PERGUNTAS DE GENÉTICA

Transcrição

1 PERGUNTAS DE GENÉTICA Que tipo de mutações causa o 5-bromouracilo? Transições Imprinting genómico regulação epigenética Genes repórter genes que permitem detectar promotores Enhancer cadeias de DNA não codificantes RNA guias - RNA editing FALSA: é necessária hidrólise de GTP no final da tradução Anel deslizante - processividade da enzima FALSA: na cadeia de DNA as bases azotadas estão para fora Mutações que criam codão stop - nonsense Chromossome walking refere-se a Isolamento de fragmentos de DNA adjacentes Para a identificação de um gene com anticorpos - necessário que ele esteja clonado num vector de expressão No operão do triptofano - ocorre atenuação quando os ribossomas sintetizam completamente um péptido leader FALSA: A enzima RecA participa no mismatch repair Imunoglobulinas - variabilidade por causa dos arranjos do DNA FALSA: oncogenes precisam de ter os dois alelos activados para causar tumores FALSA: basta um gene supressor de tumores defeituoso para causar cancro Inversão DNA recombinação específica entre sequências repetidas Transposões bacterianos regulação por moléculas de RNA FALSA: hepnavirus tem RNA de dupla hélice Letalidade sintética 2 mutações que quando ocorrem ao mesmo tempo são letais para o ser vivo cii provoca a lisogenização do fago lambda porque activa ci Yeast two hybrid system detectar interacções entre proteínas Heteroduplex resulta do fenómeno de migração dos ramos Pergunta de RNA riboswitch e outra RNAi PRÁTICA

2 I. Pergunta sobre características dos plasmídeos (indicar a falsa) Têm grande peso molecular II. Alínea certa: 0,5 ml em 1 hora III. 2 enzimas. A: 4, 3, 3 kb. B: 2.5 e 7.5 kb a. Mapa de restrição: 2.5/1.5/3/3 b. Ligase unia o DNA (ficava circular) e depois usava-se novamente as enzimas de retrição. Indicar os fragmentos obtidos: 1.5, 3 e 5.5 kb IV. Pergunta escolha múltipla sobre o PCR: alínea sobre os oligonucleótidos V. Pergunta sobre trabalho de 2-AP. 2 estirpes mutadas no operão lacz (original é CTA) não conseguem fazer metabolismo de lactose. São tratados com 2-AP (mutagéneo), para tentar que ela reconverta os genes mutados para a forma original. Depois as estirpes são colocadas num meio com lactose para ver se ocorreu mutação de volta ao normal a. Calcular a taxa de reversão para as 2 estirpes ESTIRPE A: 2 colónias ESTIRPE B: 35 colónias Concentração: 10 8 UFC/ml Volume: 0.1 ml A: 2/(10 8 x 0.1) = 2 x 10-7 B: 35/(10 8 x 0.1) = 3.5 x 10-6 b. GENE ORIGINAL: CTA GENE POSSÍVEL PARA A: CGA (ou uma transversão equivalente) GENE POSSÍVEL PARA B: CCA (ou uma transcrição equivalente) 2-AP só reverte transições. Como a estirpe B tem mais colónias, significa que houve mais reversões, ou seja a estirpe B tem um gene que sofreu transição em relação ao original. Estirpe A tem poucas colónias, isto significa que a 2-AP não conseguiu reverter, logo o gene de A sofreu uma transversão (ou adição/delecção de pares de bases, ) em relação ao gene original (NUNCA UMA TRANSCRIÇÃO). As 2 colónias que aparecem foram devidas a mutações espontâneas. c. Taxa de resistência à rifampicina (antibiótico) é igual ou diferente nas 2 estirpes? É igual. Estirpes são iguais excepto no gene que metaboliza a lactose (lacz). Como os genes que conferem resistência à rifampicina não estão no

3 gene lacz, a probabilidade de ocorrer uma mutação espontânea que confira resistência ao antibiótico é igual nas 2 estirpes. VI. Tem a ver com o trabalho prático nº 6 TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS BACTERIANAS COM DNA PLASMÍDICO (aconselho a ver o trabalho e os cálculos efectuados na aula, porque esta parte está incompleta) a. Calcular a eficiência de transformação: 1.4 x 10 6 b. (Pergunta incompleta) Houve uns que foram colocados num meio com 1 antibiótico (cresceram 700) e outros que foram colocados num meio com 2 antibióticos (cresceram 250). 700 corresponde ao nr total e 250 ao número de transformados (que são resistentes ao s 2 antibióticos). Era para calcular uma taxa: 250/700 = 36%

4 1. O método para replicar as extremidades 5 do DNA Utilizar proteínas como primers. 2. O GTP é necessario para finalizar a tradução Esta era a falsa. Esta era verdadeira: Os procariotas não possuem mecanismos de reparação de RNA. 3. Reparação mismatch implica síntese de novo de DNA. É realizada pela muts. 4. RNA riboswitch forma estruturas secundárias alternativas que regulam a expressão genética. 5. Letalidade sintética Uma mutação de 2 genes num individuo causa letalidade. 6. Degeneração do código genético Quando um aminoácido é codificado por mais de um codão. 7. Chromossome walking consiste no isolamento de fragmentos de DNA adjacentes. 8. Nos procariotas não são necessários tantos factores de iniciação, mas são necessários mais factores de terminação do que nos eucariotas. 9. No emparelhamento wobble um nucleótido na posição 5 do anticodão emparelha com diferentes nucleótidos na posição 3 do mrna. 10. O 5 bromouracilo - possibilidade de reversão de mutações com 2-AP. 11. Nos eucariotas, a origem de replicação só se usa uma vez, porque a formação dos complexos necessários ocorre em diferentes fases. 12. O anel deslizante garante a processividade de enzimas gene repórter serve para estudar promotores de outros genes. 14. A adição de nucleótidos a moléculas de mrna é conhecido como - RNA Editing. (Os RNA guias estão envolvidos no processo de RNA Editing). 15. Na regulação da tradução do mrna para a ferritina os elementos de resposta ao ferro devem encontrar-se na região 5 do mrna. 16. DNAse I Envolvida na marcação radioactiva de DNA Brometo de etídio é um intercalante. Provoca mutações frameshift. 18. O modelo de holliday permite explicar a formação de heteroduplexes na recombinação homóloga. 19. Para identificar um gene por hibridação Utiliza-se uma sonda de DNA homólogo. 20. Para identificação e isolamento de genes de um banco de cdna por meio de anticorpos é necessário utilizar um vector de expressão. 21. A repressão catabólica Refere-se a uma regulação positiva de vários operões bacterianos. 22. No ciclo de vida do fago lambda o repressor ci é auto-regulado 23. No operaão do triptofano ocorre atenuação quando os ribossomas sintetizam completamente um péptido leader. 24. Na regulação do ciclo de vida do fago lambda Um activador cii pode determinar a lisogenizaçãod por induzir a expressão do repressor ci, que mantém o ciclo lisogénico e regula a sua própria expressão (é auto-regulado). (Na regulação do ciclo de vida do fago lambda a inserção da proteína cro é essencial para o ciclo lítico).

5 25. A rifampicina inibe a transcrição nos procariotas e a puromicina é semelhante à aminoacil-trna. 26. Os insulators e os enhancers - são sequencias de DNA não codificantes. 27. A base química da marcação parental é a metilação do DNA. 28. Yeast-two hybrid system serve para estudar interacções entre proteinas em 2 organismos. 29. Uma mutação em que um codão é alterado para um codão de terminação chama-se nonsense. 30. Sobre os vírus, indique a falsa - O hepadnavirus é do tipo (acho que dizia 3). É falsa porque é do grupo 7-não tem RNA de dupla helice 31. Nos sistemas de reparação SOS a proteína RecA é activada pelos danos de DNA (a RecA tem actividade exonucleolítica; um repressor é inactivado por acção da RecA). 32. A inversao do segmento de DNA pode ocorrer por recombinação local especifica entre sequencias repetidas. 33. A região cariável VDJ obtém-se por Rearranjo de DNA. 34. Ambos os genes supressores de tumores têm de estar alterados para provocar tumores. 35. Apenas um proto-oncogene alterado pode provocar tumor. 36. Durante a integração de um transposão de DNA num cromossoma ocorre duplicação de pequenas sequencias das extremidades do transposão. 37. RNA de interferência apenas se verifica em células infectadas por vírus. 38. A transposição de elementos genéticos promotor bacteriano activação alostérica induz alterações conformacionais na RNA polimerase. 39. Exercício sobre unidades enzimáticas e DNA - (0,5uL numa hora) 40. Um plasmídeo tem alto peso molecular falsa (tem entre pares de bases, o que é um baixo peso). Tens de saber as características de um bom plasmídeo. 41. Na técnica de PCR - os primers estão em cadeia dupla --> Falso (em cadeia simples, são pequenos fragmentos). 42. Fragmentos lineares (uma enzima com 3 + uma enzima com 2), pede para desenhares o mapa de restrição de cada uma das enzimas e depois das 2 juntas. Depois, usa-se uma enzima (DNA ligase) para ligar as pontas do fragmento que obtiveste a partir do corte conjunto das 2 enzimas anteriores (fica um redondo, obviamente) e pede para fazeres o mapa de restrição. EXERCICIO: SEMELHANTE AO 1 DO EXAME DE 21 DE JULHO DE (TRABALHO PRATICO Nº1) 43. Calcular frequências de mutantes: dava-te o número total de células viáveis, que era 10^8 (dizia: densidade de células para enganar ). E depois dava-te o número de células no meio LB e no meio LB+2AP (era o trabalho 1, basicamente). A única coisa que precisavas de saber é que: Frequencia de mutação induzida = (numero de células mutantes no meio com 2AP) / (numero de céluals viáveis).(se for mutação espontânea é sem a 2AP). Tens é de ter em atenção as unidades do volume. 44. Tens 2 espécies de bactérias que têm um codao X que foi mutado e por isso não conseguem degradar a lactose, e a forma original (selvagem) desse codão era, por exemplo CTA. Inseriste as bactérias no meio com 2AP, e a espécie A conseguir degradar a lactose, e a espécie B continuava a não degradar. Pergunta: Dá um exemplo de codão X para cada uma das espécies e justifique. Resposta: Tinhas de dizer que a 2-AP realiza transições (eu

