AULA 2 Microscópios de Luz e Microscópios Electrónicos Aplicações. Técnicas de Preparação de material para observação ao microscópio

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1 AULA 2 Microscópios de Luz e Microscópios Electrónicos Aplicações. Técnicas de Preparação de material para observação ao microscópio OBJECTIVOS da AULA - Rever os conceitos base da microscopia, como o limite de resolução, o poder de resolução, a abertura numérica. - Classificar e descrever os diferentes tipos de microscópio de luz (microscópio óptico, contraste fase, invertido, fundo escuro, fluorescência, confocal), analisando as suas aplicações. - Classificar os diferentes tipos de microscópios electrónicos: microscópio electrónico de transmissão, de varrimento e integrados. - Exemplificar a utilização dos diferentes microscópios de luz ou electrónicos. - Discutir as diferentes técnicas de preparação do material biológico para observação ao microscópio óptico: colheira, fixação, desidratação, inclusão, corte, coloração e montagem de lâminas. - Discutir as diferentes técnicas de preparação de material biológico para observação ao microscópio electrónico: colheita, fixação, pós-fixação, desidratação, inclusão, polimerização, corte semifinos e ultrafinos e preparação de grelhas. 1

2 Introdução Como todos sabemos, as células são pequenas e muito complexas! Assim, encontramos alguma dificuldade na visualização das estruturas celulares, tornando complexo o processo de avaliação do funcionamento de todos os componentes celulares. Uma célula animal típica tem um diâmetro de 10 a 20 µm (que é 5 x menos que a menor partícula visível a olho nu). Por outro lado, as células animais por ex. não são apenas minúsculas, mas também incolores e translúcidas. No início do séc. XIX (1838), Schleiden e Schwann, com a ajuda do microscópio óptico, descobriram que os tecidos animais e vegetais eram agregados de células individuais, nascendo assim a Biologia Celular. Fig. 1 Relação do tamanho de células e dos seus componentes, indicando a faixa de objectos que podem ser propriamente visualizados a olho nu, e através do MO ou ME. Já no final do século XIX a descoberta das principais características internas da célula dependeu do desenvolvimento de uma variedade de corantes que forneciam um contraste suficiente para tornar tais características visíveis. No início da década de 40 do século XX, com a introdução do microscópio electrónico, surgiu a necessidade de se desenvolverem novas técnicas não só para preservar as suas estruturas, como também para corar/contrastar as células. De facto, a qualidade das imagens que observamos ao microscópio depende tanto das técnicas de preparação das amostras quanto do poder de resolução do microscópio em si. 2

3 I CONCEITOS BÁSICOS DE MICROSCOPIA Convém recordar as unidades de tamanho normalmente empregues em microscopia, que são: µm (micrómetro) = 10-6 m nm (nanómetro) = 10-9 m Å (angström) = m Um dos conceitos importantes em microscopia é o de limite de resolução (ou limite de separação) que é definido como a distância linear mínima entre 2 pontos adjacentes, dos quais a microscopia dá imagens distintas. Corresponde ao diâmetro aparente da mais pequena partícula visível. O microscópio óptico permite distinguir 2 pontos que estejam afastados um do outro por uma distância igual a 0,2-0,3 µm. Para distâncias inferiores não é possível definir esses 2 pontos, sendo então observados como um ponto único. Portanto, o limite de resolução do microscópio óptico está entre 0,2 e 0,3 µm. O limite de resolução do olho humano, à distância de 25 cm, é de µm (0,1 0,3 mm). Podemos por isso dizer que o microscópio óptico tem um poder de resolução 500x superior ao da visão humana. Em termos práticos, bactérias e mitocôndrias podem ter aproximadamente 500 nm = 0,5 µm de largura, sendo esta última o menor organelo cuja forma pode ser discernida ao Microscópio Óptico (MO). O limite de resolução de um microscópio depende directamente do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica de ambas as lentes, objectivas e condensador. 0,61 λ 0,61 λ Limite de Resolução = = n senθ AN θ = semi-ângulo do cone máximo de luz que pode entrar na objectiva em relação a um determinado ponto (como o ângulo máximo é 180 o, sen θ tem um valor máximo de 1) n = índice de refracção do meio entre a amostra e a lente frontal λ = comprimento de onda de luz AN = n sen θ = Abertura Numérica das lentes da objectiva 3

4 Se o valor deste quociente for muito pequeno, podemos distinguir 2 pontos que estejam muito próximos. Assim sendo, quanto menor for o limite de resolução, maior é o poder de resolução. Para se obter um valor mínimo na fórmula anterior temos que utilizar luz de menor comprimento de onda (ex: luz violeta, que tem o menor comprimento de onda do espectro visível) e uma abertura numérica elevada (com a objectiva de 100x). Deste modo obtemos o máximo poder de resolução. Ampliação da objectiva AN da objectiva Limite Resolução 4x 0,1 0,61x0,45/0,1 = 2,75 µm 10x 0,25 1,1 µm 40x 0,65 0,42 µm 100x 1,25 0,22 µm Alguns microscópios têm uma AN de 1,3 com a objectiva de 100 o que melhora a resolução. O Limite de Resolução de uma objectiva varia, pois, na razão inversa da sua abertura numérica. A abertura numérica traduz assim a capacidade das lentes convergirem a luz. Para as lentes secas não pode ser superior a 1 Para as lentes de imersão (óleo) pode chegar a 1,4 Quanto maior for a AN, mais luz é necessária incidir sobre a amostra. II CARACTERÍSTICAS DOS MICROSCÓPIOS MAIS COMUNS Podemos classificar os microscópios em microscópios de luz e microscópios electrónicos. A - Microscópios de luz mais utilizados: (i) microscópio de luz/fotónico vulgar (de campo claro) (ii) microscópio de contraste de fase (iii) microscópio invertido (iv) microscópio de fundo escuro (v) microscópio de luz fluorescência (vi) microscópio confocal 4

5 B - Microscópios electrónicos: (i) microscópios electrónicos de transmissão (TEM) (ii) microscópios electrónicos de varrimento (Scanning) (SEM) (iii) microscópios electrónicos integrados (STEM) De seguida apresenta-se uma breve descrição de cada microscópio: A MICROSCÓPIOS DE LUZ (i) MICROSCÓPIO ÓPTICO O microscópio óptico vulgar é constituído por um sistema mecânico e um sistema óptico. A Sistema mecânico: a) pé ou base b) braço c) tubo ou canhão d) suporte de condensador, do diafragma, do portafiltros e) botões de comando de movimento Parafuso macrométrico Parafuso micrométrico Parafuso deslocação das pinças na platina Parafuso deslocação vertical do condensador f) revólver g) platina h) pinça sobre a platina B Sistema óptico a) Sistema de iluminação: (i) fonte luminosa (ii) filtro (iii) diafragma (iv) condensador b) Sistema de ampliação (i) objectivas a seco (ii) objectivas de imersão (iii) oculares 5

6 Descrição de alguns aspectos dos componentes do microscópio acima referidos: A Sistema mecânico a) Pé ou base placa pesada que assenta sobre a mesa de trabalho, dando estabilidade ao conjunto. Tem também um encaixe para o suporte do sistema de iluminação. b) Braço/Coluna parte vertical e oblíqua que está fixa à base e suporta as restantes partes componentes do microscópio. c) Tubo ou canhão tem duas partes, uma vertical e uma inclinada ajustadas uma à outra e que servem de suporte ao sistema de ampliação. A parte superior é um tubo binocular, tendo dois tubos porta-oculares, reguláveis em altura e lateralmente. Porque é necessário regular em altura? Para permitir corrigir e compensar desigualdades do poder visual dos dois olhos anisometropia. Como é que se regula? 1.º - Com o olho direito e utilizando a ocular direita, foca-se a imagem com os parafusos macro e micrométricos, mantendo-se o olho esquerdo fechado. 2.º - Fecha-se o olho direito e observa-se o mesmo pormenor com o olho esquerdo pela ocular esquerda e sem mexer nos botões de focagem, roda-se o anel de 6

7 regulação do tubo até se obter uma imagem tão nítida como a que se obteve pela focagem com a ocular direita. A regulação lateral permite ajustar a distância entre as oculares à distância interpupilar de cada observador. O tubo binocular é rodável, podendo fixar-se numa posição desejada por um pequeno parafuso. d) Condensador é constituído por 2 lentes. Está corrigido em relação à aberração da esfericidade condensador aplanático. Esta correcção é importante para que o condensador possa fornecer à objectiva um cone de luz uniforme. A abertura deste cone é regulada pelo diafragma. e) Suporte do condensador, do diafragma e do porta-filtros - Está fixado à parte inferior do suporte da platina. f) Botões de comando de movimentos - Botões bilaterais que controlam as deslocações verticais da platina. Parafuso macrométrico parafuso de focagem rápida. Este parafuso engrena numa cremalheira da platina o que permite a deslocação rápida, vertical da platina (cuidado: movimentos muito rápidos podem fazer colidir a lâmina com a objectiva!). Parafuso micrométrico focagem lenta, movimentos lentos e verticais da platina. Botões de controlo sobre a platina estes botões deslocam a preparação na platina ajudando a procurar o que queremos na lâmina. Modo de explorar uma preparação g) Revólver peça metálica que suporta as objectivas, que se roda de modo a colocá-las em posição de observação exactamente no prolongamento do tubo. 7

8 h) Platina peça onde se coloca a lâmina (com a lamela virada para cima), tendo no centro uma abertura para deixar passar a luz. i) Pinça sobre a platina serve para imobilizar a lâmina. Nos microscópios actuais esta não se coloca por cima da lâmina, apenas toca os lados da preparação de modo a imobilizá-la. Os botões de controlo sobre a platina estão em directa ligação com esta pinça e, portanto, os dois em combinação é que são responsáveis pelo movimento da lâmina. B Sistema óptico Compreende o sistema de iluminação, que é composto por uma lâmpada; o sistema de lentes que forma o condensador e o sistema de ampliação (formado por 2 sistemas de lentes; o sistemas das objectivas e o das oculares). Sistema de iluminação fornece, orienta e regula a quantidade de luz que atravessa o objecto e que através do sistema de ampliação atinge o olho do observador. a) Fonte luminosa Feixe de raios luminosos fornecido por uma lâmpada de baixa voltagem que se encontra num suporte ajustado à base do microscópio. Em alguns microscópios a abertura deste feixe pode ser regulada por um diafragma de campo colocado sobre a fonte luminosa. O interruptor de intensidade regulável está na base ou no braço do microscópio geralmente do lado direito. A lâmpada é suportada por um porta lâmpadas que pode girar de modo a centrar o filamento. b) Filtros - podem ser usados para aumentar a resolução e o contraste, diminuir a intensidade da luz e do brilho e absorver o excesso de calor Conforme a cor do filtro usada assim é possível aumentar a visibilidade ou reduzir o contraste. A qualidade da imagem pode ser aperfeiçoada pelo uso de filtros corados que tem influência na composição espectral da luz. Aumenta a resolução, diminuindo o comprimento de onda dos raios utilizados (a luz azul tem duas vezes o poder de resolução da luz vermelha e amarela). Para a observação de preparações coradas, usa-se um filtro de cor complementar do corante usado na preparação, ou um filtro da mesma cor em conformidade com o que se pretende. Ex: uma preparação com os núcleos azuis e o citoplasma vermelho Se usar filtro vermelho os núcleos aparecem pretos, aumenta-se o contraste em prejuízo do pormenor. 8

9 Se usar filtro azul escurece as partes vermelhas, aumentando o pormenor, mas diminuindo o contraste dos núcleos. c) Diafragma - controla o campo luminoso, regulando a abertura do feixe luminoso. d) Condensador - sistema de duas lentes convergentes que, atravessado pelo feixe de luz, fornece à objectiva um cone de luz uniforme. Concentra os raios luminosos na preparação, fornecendo à objectiva raios oblíquos e directos, aumentando assim o poder de resolução da objectiva. Sistema de ampliação - É formado por dois sistemas de lentes que têm que estar em perfeito alinhamento. a) Sistema das objectivas - formado por duas lentes: uma lente frontal e uma lente correctora que nos dá uma imagem real, mas invertida, do objecto. b) Sistema da ocular - funciona como uma lupa ampliando a imagem dada pelas objectivas. O Poder de ampliação é a capacidade de fornecer uma imagem ampliada do objecto. Ex.: objectiva de 40x com ocular 10x : Poder de ampliação = 40 x 10 = 400x Assim, a ampliação: É o número de vezes que a imagem parece maior que o objecto Os graus de ampliação da objectiva são geralmente 4x; 10x; 20x, 40x; 100x Quanto maior for a ampliação da objectiva menor é a distância focal (que é a distância da lente frontal da objectiva ao objecto) Ampliação da objectiva Distância focal 4x 29,3mm 10x 15,6mm 40x 4,3mm 100x 1,8mm 9

10 A ampliação varia na razão directa do comprimento da objectiva e na inversa do diâmetro da lente frontal. As objectivas podem ser: A seco quando têm o ar entre a lente frontal e o objecto De imersão quando é necessário um líquido entre a lente frontal e o objecto, para convergir/concentrar os raios luminosos no objecto. Pode usar-se água ou óleo. A imersão aumenta o poder de resolução. Com a imersão homogénea são eliminadas as perdas de luz que ocorrem quando os raios luminosos passam de um meio opticamente mais denso (vidro de lamela n = 1,51) para um menos denso (ar, n = 1). Deste modo, a objectiva recebe mais raios de luz do que receberia sem a imersão. Para efectuar a focagem (regular a distância entre o objecto e a lente frontal da objectiva) de uma objectiva, desloca-se a platina com o parafuso macrométrico, aperfeiçoando-se a focagem com o parafuso micrométrico. As objectivas tem alguns números inscritos que estão relacionados com (ex. para objectiva 40x): 170 = comprimento do tubo óptico 0,17 = espessura da preparação com lamela 40 = ampliação da objectiva 0.65 = abertura numérica (AN) De notar que a AN depende: do diâmetro da lente frontal (quanto maior, menor é a AN). do índice de refracção do meio entre o objecto e a objectiva. As aberrações são efeitos inerentes às lentes que prejudicam a nitidez da imagem óptica. São várias as aberrações das objectivas: - Aberração esférica a esfericidade da lente determina a existência de vários focos para os raios luminosos que nela incidem. Os raios que incidem, na margem da lente 10

11 são mais fortemente desviados que os raios centrais, daí resultando uma distorção da imagem. - Aberração cromática resulta da decomposição da luz, em virtude da desigual refracção sofrida pelas radiações das diferentes cores. Havendo um foco para cada cor a imagem fica irisada. - Curvatura de campo traduz-se pela falta de nitidez da parte marginal do objecto quando o centro está focado e, inversamente, pela falta de nitidez da parte central do objecto quando as margens estão focadas. i.e.: a curvatura do campo provoca um defeito de focagem em relação a todas as partes do objecto fora do eixo óptico. As objectivas acromáticas são aquelas que estão corrigidas em relação às aberrações cromática e esférica. A correcção é feita pela associação de lentes correctoras. Sobre a platina existem duas réguas, uma horizontal e outra vertical que são úteis para localizar estruturas nas lâminas ie: é através delas que tiramos as coordenadas de um dado objecto Neste exemplo a coordenada seria de 22,3. Porquê? 1.º O zero da régua pequena (nónio) está entre o 22 e o 23, portanto será 22,... 2.º Para determinar o valor decimal é preciso ver qual o 1.º traço da régua pequena que coincide com um da régua maior. Neste ex: é o 3.º traço depois do zero portanto 22,3. 11

12 b) MICROSCÓPIO CONTRASTE DE FASE É utilizado para visualizar células vivas ou células sem coloração, aproveitando os efeitos de interferência produzidos quando dois conjuntos de ondas se recombinam. Cria-se, deste modo, uma imagem de estrutura da célula. Quando a luz atravessa uma célula viva, a fase do comprimento de onda é alterado de acordo com o índice de refracção da célula. Por ex. quando a luz passa através de uma parte espessa/densa como o núcleo, ela é retardada e deslocada em relação à luz que passa através de uma região adjacente do citoplasma mais fino. c) MICROSCÓPIO INVERTIDO É um microscópio cuja posição das objectivas e da fonte de luz se encontram ao contrário do MO normal, ou seja as objectivas por baixo e a fonte de luz condensada por cima do objecto. É muito utilizado para observação de células vivas em cultura. d) MICROSCÓPIO DE FUNDO ESCURO Os raios de luz da fonte de luz são direccionados para o lado de forma que só a luz difundida passe pelas lentes do microscópio. Consequentemente a célula aparece como um objecto iluminado contra um fundo preto. É um microscópio utilizado para observação do movimento celular e com aplicações, por exemplo, na bacteriologia. 12

13 e) MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA (MF) Semelhante ao MO, no entanto, a luz utilizada para iluminação tem origem numa fonte muito poderosa, geralmente uma lâmpada de mercúrio, com um tempo de utilização limitado (uma lâmpada de mercúrio deve ser usada aproximadamente 200 horas). A contabilização das horas faz-se através de um contador ligado ao microscópio. É mais frequentemente utilizada para a detecção de proteínas específicas ou de determinadas moléculas nas células e nos tecidos. Também pode ser usado para monitorizar mudanças na concentração e localização de moléculas específicas dentro de células vivas. No MF a luz passa por dois filtros: um para filtrar a luz antes de ela atingir a amostra este filtro é seleccionado de modo a permitir apenas a passagem de comprimentos de onda que excitem um determinado fluoróforo. Outro para filtrar a luz obtida da amostra bloqueia a passagem de luz excepto o comprimento de onda emitido pelo fluoróforo. Fluoróforo ou fluorocromo (ex. fluoresceína, rodamina etc) grupo funcional de uma molécula que absorve energia num determinado comprimento de onda e emite num comprimento de onda superior (com menos energia). f) MICROSCÓPIO CONFOCAL O microscópio confocal tem-se revelado uma ferramenta muito importante na investigação biológica e bioquímica, bem como na análise química e de materiais, permitindo a localização tridimensional de estruturas e moléculas marcadas com fluorocromos. Este microscópio funciona como um microscópio de fluorescência mas todas as estruturas que estão fora de foco são eliminadas na formação da imagem. Isto é conseguido através de um conjunto de diafragmas (pinholes) localizados em determinados pontos do trajecto óptico e que agem como fonte de luz pontual e detector 13

