio sólido dá origem à formação de colónias (crescimento macroscopicamente visível resultante da multiplicação celular). Se as células microbianas estiverem completamente dispersas, cada colónia corresponde a uma bactéria inicial em estado viável e cultivável. Se os microrganismos estiverem agregados ou aderentes a pequenas partículas não há correspondência entre o número de colónias obtido e o número inicial de microrganismos. Desta forma, relativamente à origem de uma colónia, ou ao teor de microrganismos determinado por contagem de colónias, fala-se em Unidades Formadoras de Colónias (UFC). Após a obtenção de uma cultura pura, a sua manutenção em laboratório deve garantir que os microrganismos permaneçam viáveis, geneticamente homogéneos e protegidos de posteriores contaminações. As culturas podem ser mantidas por refrigeração (4ºC), congelação (-20ºC, -70ºC ou em azoto líquido: -180ºC) ou liofilizadas. Para conservação a longo prazo deverão usar-se substâncias crioprotetoras (e.g., glicerol). Protocolo 1.1 Preparação e distribuição de um meio de cultura sólido 1. Seguindo as instruções da embalagem, pese a quantidade de pó necessária para preparar o volume indicado pelo docente; 2. Transfira para um Erlenmeyer o pó que pesou; 3. Meça o volume necessário de água destilada numa proveta e transfira para o Erlenmeyer; 4. Coloque um magnete dentro do Erlenmeyer e agite numa placa de aquecimento até obter uma solução límpida, seguindo as instruções da embalagem; 4

6 5. Meça o ph e se necessário, ajuste-o para o valor indicado na embalagem, adicionando gota-a-gota as soluções ácida ou alcalina; 6. Tape o Erlenmeyer com a rolha de algodão e o papel de alumínio; 7. Coloque o Erlenmeyer com o meio de cultura a esterilizar na autoclave (121ºC durante minutos); 8. Retire o Erlenmeyer da autoclave e deixe arrefecer até atingir uma temperatura que permita o seu manuseamento, mas superior a 42ºC; 9. Desembrulhe as caixas de Petri estéreis e identifique-as com o nome do meio de cultura e a data da sua elaboração; 10. Verta o meio de cultura nas caixas de Petri em condições de assepsia, fazendo uma camada de aproximadamente 5 mm; 11. Deixe solidificar, inverta e guarde a 4ºC até à sua utilização. Protocolo 1.2 Obtenção de um inóculo por diluições decimais sucessivas 1. Identifique previamente os 4 tubos de ensaio contendo 9 ml de soro fisiológico, com as referências 10-1, 10-2, 10-3 e 10-4 ; 2. Homogeneíze a suspensão de microrganismos fornecida e, em condições de assepsia, transfira com uma pipeta 1 ml da suspensão para o primeiro tubo (diluição 10-1 ); 3. Descarte a pipeta e homogeneíze a suspensão diluída; 4. Com outra pipeta esterilizada retire 1 ml da diluição (diluição 10-1 ) e introduza-a num segundo tubo de diluição, para obtenção da diluição 10-2 ; 5. Proceda de igual modo até à diluição 10-4, seguindo o esquema da Figura 1.2; 6. Semeie imediatamente, de acordo com os métodos indicados nos pontos seguintes, seguindo a ordem decrescente das diluições e utilizando uma só pipeta para todas as sementeiras da mesma amostra. Protocolo 1.3 Sementeira por incorporação 1. Mantenha o meio de cultura sólido num banho a 45ºC (o ágar começa a solidificar a 42-44ºC); 2. Identifique 5 caixas de Petri estéreis com a data, turma e nº de aluno e diluição respectiva e marcar uma caixa de Petri extra com a letra C (controlo); 3. Seguindo a ordem decrescente das diluições, retire, em condições de assepsia, 1 ml de cada uma das diluições indicados pelo docente uma pipeta esterilizada, depois de a ter enchido e esvaziado pelo menos 6 vezes na suspensão de microrganismos; 4. Entreabrindo apenas o suficiente a tampa da caixa de Petri, coloque o conteúdo da pipeta no fundo da caixa; 5. Tire a rolha do tubo de meio sólido liquefeito, passe a boca do tubo pela chama e verta, de uma só vez, o seu conteúdo na caixa de Petri; 6. Incorpore o inóculo no meio de cultura: mantendo a caixa assente sobre o tampo na bancada, agite-a suavemente - evitando que o ágar toque a tampa da caixa - em todas as direcções, de forma a misturar o inóculo no meio de cultura (descreva cinco círculos no sentido dos ponteiros do relógio, cinco em sentido contrário e movimentos rectilíneos segundo duas direcções cruzadas, cinco vezes cada também); 7. Afaste a caixa da chama e deixe repousar até solidificar; 8. Utilize uma caixa-controlo, na qual não se deposita inóculo; 9. Após solidificação do meio, identifique as caixas com a data de inoculação, diluição e microrganismo inoculados, inverta e leve a incubar a 25ºC durante dois dias. 5

7 Protocolo 1.4 Sementeira por espalhamento em placa 1. Identifique convenientemente o material a inocular; 2. A partir de cada uma das diluições indicadas pelo docente, pipete em condições de assepsia 0.1 ml para a superfície do meio de cultura solidificado; 3. Com um espalhador de vidro estéril espalhe o inóculo por toda a superfície da caixa semeada, rodando-a simultaneamente; 4. Identifique as caixas, coloque em posição invertida e leve a incubar a 25ºC durante dois dias. Protocolo 1.5 Isolamento por riscado em placa 1. Observe as caixas de Petri com culturas mistas e escolha uma das colónias; 2. Com uma ansa esterilizada e arrefecida toque na colónia; 3. Risque com a ansa a superfície do ágar, de acordo com um esquema que vise esgotar completamente o material contido na ansa (Figura 1.1); 4. Identifique, inverta e leve a incubar a 25ºC durante 2 dias. Caracterização cultural e bioquímica de microrganismos Na descrição de microrganismos é importante ter em conta certas características morfológicas do crescimento, conhecidas por caracteres culturais (Figura 1.3), que incluem os seguintes aspectos: A morfologia da colónia isolada numa superfície de agar; na colónia isolada devem observar-se o tamanho, a cor, a forma, a elevação, a margem, a superfície, o brilho, a opacidade e a consistência; A morfologia do crescimento coalescente numa picada em profundidade (esta fornece indicação do tipo fisiológico do organismo em relação ao oxigénio, consoante a zona em que o crescimento se verifica); O desenvolvimento em meio líquido; O aparecimento de pigmentos na própria massa de crescimento ou difundidos no meio de cultura. Figura 1.3. Características culturais (forma, elevação e margem) de colónias em meio sólido. Fonte: number=7.(consultado em 24-Janeiro-2011). 6

8 Para a observação de microrganismos pode recorrer-se a preparações a fresco - quando há interesse em fazer a observação em condições de vida, por exemplo para observar a mobilidade e tipo de locomoção, para detetar mudanças citológicas durante a divisão celular, para a diferenciação de esporos, etc. Há, porém, objectivos que tornam conveniente a coloração das preparações, como por exemplo: Aumento do contraste entre as células e o meio (o índice de refracção do protoplasma bacteriano é muito semelhante ao do meio circundante, sendo difícil o exame das bactérias em preparações não coradas, a não ser que se usem métodos especiais de iluminação como por exemplo a microscopia de contraste de fase); Diferenciação de organismos que reagem de modo diferente ao mesmo corante (colorações diferenciais); Observação de estruturas particulares (e.g., parede celular, material nucleico, esporos, cápsula, etc.). A coloração de Gram (Christian Gram, Dinamarca, 1884) é uma técnica de coloração diferencial, que permite distinguir dois tipos de bactérias com base nas características da parece celular (Figura 1.4). Baseia-se no facto de que quando as bactérias são coradas com certos corantes básicos, as células de Gram-negativo podem ser facilmente descoradas com solventes orgânicos (e.g., etanol, acetona), enquanto as células das espécies Gram-positivo resistem a esta descoloração. A capacidade das células reterem ou perderem o corante reflecte diferenças na estrutura fundamental da parede celular, pelo que a resposta à coloração de Gram é uma característica taxonómica importante, usada numa fase inicial da identificação das bactérias. Nas bactérias Gram-negativas, o álcool remove os lípidos da membrana externa da parede celular, aumentando a sua permeabilidade; o complexo violeta de cristal-iodo pode assim ser extraído, descorando as bactérias Nas bactérias Gram-positivas, o tratamento com álcool resulta na sua desidratação, com redução da permeabilidade da parede e consequente retenção do complexo violeta de cristal-iodo Figura 1.4. A coloração de Gram. Fonte: (consultado em 24-Janeiro-2011). Um aspecto importante na caracterização de microrganismos é a sua relação com o oxigénio. Muitos microrganismos possuem enzimas que os protegem dos efeitos dos produtos da redução do oxigénio, que são extremamente tóxicos destruindo rapidamente as células devido a serem agentes oxidantes. Os microrganismos aeróbios estritos e anaeróbios facultativos contêm geralmente a enzima catalase que catalisa a destruição do peróxido de hidrogénio e a enzima super-óxido dismutase (SOD), que catalisa a destruição do radical super-óxido. Os microrganismos aerotolerantes podem não ter catalase 7