6 escrevi transcrições nos meus apontamentos, mas enganei-me) de um par purina-pirimidina para outro par purinapirimidina (ou seja, GCAT em que o G troca pelo A e o C troca pelo T). Logo, a espécie A tinha por exemplo um TTA (e com a 2-AP o primeiro T ficou C, logo, a 2-AP reverteu a mutação no codão). E na estirpe B tinhas por exemplo um GTA (como a 2-AP não troca o G pelo C, não vai haver reversão da mutação no codão). 45. Noutra alínea do exercício anterior, perguntava se em vez de se utilizar um meio normal (LA), se se usasse meio com rifampicina (LA+Rif), o resultado seria igual para as 2 estirpes quando comparados os meios LB e meio LB + 2AP (R: sim, porque a rifampicina inibe a transcrição, logo não importa se a estirpe A tem um codão X diferente da estirpe B, porque esse codão não vai ser transcrito) Mas é melhor leres a explicação da prof que tão no caderno dos trabalhos práticos a folha que ela colocou na net. EXERCICIO SEMELHANTE AO 4 DO EXAME DE 21 DE JULHO DE 2004 (TRABALHO PRÁTICO Nº6) 46. Exercício para calcular a eficiência de transformação e a percentagem de recombinantes. (igual ao exercício 4 do exame de 11 de Julho de 2002 e ao exercício 5 do exame de 16 de Julho de 2007). 47. Outra alínea do mesmo exercício perguntava sobre os plasmídeos (pbr322 e o pembl) e o que é que fazia o CAT, para justificar.

7 I. Parte Teórica 1. FALSA: DNA tem bases para fora (DNA tem bases para dentro) 2. Letalidade sintética: quando 2 mutações que ocorrem em simultâneo são letais para o ser vivo (A letalidade sintética descreve uma condição celular na qual duas (ou mais) mutações não alélicas e não essenciais, que não são letais individualmente, tornam-se mortais quando presentes na mesma célula) 3. O 5-bromo-uracilo actua como mutagéneo porque provoca é transiçoes [possibilidade de reversão de mutações de 2-AP](O 5-bromo-uracilo induz mutação por transição, ou seja, substitui uma base nucleótida por outra, como por exemplo: A base A-T é substituida por C-G ou C-G é substituída por A-T) 4. Alteração de Codão codificante para codão STOP chama-se nonsense. (nonsense: é uma mutação com uma mudança de cadeia de uma sequência de DNA que resulta num codão Stop prematuro ou um codão nonsense no mrna (que possivelmente poderá vir a formar um truncamento e muitas vezes uma proteína não funcional) 5. FALSA: Rec A não está no mismatch repair (O DNA mismatch repair é um sistema que reconhece e repara erros de inserção, deleção de bases que podem ocorrer durante a replicação e a recombinação do DNA) 6. Transcrição mrna procariotas para acabar: envolve o corte de transcritos iniciais 7. Insulator sequência DNA: tem influência na codificação dos genes [sequências que podem impedir a repressão pela heterocromatina] (Um insulator desempenha duas funções distintas na expressão do gene: tanto pode actuar como enhacer ou promotor de bloqueio ou mais raramente, como barreira contra proteínas de cromatina condensada.) 8. Imprinting- epigenético (é um fenómeno no qual certos genes são expressos apenas por um alelo, enquanto o outro é metilado (inactivado) 9. Degeneração do código genetico- uma a.a codificada por diferentes codões (A degeneração consiste num aminoácido codificado por diferentes codões. Contudo, não existe nenhum codão que possa codificar mais que um único aminoácido) 10. Relativamente à tradução, a falsa é a hidrólise do Gtp associado a proteínas é necessário para finalizar a tradução. 11. Rna guia estão envolvidos em que processo editing [apenas se verificam em células infectadas] (RNA guia é uma molécula que participa na edição de mrna, pareando em ambos os lados da região a ser editada. O mrna editado é complementar ao RNA guia) 12. Rnai - pequenas porções de Rna que se ligam (...)[apenas se verifica em células infectadas por vírus] (O RNAi = RNA interferência é um mecanismoa exercido por RNA complementar a mrna, o qual inibe a expressão génica na fase da tradução ou dificulta a transcrição de genes específicos) 13. Enhancer: sequência DNA não codificante (Enhancer é uma pequena região de DNA onde se poderá ligar proteínas de modo a melhorar a transcrição de genes) 14. Yeast-two-hybrid: detecta proteínas que interagem entre si (é uma técnica que detecta interação entre proteínas e entre proteína-dna) 15. Transcrição Extremidade 5': envolve RNAusa-se primers 16. Anel deslizante: grande processividade enzimas 17. Origens de replicacao: diferentes fases ciclo celular 18. Os ribonucleotidos são discriminados pelas DNA plimerases porque não ficam correctamente posicionados 1