14 pontual. Os raios de luz que estão fora de foco são eliminados pelo pinhole de detecção. A fonte de luz no microscópio confocal é um feixe laser. Para obter uma imagem completa, o ponto de luz ilumina a amostra num movimento de varredura, controlado por espelhos defletores. A luz emitida ou refletida pela amostra que passa pelo pinhole de detecção é transformada em sinais elétricos por uma fotomultiplicadora e mostrada no monitor do computador. Alterando progressivamente o plano de foco, obtém-se uma série de imagens que pode ser reconstruída eletronicamente, formando uma imagem 3D. As maiores vantagens deste microcópio são: a possibilidade de obter imagens multidimensionais, um melhor contraste e melhor resolução. Imagens podem ser intensificadas e analisadas por técnicas electrónicas Os sistemas electrónicos de imagem associados a tecnologias de processamento de imagens causaram um grande impacto na microscopia óptica, na medida em que, permitiram que certas limitações práticas dos microscópios (relacionadas com imperfeições no sistema óptico) fossem superadas. Têm também contribuído para contornar duas limitações fundamentais do olho humano: 1) o olho não vê bem em 14

15 ambientes pouco claros; 2) não percebe pequenas diferenças de intensidade de luz em ambientes extremamente claros. A primeira limitação pode ser superada incorporando câmaras de vídeo, altamente sensíveis à luz, no microscópio. Torna-se assim possível a observação de células por períodos relativamente longos, com muito pouca luz, evitando-se os efeitos prejudiciais provocados por prolongada exposição a luz intensa (e calor). Estes sistemas de intensificação de imagens são especialmente importantes para a visualização de moléculas fluorescentes em células vivas. Por outro lado, o facto das imagens produzidas por câmaras de vídeo estarem na forma electrónica, permite que possam ser prontamente digitalizadas, carregadas em computador e processadas de várias maneiras para se extrair a informação. Tal processamento possibilita a compensação de várias imperfeições ópticas dos microscópios para se alcançar o limite teórico de resolução. Ao utilizar sistemas de vídeo acoplados a processadores de imagens, o contraste pode ser profundamente aumentado, de forma que as limitações do olho, na detecção de pequenas diferenças de intensidade de luz, são superadas. Apesar deste processo também aumentar os efeitos de irregularidades aleatórias de fundo do sistema óptico, essa interferência pode ser removida pela subtracção de uma imagem electrónica de uma área vazia do campo. Pequenos objectos transparentes previamente indistinguíveis do fundo tornam-se então visíveis. O elevado contraste, alcançável pelo microscópio de contraste de interferência diferencial, computadorizado, tornou possível a visualização de objectos ínfimos como um único microtúbulo, que apresenta um diâmetro de 0.025µm, menor que um décimo de comprimento de onda da luz. Microtúbulos individuais podem também ser vistos num microscópio de fluorescência. Entretanto, os efeitos inevitáveis da difracção mancham a imagem, de forma que os microtúbulos aparecem pelo menos com 0,2µm de largura, tornando-se impossível distinguir um único microtúbulo de um feixe de microtúbulos. 15

16 B. MICROSCÓPIOS ELECTRÓNICOS Utilizando um feixe de electrões, o limite de resolução pode ser muito pequeno. De facto, o comprimento de onda de um electrão diminui com o aumento da sua velocidade, conseguindo-se assim limites de resolução de aproximadamente 0,1nm (1Å). a) O MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISSÃO (TEM) é semelhante a um MO, mas muito maior e invertido. A fonte de iluminação consiste num filamento ou cátodo que emite electrões do topo de uma coluna cilíndrica de aproximadamente 2 metros de altura. O ar é bombeado para fora da coluna e dentro da coluna é criado vácuo para os electrões não se espalharem através da colisão com moléculas de ar. Os electrões são então acelerados a partir do filamento por um ânodo e atravessam um pequeno orifício formando um feixe de electrões que desce a coluna. Bobines magnéticas, colocadas ao longo da coluna, convergem o feixe de electrões (como as lentes de vidro convergem a luz no MO). A amostra é colocada no vácuo através de uma câmara compressora na trajectória do feixe de electrões. 16

17 Este microscópio permite obter imagens bidimensionais dos tecidos e que não transmitem a organização tridimensional (3D) dos componentes celulares. No entanto é possível construir a 3.ª dimensão partir de secções seriadas, sendo no entanto este processo muito lento e trabalhoso. Reconstrução tridimensional a partir de secções seriadas. Secções finas únicas algumas vezes levam a impressões erróneas. Neste exemplo, a maior parte das secções de uma célula contendo uma mitocôndria ramificada parecerá conter duas ou três mitocôndrias separadas. Além disso, as secções 4 e 7 podem ser interpretadas como uma mitocôndria em processo de divisão. Entretanto, a forma tridimensional real pode ser reconstruída a partir de secções seriadas. b) MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO DE VARRIMENTO/SCANNING (SEM) Felizmente há maneiras mais fáceis de obter imagens 3D. Uma delas é examinar uma amostra num SEM (scaning electron microscope), que é normalmente um aparelho menor, mais simples e mais barato do que um microscópio electrónico de transmissão. Enquanto que o microscópio electrónico de transmissão utiliza os electrões que atravessaram a amostra para formar a imagem, o microscópio electrónico de varrimento utiliza os electrões que são dispersos ou emitidos da superfície da amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado. É, então, varrida por um feixe de electrões bastante estreito. A quantidade de electrões dispersos ou emitidos sob a forma desse feixe primário, bombardeia cada ponto sucessivo da superficíe metálica sendo medido e usado para controlar a intensidade de um feixe, que se move em sincronia com o primeiro e forma a imagem bastante ampliada da superfície como um todo. Microscopia electrónica de varredura. Micrografia electrónica de varredura da estereocilia que se projecta de uma célula ciliada do ouvido interno de um sapo boi (A). 17

