Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I 1.º Ano do Mestrado Integrado de Medicina EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Bioquímica I 1.º Ano do Mestrado Integrado de Medicina EXTRACÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS TURMA 6 ANO LECTIVO 2010/2011

2 Sumário Com esta actividade experimental pretendeu-se fazer a extracção e quantificação do DNA genómico presente numa amostra de sangue. Para tal procedeu-se à extracção do DNA com uma solução salina e à sua quantificação por espectrofotometria.

3 Objectivos Extrair o DNA genómico de uma amostra de sangue periférico. Fazer a quantificação do DNA extraído por espectrofotometria, fazendo a leitura da densidade óptica a 260nm e 280nm. Analisar os processos de extracção e quantificação do DNA.

4 Introdução Nucleótidos São ésteres fosfóricos dos nucleósidos - Pentose (desoxirribose ou ribose) - Base azotada - molécula de ácido fosfórico Constituintes fundamentais dos ácidos nucleicos: DNA e RNA. Fazem parte da estrutura de coenzimas, participando em reacções do metabolismo energético celular. Participam em mecanismos de conservação, replicação e transcrição de informação genética.

5 Introdução Ácidos nucleicos Resultam da polimerização de muitos nucleótidos São macromoléculas importantes no controlo celular, pois são responsáveis pelo armazenamento e transmissão da informação genética, que é expressa sob a forma de proteínas. DOIS TIPOS FUNDAMENTAIS: DNA ácido desoxirribonucleico RNA ácido ribonucleico mrna (mensageiro) trna (transferência) rrna (ribossómico)

6 Introdução Propriedades dos Ácidos nucleicos: Solubilidade: São insolúveis em solventes orgânicos, pouco solúveis em ácidos diluídos, moderadamente solúveis em água e muito solúveis em soluções salinas diluídas. Podem ser degradados por hidrólise química (alcalina) ou enzimática (endonucleases). Absorvem radiação UV a 260nm. Separados por cromatografia em coluna, ultracentrifugação ou por electroforese em gel.

7 Introdução Formas de detecção dos Ácidos nucleicos: ESPECTRO DE ABSORÇÃO DEFINE-SE NA ZONA DA RADIAÇÃO UV com absorção máxima a 260 nm. EFEITO HIPERCROMÁTICO. Reagem com DIFENILAMINA formando um complexo corado azul por ligação à desoxirribose e aquecimento (detecção a 600 nm). Reagem com solução de ORCINOL na presença de FeCl 3 e aquecimento formando um complexo amarelado por ligação à ribose (670 nm).

8 Introdução RNA ÁCIDO RIBONUCLEICO Cadeia simples. A pentose é uma ribose. Apresenta-se como sendo material genético de vírus, bactérias e seres vivos. 3 formas: - mrna (codifica a informação genética do DNA) - trna (traduz a sequência de bases do mrna em aminoácidos) - rrna (combinado com proteínas forma os ribossomas- síntese proteica) rrna mrna trna

9 Introdução Propriedades físico-químicas do RNA: Solubilidade: Solúvel em soluções salinas diluídas. Desnaturação química (alcalina), física (aquecimento) e enzimática (ribonucleases). Separáveis por ultracentrifugação e por cromatografia.

10 Introdução DNA ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO Tem forma de dupla hélice, com duas cadeias complementares e antiparalelas unidas por pontes de hidrogénio (A=T, C=G). Aparecimento das cadeias de 5 ->3 pela DNA Polimerase. Organização no núcleo sobre a forma de cromatina, que é DNA associado a histonas. PRINCIPAL FUNÇÃO Contém informação genética que é transcrita, formando-se mrna. Este é traduzido pelos ribossomas originando proteínas que têm funções específicas na célula.

11 Introdução Peso molecular elevado. Viscosidade. Propriedades físico-químicas do DNA: Dupla hélice desnaturada por: temperatura, ph extremo, ureia e foramina, enzimas. Desnaturação depende do número de bases e a renaturação é espontânea. Susceptível de hidrólise ácida suave e não é hidrolisado por bases diluídas; pode sofrer hidrólise enzimática (desoxirribonucleases e endonucleases). Não forma intermediários cíclicos. Liga iões Mg 2+ e Ca 2+.

12 Introdução RNA vs. DNA RNA DNA Nome Ácido ribonucleico Ácido desoxirribonucleico Bases Azotadas Adenina, Uracilo, Guanina e Citosina Adenina, Timina, Guanina e Citosina Pentose Ribose Desoxirribose Estrutura/ Hélice simples dupla

13 Introdução EXTRACÇÃO DO DNA CONDIÇÕES FUNDAMENTAIS: Pureza molecular; Pipetagens de Precisão; Esterilidade dos Materiais; Cuidados no manuseamento, e material de protecção. Extracção com solução salina (NaCl 5,3 M) para remover as proteínas da amostra É fundamental para a obtenção de DNA com qualidade para ser analisado por PCR

14 Introdução QUANTIFICAÇÃO DO DNA A QUANTIFICAÇÃO DO DNA PODE SER FEITA POR: ESPECTROFOTOMETRIA Processo análogo ao DNA: λ=260nm FLUORIMETRIA Utilização de corantes fluorescentes (ex: RiboGreen) Permite a detecção e quantificação de pequenas quantidades de RNA. COMPARAÇÃO DE BANDAS (GEL).

15 Introdução QUANTIFICAÇÃO DO DNA SOLUÇÃO (extrato de DNA + H₂O mili-eq estéril) AGITAÇÃO Espectrofotometria (Cuvette de Quartzo) λ= 260 nm λ= 280 nm Avaliar a quantidade de DNA Estimar a contaminação de proteínas

16 Introdução QUANTIFICAÇÃO DO DNA Menor que 1,5 Entre 1,5 e 2,0 Maior que 2,0 Contaminação com proteínas Amostra de DNA com pureza adequada Contaminação com RNA [DNA] (mg/ml) = DO260 x 0,05 x factor diluição

17 Material REAGENTES Tampão A (Tampão de lise dos glóbulos vermelhos) Tampão B (Tampão de desproteinização) SDS 10% Solução de Proteinase K (20mg/ml) NaCl 5,3M Isopropanol frio ou Etanol 70% frio Tubos de Eppendorf Pipeta de Pasteur Tubos de ensaio Pipetas graduadas Pompete Vortex

18 Procedimento EXTRACÇÃO DO DNA Adicionou-se 1 volume de tampão A e 2 volumes de H 2 O MilliQ estéril a 4ºC. Submeteu-se a vortex moderado durante 30 segundos. Incubou-se em gelo durante, no mínimo, 3 minutos. Centrifugou-se a 3500 rpm, durante 15 minutos, a 4ºC. Removeu-se o sobrenadante. Centrifugou-se novamente a 3500 rpm, durante 15 minutos e a 4ºC. Retirou-se o sobrenadante. Adicionou-se 5 ml de Tampão B e 500 µl de SDS. