LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA. Observação de células e estruturas celulares

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1 LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA Observação de células e estruturas celulares INTRODUÇÃO Existem essencialmente 2 tipos de microscópios: de luz e electrónicos, existindo ainda entre cada uma destas classes vários tipos, tais como o de microscopia electrónica de transmissão e de varrimento, microscópio óptico de campo claro, contraste de fase, fluorescência, etc. As observações efectuadas neste trabalho serão, no entanto, limitadas à utilização do microscópio óptico de campo claro (Fig. 1). A ampliação usada depende do tipo de lentes da objectiva usada com a ocular. Os microscópios compostos têm três ou quatro objectivas com ampliações de: 4x, 10x, 40-44x e imersão x. A ampliação total das lentes é calculada pela multiplicação da ampliação da ocular (geralmente 10x) pela ampliação das lentes da objectiva. A objectiva mais importante em microbiologia é a de imersão das lentes em óleo, as quais têm maior poder de ampliação Figura 1 Microscópio óptico. 1 Botão ON/OFF e regulador de intensidade de luz. 2 Oculares (10x). 3 Botões macro e micrométrico. 4 Plataforma de suporte da amostra. 5 Botões reguladores da plataforma. 6 Objectivas (5x, 10x, 40x, 100x). A capacidade das lentes revelarem em pequeno detalhe 2 pontos distintos e separados é chamada poder de resolução ou resolução. O poder de resolução (0,61λ/ΝΑ) é uma função Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

2 do comprimento de onda (λ) da luz utilizada (pode ser alterado por exemplo por filtros, tendo em média o valor de 0,5) e da abertura numérica (NA) das objectivas (para o ar é 1,0 e para o óleo de imersão 1,4). Α melhor resolução de um microscópio óptico é de cerca de 0,2 µm, isto é, dois objectos que distem menos que este valor não são distinguíveis. A falta de contraste entre as estruturas celulares e o meio dificulta a sua observação ao microscópio óptico. No sentido de minimizar este problema, estudaram-se vários tipos de colorações. Este método, de grande utilidade na observação de estruturas celulares, apresenta, no entanto, alguns inconvenientes uma vez que os corantes quando combinados quimicamente com os componentes celulares provocam a morte das células. Os corantes são compostos químicos sintéticos e para fins práticos são divididos em dois grupos: corantes ácidos e corantes básicos. Esta propriedade não tem a ver com a sua acidez ou basicidade, indica se a função de corante é desempenhada pelo anião ou pelo catião. Consideram-se geralmente três tipos de colorações: 1) simples, 2) diferenciais, e 3) especiais. 1. Colorações simples - são colorações nas quais se utiliza apenas um corante. Podem ser positivas - quando as células são coradas (ex: azul de metileno, safranina, cristal de violeta) - ou negativas - quando o meio é corado (ex: tinta da china, nigrosina). Esta colorações são usualmente utilizadas quando se pretende saber a morfologia e o arranjo das células. 2. Colorações diferenciais - são colorações em que se utiliza mais do que um corante. A coloração diferencial mais vulgar é a coloração de Gram, que é usada como um passo na caracterização de bactérias. A coloração Gram inicia-se com a aplicação do corante cristal de violeta seguida da aplicação de uma solução de iodo. Nesta fase todas as bactérias estão coradas de roxo. As células são em seguida tratadas com uma solução de álcool e acetona. As células Gram positivas retêm o complexo cristal de violeta-iodo e permanecem roxas, enquanto as células Gram negativas são completamente descoradas pelas mistura álcool-acetona. Na última fase do processo aplica-se um novo corante - safranina - que cora as Gram negativas de vermelho. As células Gram positivas aparecem coradas de cor púrpura. Diferenças na constituição da parede celular dos microrganismos explicam estes diferentes comportamentos de coloração. 3. Colorações especiais - são colorações que se destinam a corar estruturas celulares. Um exemplo deste tipo de coloração é o usado para a observação de flagelos bacterianos. Os Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

3 flagelos, a estrutura mais comum de mobilidade em bactérias, são compostos por finas estruturas proteicas com origem no citoplasma e projectadas para fora da parede celular. São muito frágeis e não visíveis com um microscópio de luz. Os flagelos podem ser observados por intermédio de um revestimento que aumenta o seu diâmetro. Existem também corantes que coram especificamente estruturas/macromoléculas celulares. Por exemplo, os corantes fluorescentes acridina laranja e DAPI (4'-6- diamidino-2-phenilindole), intercalam a dupla hélice do DNA, corando-o especificamente. O kit Live/Dead foi desenvolvido para diferenciar numa amostra bactérias viáveis e não viáveis. Este teste baseia-se na integridade da membrana citoplasmática: as bactérias com membranas intactas coraram de verde e as que têm a membrana destruída coram de vermelho. Outros corantes, como o carmin acético, permitem visualizar cromossomas em microscopia de campo claro, tornando possível, por exemplo, vizualizar as diferentes fases da mitose. O trabalho experimental tem por objectivo conhecer a morfologia de células de diferentes grandes grupos de organismos. Adicionalmente, pretende-se observar estruturas/macromolélulas das diferentes células. PARTE EXPERIMENTAL Durante o trabalho laboratorial cada grupo de 2 alunos deverá observar células de diferentes organismos. Os organismos estarão apenas identificados com letras, pois pretende-se que durante as aulas laboratoriais sejam caracterizados e apenas no final do período laboratorial será fornecida uma tabela com a sua identificação. Durante a aula prática, cada grupo de alunos deverá realizar diferentes preparações de microscopia de campo claro. Após a observação macroscópica e microscópica de cada organismo, cada aluno deverá registar TUDO o que observou para poder completar as tabelas anexas, que devem ser entregues no final da aula. Cada grupo deverá, ainda, propagar o microrganismo que irá usar nas aulas seguintes, através do método de estriamento (ver anexo a este protocolo). Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

4 Protocolo experimental de preparações de microscopia óptica de campo claro Observação de preparação a fresco 1. Limpe cuidadosamente uma lâmina com etanol; 2. Se pretender analisar uma cultura em MEIO SÓLIDO, coloque uma gota de água estéril na lâmina (com uma ansa); 3. Esterilize a ansa, deixe arrefecer, toque no topo de uma colónia; 4. Misture as células na lâmina com a gota de água. Este procedimento é desnecessário se a cultura já se encontra re-suspendida ou cultivada em MEIO LÍQUIDO: coloque 25 µl da cultura na lâmina e passe para o passo 6 (As culturas serão fornecidas pelo docente). 5. Esterilize novamente a ansa; 6. Coloque a lamela em cima da gota, tendo o cuidado de não pressionar o material biológico; 7. Coloque a preparação no microscópio e foque com a objectiva de menor ampliação usando em primeiro lugar o parafuso macrométrico (ajuste mais grosseiro) e para o ajuste mais fino o parafuso micrométrico; 8. Passe sucessivamente para a de maior ampliação, e quando usar a objectiva de 100x, coloque em cima da área a observar uma gota de óleo de imersão e ajuste novamente a focagem. NOTA: não use óleo de imersão com qualquer outra objectiva. 9. Observe cuidadosamente a forma, estruturas, tamanho e movimento do organismo/célula; 10. Registe as observações; 11. Retire a preparação, coloque-a numa solução desinfectante, e limpe o óleo da objectiva de imersão com papel macio e etanol. Preparação de um esfregaço (normalmente utilizado para observação de bactérias e leveduras) 1. Coloque numa lâmina limpa e seca uma gota de água destilada; 2. Esterilize uma ansa, toque numa colónia e misture bem o material biológico na gota de água (dispersando a água colocada na lâmina com a ansa já inoculada); Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