18 A técnica do SEM propicia uma grande profundidade de foco. Além disso, como a quantidade de dispersão de electrões depende do ângulo da superfície relativa ao feixe, a imagem tem brilhos e sombras que dão uma aparência tridimensional. Entretanto, somente características da superfície podem ser examinadas, e na maioria dos SEMs a resolução atingível não é muito alta. 18

19 REGRAS BÁSICAS PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ÓPTICO: 1 Sentar-se em frente ao microscópio numa posição correcta (altura da cadeira correcta, costas direitas) 2 Não tocar com os dedos na lente frontal 3 Não tocar com os dedos nas oculares 4 Não permitir que a lente frontal toque na preparação 5 Não usar objectivas de imersão a seco ou vice-versa 6 Não retirar as objectivas nem as oculares 7 Não forçar os parafusos de deslocamento 8 Quando necessário limpar as lentes com um pano macio ou papel macio com movimentos circulares e delineados 9 As lentes de imersão limpam-se com xilol ou álcool no fim da sua utilização 10 Colocar a lâmina na platina e imobilizá-la com as pinças 11 Costas direitas, mão esquerda parafuso macro e micrométrico, mão direita parafuso sobre a platina, caderno de notas lado direito (o contrário para quem prefere a mão esquerda) 12 Focar, primeiro com a objectiva mais baixa ex.: 10x, logo que o objecto esteja focado rodar o revolver de modo a que fique em posição a objectiva de 40x (ouvir um estalido), focar com o parafuso micrométrico 13 Quando se usa a objectiva de imersão é suficiente uma pequena gota de óleo. 14 Tirar as coordenadas 15 Quando terminar, desligá-lo da corrente, limpar as objectivas da platina e tapar o microscópio. 19

20 PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ÓPTICO E ELECTRÓNICO Os órgãos e tecidos dos diferentes seres vivos são, na maioria, muito espessos e precisam de ser reduzidos a cortes finos e suficientemente transparentes para poderem ser observados ao microscópio. Estes cortes são feitos em instrumentos denominados micrótomos (no caso de se querer estudar a estrutura ao Microscópio Electrónico ultramicrótomos). Obviamente que o que se quer observar ao microscópio é um preparado no qual os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando-se tanto quanto possível, o mais próximo, em estrutura e composição química daquela que possuíam quando vivos. A - PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ÓPTICO São variados os métodos de preparação de material citológico para observação ao microscópio de luz. Podemos considerar 3 grandes tipos: (i) (ii) (iii) preparações a fresco ou extemporâneas é um tipo de preparação que pode ser utilizada a qualquer momento, na medida em que permite uma observação rápida e imediata. Preparações definitivas sem inclusão- compreende uma série de etapas em que o material a observar tem que ser submetido a tratamentos para posterior observação, mas sem envolvimento de qualquer meio de inclusão. Preparações definitivas com inclusão que é uma das etapas da técnica que consiste em rodear a peça citológica de uma substância protectora e de suporte que permita facilmente fazer o corte. Para o material ser seccionado, tem que passar por uma série de tratamentos rigorosos e precisos, caso contrário, o complexo procedimento na preparação do material poderá ser em vão, com preparações que podem mostrar artefactos. Note-se que, apesar de todo este cuidado, o estado ideal (ou seja, observar o material como ele estava em vivo) não é 100% possível. Portanto, o objectivo é tentar ficar o mais próximo possível da realidade. 20

21 No caso de preparações definitivas com inclusão, a preparação de amostras para observação ao microscópio óptico compreende várias etapas: 1) Colheita 2) Fixação 3) Desidratação 4) Diafanização 5) Impregnação e Inclusão 6) Corte 7) Desparafinização e Diafanização 8) Coloração 9) Montagem 10) Rotulação Colheita A nível clínico as colheitas fazem-se a partir de biópsias ou a partir de material cadavérico. Pode também proceder-se a colheita de material proveniente de animais de laboratório. A partir do momento em que se procede à colheita começa de imediato a degeneração tecidual/celular. A colheita deve portanto ser rápida e para evitar os efeitos destruidores das suas próprias enzimas, deve imediatamente colocar-se a peça colhida numa solução fixadora. As condições de assepsia são também vitais caso contrário, os fungos, bactérias, etc, podem introduzir artefactos que podem alterar ou interferir com as estruturas. Qualquer que seja o material biológico o procedimento após a colheita é a fixação. Nota: Os animais utilizados no laboratório são criados e mantidos nos biotérios. Os mais utilizados são, sem dúvida, os ratinhos, os ratos, os hamsters e os coelhos. Se pretendermos recolher órgãos ou tecidos destes animais temos que em primeiro lugar SACRIFICAR o animal, normalmente por decapitação ou por deslocamento cervical. Depois do animal sacrificado, prossegue-se com a sua rápida dissecação e colheita do material. 21