9 mas têm sempre super-óxido dismutase (SOD). Os anaeróbios estritos não têm ambas as enzimas e por isso não toleram o oxigénio. O teste da actividade destas enzimas permite saber qual a relação de um microrganismo com o oxigénio. Protocolo 1.6 Caracterização cultural de colónias 1. Observe atentamente à lupa binocular as colónias das caixas de Petri e, sem abrir as caixas, descreva as características morfológicas das colónias (Figura 1.3)., em relação a: Protocolo 1.7 Tamanho (meça na base da caixa o diâmetro da colónia com uma régua) Cor Forma Margem Elevação Superfície (lisa/rugosa) Brilho (brilhante/mate) Opacidade (transparente/translúcida/opaca) Consistência (cremosa/butirosa/viscosa/granulosa) Elaboração de um esfregaço e coloração de Gram Elaboração de um esfregaço 1. Retire com a pinça uma lâmina de vidro do recipiente e inflame à chama; 2. Coloque uma gota de água destilada esterilizada na lâmina; 3. Esterilize uma ansa à chama e deixe arrefecer; 4. Em condições de assepsia, retire com a ansa um pouco da massa de uma colónia e suspenda o material na gota de água; 5. Espalhe muito bem numa área de aproximadamente 1 cm 2, esfregando bem de forma a separar a massa de células; 6. Segure a lâmina com uma pinça e passe rapidamente sobre a chama até toda a água evaporar para fixar o material. Coloração de Gram 1. Inunde o esfregaço fixado com violeta de cristal (corante primário) agitando suavemente durante 60 segundos (Figura 1.4); 2. Lave com água corrente, começando na extremidade da lâmina e deixando escorrer por cima do material fixado; 3. Inunde o esfregaço com solução de Lugol, deixando atuar durante 60 segundos (vai formar um complexo com o violeta de cristal); 4. Lave com água corrente e seque com papel de filtro, pressionando suavemente o papel contra a preparação; 5. Inunde o esfregaço com álcool iodado (agente descolorante), agitando suavemente durante 60 segundos; 6. Inunde com corante vermelho safranina durante 30 segundos, lave e seque com papel de filtro; 7. Observe ao microscópio, verificando se as células são Gram-positivas ou Gram-negativas e registando a sua forma e a sua dimensão. 8

10 Protocolo 1.8 Atividade da catalase (hidroperoxidase) 1. Coloque uma gota de água oxigenada a 10% numa lâmina de vidro escavada; 2. Em condições de assepsia, toque com a ansa esterilizada e arrefecida numa colónia e coloque a massa celular na gota de água oxigenada, homogeneizando; 3. Verifique se há libertação imediata de oxigénio (borbulhar), o que indica a atividade da catalase (a catalase actua sobre a água oxigenada, libertando água e oxigénio de acordo com a seguinte reação: H2O2 2 H2O + O2). Protocolo 1.9 Atividade da citocromo-oxidase 1. Num pedaço de papel de filtro, coloque uma gota de dimetil-p-fenilenodiamina (1%); 2. Toque numa colónia de bactérias com uma pipeta de Pasteur com a extremidade fechada e passe sobre o papel de filtro molhado; 3. Observe o resultado da actividade após 2 minutos. A reacção é positiva quando aparece cor violeta e negativa quando não existe alteração de cor. Avaliação quantitativa de populações A avaliação quantitativa do crescimento microbiano pode ser feita de diversas formas, dependendo das características do material e da informação pretendida. Por conveniência, os parâmetros medidos são normalmente os seguintes: Actividade dos microrganismos que constituem a população em estudo. Por exemplo, redução de corantes (medida pelo grau de redução em determinado tempo ou pelo tempo necessário à redução), libertação de CO2 (pelo volume ou pela massa perdida), consumo de O2 (pela chamada Carência Biológica de Oxigénio, CBO); Massa celular, uma vez fixadas as condições de observação e conhecida a função que relaciona a massa celular com o número de microrganismos presentes (ex. gravimetria, nefelometria); Número de células: contagem dos microrganismos, directa ou total (ex. câmaras de contagem e método de Breed) e indireta ou de microrganismos viáveis (ex. contagem em placas e método do Número Mais Provável - NMP); O número de células viáveis presentes numa população microbiana (células com capacidade para se multiplicar) pode ser estimado usando técnicas de contagem em placas. Neste método um volume conhecido de uma suspensão de microrganismos, convenientemente diluída, é espalhado na superfície de um meio de cultura solidificado (sementeira por espalhamento em placa) ou incorporado nesse meio (sementeira por incorporação). As colónias que se desenvolvem, após incubação adequada, são contadas. Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula, o que nem sempre é verdade, pelo que os resultados são normalmente expressos em termos de unidades formadoras de colónias (UFC). Para que os resultados sejam significativos as placas contáveis deverão ter entre 30 a 300 colónias. O número total de microrganismos obtém-se multiplicando o número de colónias pelo factor de diluição. Um dos processos mais usuais de determinação do número de microrganismos é a contagem directa ao microscópio, usando câmaras de contagem. Estas são constituídas por uma lâmina que tem gravado um reticulado de dimensões conhecidas no fundo de uma pequena depressão que, coberta com uma lamela não flexível e perfeitamente aderente aos bordos, fica com uma profundidade livre geralmente conhecida. O espaço assim criado, cujo volume é conhecido, é preenchido com um líquido em que se encontram suspensas as partículas a contar. Admitindo que as partículas se distribuem 9