5 3. Fixe o material celular com o calor, levando a lâmina à chama várias vezes, de modo a secar sem aquecer demais. Coloração simples a partir de uma preparação a fresco 1. Prepare uma preparação a fresco sobre a lâmina; 2. Coloque o corante usando a técnica de irrigação: coloque uma gota de corante [azul de metileno a 1% (p/v)] num dos lados da lamela e arraste o corante com a ajuda de papel de filtro no lado oposto da lamela. 3. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de imersão. Coloração simples a partir de um esfregaço 1. Prepare um esfregaço; 2. Cobra o esfregaço com o corante [azul de metileno a 1% (p/v)]. Deixe actuar durante 1-3 min.; 3.Retire o excesso de corante com água corrente; 4. Seque com papel de filtro; 5. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de imersão. Coloração de Gram (parede de peptidoglicano) 1. Prepare um esfregaço; 2. Cubra o esfregaço com solução de cristal de violeta durante 30 segundos; 3. Lave com água e cubra o esfregaço com solução de iodo de Gram durante 30 segundos; 4. Lave com água e lave o esfregaço com solução descolorante. Deixe actuar durante alguns segundos; 5. Lave o esfregaço com água e cobrir com solução de safranina durante 30 segundos; 6. Lave com água, seque com papel absorvente e observar ao microscópio com objectiva de imersão (começando com a de menor ampliação); 7. Observe e registe a morfologia celular e o grupo a que pertence a bactéria - Gram positivas (púrpura) ou Gram negativas (vermelho). Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

6 Coloração diferencial para estudo da estrutura de uma célula vegetal 1. Coloque sobre 4 lâminas de vidro com a pipeta de Pasteur uma gota dos diferentes corantes diferenciais: solução de Ringer, solução de iodo, vermelho - neutro e azul de metileno. 2. Utilize o bisturi para fazer quatro pequenos cortes na epiderme da túnica cebola e coloque-os sobre as gotas dos corantes. 3. Cubra cautelosamente cada um com as lamelas. 4. Observe a preparação ao microscópio. Estudo do processo de osmose numa célula vegetal 1. Coloque sobre uma lâmina de vidro com a pipeta de Pasteur uma gota de água. 2. Coloque depois um fragmento da epiderme da túnica cebola e cubra com uma lamela. 3. Observe a preparação ao microscópio. 4. Utilizando a técnica de irrigação, substitua o meio de montagem pela solução de NaCl a 20 %. 5. Substitua novamente o meio de montagem por água destilada. 5. Registe as alterações observadas e esquematize o que observou. Coloração de cromossomas lineares 1. Coloque 25 µl de carmim acético 2% (p/v) no centro de uma lâmina. 2. Coloque o material celular com a pinça sobre o carmim acético. 3. Dissocie o material com duas agulhas de dissecção e aguarde um minuto. 4. Cobra com a lamela o material dissociado. 5. Retire o excesso de corante da preparação com papel de filtro. 6. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de imersão. Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

7 Propagação de microrganismos pelo método de estriamento Propague em meio sólido o organismo 2 que escolheu e anote-o pois vai trabalhar com ele nas aulas seguintes. 1. Identifique na caixa de Petri de meio sólido PCA o nome do microrganismo que vai cultivar, o seu nome e a data. 2. Esterilize uma ansa por flamejamento. 3. Deixe arrefecer a ansa, sem a contaminar. 4. Toque numa colónia isolada da cultura de inóculo. 5. Inocule o meio de cultura através da técnica de estriamento (use a ansa como se fosse um lápis de carvão cubra toda a superfície do meio, sem nunca voltar atrás, e mude de direcção, pelo menos 3 vezes) (Anexo 2). 6. Incube as culturas em posição invertida numa estufa incubadora, a 30 C durante 18 horas. 7. Observe e anote a morfologia colonial do seu organismo (Anexo 1). Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

8 ANEXO 1: Guia de observação e caracterização da morfologia colonial de microrganismos (culturas em meio sólido) Morfologia colonial FORMA PUNCTIFORME CIRCULAR FILAMENTOSA IRREGULAR RIZOIDE FUSIFORME ELEVAÇÃO PLANA ELEVADA CONVEXA PULVINADA UMBUNADA MARGEM INTEIRA ONDULADA LOBADA ERUDIDA FILAMENTOSA ENCRESPADA OUTRAS CARACTER ÍSTICAS: Cor, brilho, opacidade, consistência, tamanho, etc... Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,

9 ANEXO 2: Propagação de um microrganismo pelo método do estriamento. Método de estriamento Esterilização da ansa Ansa Arrefecer a ansa Ansa Tocar numa colónia isolada Bico de Bunsen Bico de Bunsen Pode esterilizar novamente a ansa antes de recomeçar o estriamento noutro quadrante Placa de Petri com meio de cultura sólido Cândida Manuel e Olga Nunes, FEUP,