22 Fixação Para se fazer uma preparação permanente que possa ser corada e visualizada ao microscópio, as células devem ser primeiramente tratadas com um fixador que as imobilize, mate, endureça e preserve. A fixação é, pois, a operação fundamental da técnica citológica e histológica, que pretende suspender rapidamente a actividade de todos os fenómenos vitais nomeadamente inibir a actividade das enzimas presentes na célula de maneira a impedir as alterações próprias da autólise e conservar as estruturas, tanto quanto possível, iguais às que existem em vida. Os fixadores actuam por coagulação dos colóides celulares, em particular pela precipitação ou desnaturação das proteínas. Porém, por muito ligeiras que sejam as alterações introduzidas, uma simples precipitação das proteínas celulares altera o estado de agregação molecular e vai, forçosamente, provocar alterações no estado físicoquímico da célula. Desta forma, o citoplasma fixado, no aspecto químico, físicoquímico e estrutural, nunca poderá ser exactamente igual ao que se apresentava em vida. A fixação será, portanto, tanto melhor quanto menores forem as alterações e os artefactos introduzidos. A fixação obriga ao uso de um processo que provoque a morte celular. Os agentes susceptíveis de exercerem acção fixadora são de natureza física ou química. São agentes físicos: o frio, o calor e a dessecação (desidratação por evaporação da água das células e espaços intersticiais). O frio, por si só, não é uma agente fixador, é antes um agente conservador que suspende ou evita temporariamente os processos autolíticos, os quais se restabelecem logo que a peça deixa de estar submetida às baixas temperaturas (é um dos elementos fixadores no método da congelação-dessecação freeze-drying). O frio é também utilizado como elemento endurecedor. Quando colocamos no frigorífico a carne e o peixe (temperatura abaixo de 4ºC) ou no congelador (temp abaixo de 0ºC), estamos a proceder a uma fixação por meio do frio. O calor seco (sob a forma de chama) ou húmido (sob a forma de fervura), são fixadores que tem utilização muito limitada. Para a fixação de esfregaços, é de uso corrente em bacteriologia passar as lâminas 2 ou 3xs pela chama do bico de Bunsen. A fervura em água ou num soluto químico (formol, por ex.) também se pode utilizar na fixação de fragmentos de órgãos, tecidos ou peças lesadas, quando haja urgência em proceder 22

23 rapidamente àquela operação. Mas, em ambos os casos, trata-se de métodos muito grosseiros e violentos que alteram profundamente a estrutura das células e que, por isso, nunca se empregam em citologia. A dessecação (agitação rápida no ar) de esfregaços de sangue acabados de realizar é, porém, um método de largo emprego em hematologia, o que não impede que, antes da coloração, o esfregaço seja submetido à acção de um fixador químico. De uso mais amplo são os métodos químicos da fixação. Nestes, empregam-se vapores de substâncias voláteis (fixação de esfregaços pelos vapores de ácido ósmico) ou a imersão dos fragmentos a estudar em 1) substâncias líquidas puras, como por exemplo o álcool, o formol ou paraformaldeído, a acetona, ou em 2) misturas (aldeídicas ou alcoólicas) de fixadores com diferentes poderes de penetração nas células., como por exemplo a mistura ácido acético glacial/metanol, o líquido de Bouin, o Líquido de Carnoy, o líquido de Helley, entre outros. Em termos químicos, a fixação torna as células permeáveis aos corantes e produz uma ligação cruzada entre as suas macromoléculas, permitindo que estas permaneçam estabilizadas e presas às suas posições naturais. De um modo geral, o fixador é escolhido de acordo com o tipo de estudo que se pretende realizar e com o tecido que se pretende preparar, havendo, para o efeito, estudos já realizados que aconselham determinados fixadores para fins específicos, nomeadamente para aplicação posterior de determinados corantes. O tempo de fixação é variável consoante o fixador usado e o tamanho da peça histológica. Este deve ser, sempre que possível, na ordem do centímetro para o microscópio óptico (e na do milímetro para a microscopia electrónica). Exemplos de misturas de fixadores no MO: Líquido de Buoin: 75 ml ácido pícrico precipitação proteínas 25 ml formol coagulação 5 ml ácido acético glacial com um bom poder de penetração, portanto muito bom para fixar o núcleo. Líquido de Carnoy: Álcool, clorofórmio e ácido acético 23

24 Desidratação É a fase preparatória para a inclusão. Tem como função retirar água e substituí-la por substâncias em que o meio de inclusão seja solúvel. As peças fixadas são passadas por uma série crescente de diferentes percentagens de álcóois. Ex.: 40%, 60%, 80%, 90%, 100%. Este procedimento deve ser cadenciado de modo a evitar artefactos e distorções causadas pela rápida remoção da água e substituição pelo álcool. Impregnação ou inclusão e o corte A maior parte das amostras de tecidos são demasiado espessas para permitirem que as suas células individuais sejam examinadas directamente a uma alta resolução. Portanto, após fixação, os tecidos são geralmente cortados em fatias extremamente finas (secções) com um micrótomo (micrótomo de Minot, ex), um aparelho com uma lâmina de metal afiada e no qual se regula a espessura do corte. As secções com o tecido (tipicamente com 1 a 10 µm de espessura) saem sob a forma de uma ténia e são colocadas sobre a superfície plana de uma lâmina de vidro. Mas os tecidos são geralmente macios e frágeis, mesmo após fixação, e precisam de ser embebidos em meios que os suportem, antes de serem seccionados. Os materiais normalmente utilizados neste procedimento são ceras, como a parafina. No fim da desidratação a peça contém etanol que terá que ser substituído por um líquido (intermediário) tanto miscível no etanol como em parafina, portanto, coloca-se a peça em xilol ou benzol. As peças embebidas nestes últimos solventes tornam-se translúcidas, razão pela qual esta etapa é denominada diafanização ou clareamento. 24

25 Mergulham-se então as peças em parafina fundida, geralmente a 60ºC no interior de uma estufa, durante algum tempo para que se dê a evaporação do resto do xilol e a parafina penetre adequadamente, a esta estapa damos o nome de impregnação ou embebição. De seguida, coloca-se a peça num molde (molde de Leuckart, ex) sobre o qual se derrama parafina fundida. Esta por arrefecimento solidifica, formando o bloco de parafina que está pronto para a etapa seguinte - o corte que é feito com um micrótomo. Existe um sério risco de que qualquer tratamento utilizado para a fixação e embebimento em blocos de suporte, possa alterar a estrutura da célula ou das suas moléculas constituintes de forma indesejável. O congelamento rápido proporciona um método alternativo de preparação que, até certo ponto, evita este problema eliminando a necessidade de fixação e embebimento no bloco de suporte para o material. O tecido congelado pode ser directamente seccionado com um criostato um micrótomo especial mantido numa câmara a baixa temperatura. Apesar de secções congeladas produzidas desta maneira evitarem alguns artefactos, elas sofrem outros problemas: as estruturas nativas de moléculas individuais, como proteínas, são bem preservadas, mas a estrutura fina da célula é frequentemente destruída pelos cristais de gelo. Após a preparação das secções, por qualquer um dos métodos, o próximo passo é proceder à sua coloração. Coloração Existem poucos constituintes no conteúdo das células (em que 70% do seu peso é água) para impedir a passagem dos raios de luz. Assim, a maioria das células no seu estado natural, mesmo se fixadas e seccionadas, são praticamente invisíveis em microscópios ópticos comuns. Uma forma de as tornar visíveis é corá-las. No início do séc. XIX, a procura de corantes para tingir tecidos, levou a química orgânica a um período fértil. Alguns coravam tecidos biológicos e, inesperadamente, mostravam, com frequência, uma preferência por partes específicas da célula por exemplo, o núcleo ou a mitocôndria tornando estas estruturas claramente visíveis. 25