8 19. Heteroduplexes -resultam do fenómeno de migração dos ramos ( A heteroduplex é uma dupla molécula de ácido nucleico. Tem origem na recombinação genética, através de moléculs simples como cromossomas homologos our mesmo de organismos diferentes. Um exemplo de formação de heteroduplexe é em processos de hibridização ou em ácidos nucleicos não análogos naturalmente que são usados para juntar ácidos nucleicos) 20. Na inversão de um segmento de DNA- pode ocorrer recombinação especifica 21. A regulação da transposição- efectua-se por iniciação de replicaçao de RNA (transposiçãoelementos genéticos móveis que são capazes de mudar de posição dentro do cromossoma ou de um cromossoma para o outro) 22. A transposição de elementos genéticos, promotor bacteriano, activação alostérica- induz alterações conformacionais na rna polimerase 23. (no operão) Triptofano- ocorre atenuação quando os ribossomas sintetizam completamente um peptideo leader (O operão triptofano é inibido pelo triptofano. Contém um gene promotor que se liga à RNA polimerase e um repressor, que ao sintetizar proteína, esta poderá ligar-se ao operador que, de seguida faz com que a transcrição seja bloqueada. O processo de atenuação complementa esta ação regulatória.) 24. na lisogenização do fago lambda- um activador cii pode determinar a lisogenização do fagdo lambda por induzir a expressão do repressor ci 25. para identificar e isolar genes por meio de anticorpos é necessário utilizar um vector de expressão 26. cromossome walking- isolamento de fragmentos de DNA (usa-se este termo quando sabemos uma sequência genética, mas não temos um clone do gene) 27. RNA riboswitch forma estruturas secundárias alternativas que regulam a expressão genética (Riboswitches são domínios complexos enovelados de RNA que servem como receptores para metabólitos específicos. Estes domínios são encontrados em regiões não codificadoras de proteínas de vários mrnas, que controlam a expressão génica de diversos genes através de mudanças estruturais do mrna provocadas pela ligação com o metabólito. Existem em procariontes e eucariontes que estão envolvidos na regulação de processos metabólicos fundamentais e ficam localizados quase que exclusivamente em regiões não codificadoras de proteínas na porção 5. São compostos por dois domínios funcionais) 28. Proteinas sintetizadas no citosol são transportados por mecanismos: transmenbranares. 29. Assinale a errada: a maioria dos cancros é hereditária 30. Genes repórter- estudar promotores de outros genes (Um gene reporter é um gene que é utilizado para estudar um outro gene. Esses genes são escolhidos por serem fáceis de medir e identificar) 31. Assinale a errada-o vírus da hepatite B, grupo 7, epdanovirus, rna dupla hélice infecta os hepatocitos 32. região variável VDJ obtém se por-rearranjo de DNA II. Parte prática: 1. Em relação as as características típicas dos plasmídeos usados em clonagem, qual a opção falsa: possuem cadeia simples e alto peso molecular 2. Unidades enzimáticas e DNA: 0,5 ul/1h Grupo I Verdadeiros e falsos: A tac polimerase é uma enzima das termas e e resistente a altas temperaturas V 2

9 O tampão regula o ph e a concentração de sais V A sequencia do PCR V Os primers são oligonucleotidos V A formula da temperatura 4 e 2 estao trocados F Grupo II V F (clorofenicol) V: vermelhos V: amarelos Estudar Pembel cat SABER: 5-Bromouracilo: análago da timina, em estado raro emparelha com a guanina 2- Aminopurina: análogo da adenina, no estado raro emparelha com a citosina Cloramfenicol: Reação peptidil transferase Rifampicina: iniciação de RNA (liga RNA polimerases) Agentes intercalantes: (inserem-se entre bases adjacentes mutações frameshift) Proflavina Acridina Brometo de Etidio 3