11 homogeneamente no líquido e que a amostra contida na câmara é representativa da inicial, a contagem das partículas presentes num volume conhecido pode ser generalizada a essa amostra inicial. Habitualmente procura-se minimizar a heterogeneidade da distribuição contando um número suficientemente grande de unidades do reticulado. As câmaras de contagem existentes derivaram dos chamados hemocitómetros, inicialmente concebidos para contagem de células de sangue. Permitem hoje a contagem de células tão pequenas como as bactérias. O reticulado de Neubauer (Figura 1.5) ocupa um quadrado de 3 mm de lado, com divisões e subdivisões. As divisões maiores são nove quadrados de 1 mm de lado. Esses quadrados encontram-se divididos em 16 subdivisões de 0.25 mm de lado, ou seja, 144 no total. Alguns desses quadrados de 0.25 mm de lado (fazendo uma cruz na zona central da câmara) estão divididos em rectângulos com 0.25 mm de comprimento e o.o5 mm de largura. Na zona central, estas divisões encontram-se ainda divididas formando quadrados de 0.05 mm de lado. Figura 1.5. Reticulado da câmara de contagem de Neubauer. Profundidade = mm. Fonte: (consultado em 24-Janeiro-2011). Para a contagem deve escolher-se o tamanho da divisão mais adequado à dimensão das células e à sua densidade (entre 10 e 50 células por divisão). A contagem directa ao microscópio é uma técnica rápida e que permite, também, obter informação sobre o tamanho e morfologia dos microrganismos. No entanto, encontra-se sujeita a erros, provenientes principalmente da reprodutibilidade de enchimento da câmara de contagem e da adsorção de bactérias às superfícies do vidro. As suas principais 10

12 desvantagens estão associadas à sensibilidade (é necessária uma elevada concentração de células, superior a 106) e ao facto de não permitir distinguir as células vivas das mortas. Protocolo 1.10 Contagem em placas 1. Observe as caixas de Petri inoculadas por incorporação ou por espalhamento à superfície; 2. Seleccione apenas as que permitam contar entre 30 a 300 colónias e conte as colónias nas caixas seleccionadas (pode ir assinalando as colónias com uma caneta de acetato à medida que efectua a contagem); 3. Calcule para cada caixa o número de células viáveis presentes na suspensão original (UFC/ml), i.e., a abundância de microrganismos cultiváveis, tendo em atenção o número de UFC contadas e a diluição efectuada antes da sementeira; 4. Calcule o número médio de UFC das diversas repetições. Protocolo 1.11 Câmaras de contagem 1. Observe a câmara de contagem, familiarizando-se com o reticulado; 2. Coloque uma lamela sobre a câmara e com uma pipeta de Pasteur preencha por capilaridade o espaço da câmara; 3. Foque o reticulado, certificando-se qual a área e o volume correspondentes às divisões respectivas; 4. Seleccione a divisão cujo tamanho lhe permita contar células por divisão; 5. Conte o número de células em várias dessas divisões (20 divisões); 6. Calcule a média do número de células por divisão; 7. Calcule o número total de células por unidade de volume da suspensão (número de células/ml). 11