26 Distinguem-se dois tipos de corantes: os ácidos (citoplasmáticos) e os básicos (nucleares). Estas designações nada têm a ver com o ph das suas soluções. Os corantes auxocromos aniónicos são ditos ácidos e os contendo auxocromos catiónicos- básicos. Estes últimos têm, portanto, afinidade para as estruturas contendo grupos aniónicos (por ex ácidos nucleícos: ditos estruturas basofílicas porque têm afinidade para os corantes básicos), e os corantes ácidos têm afinidade para as estruturas contendo grupos catiónicos (por ex. proteínas citoplasmáticas: ditas estruturas acidofílicas porque têm afinidade para os corantes ácidos). Os corantes básico e ácido mais utilizados são a hematoxilina e a eosina respectivamente. Actualmente existe uma enorme variedade de corantes orgânicos com nomes de cores como por exemplo o verde Malaquita, o preto Sudão (Sudan Black), o azul Coomassie, que apresentam afinidades específicas para determinados componentes subcelulares. No entanto, os fundamentos químicos para a especificidade de muitos corantes, não é conhecida. Antes de se efectuar a coloração dos cortes, estes terão que ser preparadas sendo sujeitos a uma i) desparafinização e a uma ii) hidratação. i) Desparafinização ou Diafanização consiste na remoção da parafina que rodeia a peça e é conseguida, mergulhando a lâmina com os cortes em xilol, tornando-os extremamente transparentes (diafanização). (ii) Hidratação Como a maioria dos corantes são aquosos, antes da coloração há que hidratar os cortes, ou seja, substituir o xilol por álcool e, de seguida, uma série crescente de percentagem de água. ic: 1:1 (Xilol:Álcool): 100% álcool, 80%, 60%, 40%, 20%, 0% A coloração na maior parte das vezes é dupla face às diferentes afinidades dos corantes. A relativa falta de especificidade dos corantes a nível molecular tem estimulado o desenvolvimento de procedimentos de coloração mais racionais e selectivos e, em particular, de métodos que revelem proteínas específicas ou outras macromoléculas na célula. É, entretanto, problemático obter-se uma sensibilidade adequada para este propósito. Como estão presentes numa determinada célula relativamente poucas cópias da maioria das macromoléculas, mesmo que o corante se ligue, poderá não ser visível ao 26

27 microscópio. Uma forma de se resolver este problema é aumentar-se o número de moléculas corantes associadas a uma única macromolécula. Assim, algumas enzimas podem ser localizadas nas células através da sua actividade catalítica: quando suprida com moléculas apropriadas do substrato, cada molécula da enzima produzirá muitas moléculas de um produto de reacção, localizado e visível. Uma abordagem alternativa, e muito mais frequentemente aplicável ao problema da sensibilidade, está associada ao uso de corantes fluorescentes. Estes corantes são detectados com o auxílio do microscópio de fluorescência em que a luz passa por dois conjuntos de filtros. O primeiro é seleccionado de forma que permita apenas a passagem de comprimentos de onda que excitem um determinado corante fluorescente, enquanto o segundo filtro bloqueia a passagem desta luz, permitindo a passagem somente dos comprimentos de onda emitidos quando o corante fluoresce. A microscopia de fluorescência é mais utilizada para a detecção de proteínas específicas ou de outras moléculas nas células e nos tecidos. Uma técnica bastante eficaz é a de juntar corantes fluorescentes a anticorpos, os quais funcionam como reagentes extremamente versáteis e altamente específicos para a coloração. Ligam-se, selectivamente, a macromoléculas específicas que reconhecem nas células ou na matriz extracelular. Dois corantes fluorescentes comummente usados para este fim são a fluoresceína, que emite uma fluorescência verde intensa, quando excitada com luz azul, e a rodamina, que emite uma fluorescência vermelha quando excitada com luz amarela-esverdeada. Juntando-se um anticorpo à fluoresceína e outro à rodamina, a distribuição de diferentes moléculas pode ser comparada numa mesma célula; as duas moléculas são visualizadas separadamente ao microscópio, alternando-se os dois conjuntos de filtros, cada um específico para cada corante. Métodos mais modernos possibilitam a utilização da microscopia de fluorescência para monitorizar mudanças na concentração e localização de moléculas específicas dentro de células vivas. Montagem Depois da coloração e colocação dos cortes nas lâminas há que adicionar aos cortes um meio conservador que não altera as estruturas do material. Se o meio de montagem é miscível com a água pode logo colocar-se o meio de montagem sobre os cortes após a coloração e de seguida a lamela. O índice de refracção 27

28 do meio de montagem deve ser igual ao vidro. Se o meio de montagem não é miscível com a água é preciso extrai-lo com um dissolvente. Como muitas vezes se usa um meio de montagem sintético, DPX, o procedimento é simples. Basta uma rápida desidratação em 95% álcool seguida da colocação de gota de DPX e por último a lamela. Este meio seca rapidamente pelo que a preparação pode ser imediatamente observada ao microscópio. Os meios de montagem têm a vantagem de endurecer o material conferindo-lhe um índice de refracção homogéneo em relação ao vidro da lâmina e da lamela. As preparações assim obtidas não se deterioram e chamam-se definitivas. Rotulação Deve ter indicações sobre os procedimentos, dados do paciente e da amostra. Exemplo de rotulação de uma lâmina: Esq. Nome paciente Órgão Data da montagem Dir. Fixador Corante nº ordem preparação 28

29 PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBSERVAÇÃO AO MICROSCÓPIO ELECTRÓNICO No início da sua aplicação para materiais biológicos, o microscópio electrónico revelou muitas estruturas da célula, previamente inimagináveis. Os microscopistas electrónicos tiveram que desenvolver novos procedimentos para embutir, cortar e corar os tecidos. A preparação de amostras para observação ao microscópio electrónico compreende assim várias etapas fundamentais: 1) Colheita 2) Fixação 3) Desidratação 4) Inclusão 5) Corte 7) Contrastação Colheita Os cuidados a ter com a colheita do material biológico são as mesmos referidos para a colheita de material para observação ao microscópio óptico. No caso da microscopia electrónica a peça a ser processada é mais pequena (na ordem dos milímetros) do que na microscopia óptica (na ordem dos centímetros). Fixação Como a amostra é exposta a vácuo muito forte no microscópio electrónico, não é possível analisá-la viva. Os tecidos são normalmente preservados por fixação química, sendo o processo feito em duas etapas: (I) Fixação com glutaraldeído e paraformaldeído que faz com que as moléculas de proteínas façam ligações covalentemente cruzadas com os seus vizinhos. (II) Pós-fixação com tetróxido de ósmio, que se liga e estabiliza as bicamadas lipídicas, assim como as proteínas. Tem um fraco poder de penetração, mas é um bom fixador do citoplasma. 29

30 Desidratação É a fase preparatória para a inclusão, tendo como finalidade retirar água e substitui-la por substâncias em que o meio de inclusão seja solúvel. Para conseguir este objectivo colocam-se as peças em séries de álcool a começarem numa baixa concentração e progredindo gradualmente. Ex.: 10%, 20%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% (em vez de álcool pode também usar-se óxido de propileno). Inclusão Consiste em embeber e envolver as peças numa substância cuja consistência é a mais apropriada para se obter cortes. Os meios de inclusão mais frequentemente utilizados são resinas do tipo: Epon, Analdite ou Spurrs. O material biológico é primeiro incubado numa mistura de resina e solvente (álcool ou óxido propileno) e deixado num rotor aproximadamente 1-2 horas para que gradualmente a resina preencha espaços. Esta mistura é por fim substituída pela resina. O material biológico é posto em moldes, rotulados e numerados, que são cheios de resina e vão a polimerizar, formando um bloco sólido de plástico. Conforme o meio de inclusão assim a temperatura e o tempo de polimerização. Ex.: Epon 60ºC horas Spurrs 60-70ºC 8-15 horas Corte Tendo os electrões um poder de penetração muito limitado, os tecidos fixados têm, normalmente, que ser seccionados em secções extremamente finas (50 a 100 nm de espessura cerca de 1/200 da espessura de uma célula individual) antes de serem observados. Para realizar estes cortes utiliza-se o ultramicrótomo. Os cortes fazem-se utilizando facas de diamante ou mais vulgarmente de vidro. Estas últimas podem ser feitas usando uma régua de vidro com uma determinada espessura que é cortada num Knife maker. 30

31 Para realizar os cortes, coloca-se a cápsula já aparada num braço do ultramicrótomo que se desloca em movimentos verticais de cima para baixo. De modo a seleccionar a zona de interesse para observar ao microscópio electrónico, faz-se inicialmente uma série de cortes semi-finos (com cerca de 1µm de espessura) que são colocadas numa lâmina e corados com azul de toluidina para assim se observarem ao Microscópio Óptico. Este procedimento repete-se até a zona desejada ser atingida, altura em que se começam a fazer cortes ultra finos (espessura nm) que são transferidas para a grelha. Estas secções finas, livres de água e outros solventes voláteis, posicionadas na grelha estão prontas a serem contrastadas para posterior observação ao microscópio. As grelhas são geralmente de cobre podendo para casos específicos, usar-se as de ouro. As grelhas são referenciadas conforme o número de orifícios da sua malha, isto é, há grelhas de 100, 200, 500 etc. Quando se utilizam grelhas com uma malha maior é comum usar um filme de Formavor a cobrir a estrutura e assim poder suportar em cima os cortes. Contrastação O contraste no microscópio electrónico depende do número atómico dos átomos presentes na amostra: quanto maior o número atómico mais electrões são dispersos e o contraste é maior. Moléculas biológicas são compostas de átomos de número atómico muito baixo (principalmente carbono, nitrogénio e hidrogénio). Para torná-las visíveis, elas são geralmente impregnadas (antes ou geralmente após o seccionamento) com sais Nalguns casos, macromoléculas específicas podem ser localizadas em secções finas por técnicas adaptadas da microscopia óptica. Certas enzimas presentes nas células podem ser detectadas através de incubação da amostra com um substrato cuja reacção leve a uma deposição localizada de um precipitado electrodenso. Alternativamente, podem ser acoplados anticorpos a uma enzima indicadora (usualmente peroxidase) ou a um marcador eletrodenso (usualmente pequeníssimas esferas de ouro metálico conhecidas 31

32 como partículas de ouro coloidal ), usados para localizar as macromoléculas que os anticorpos reconhecem. 32

33 COMPARAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS TÉCNICOS DE PREPARAÇÃO DO MATERIAL BIOLÓGICO PARA OBSERVAÇÃO AO MO OU ME MO Fragmento pequeno na ordem do cm Colheita ME de Transmissão Fragmento pequeno na ordem do mm Geralmente Fixadores químicos simples ou misturas de fixadores com diferentes poderes de penetração Fixação Fixação com gluteraldeído e paraformaldeído Pós-fixação com tetróxido ósmio Séries de álcool ± 5 diferentes percentagens. Desidratação Séries de álcool ± 10 diferentes percentagens Diafanização Parafina Inclusão Resinas (epon, araldite, etc.) Micrótomo Espessura 1 a 10µm Cortes Ultramicrótomo Espessura 50 a 100nm Lâmina vidro Desparafinização Hidratação Coloração Desidratação Montagem Suporte Grelha de cobre Contrastação (acetato de uranilo e citrato de chumbo) Microscópio Óptico Observação Microscópio Electrónico 33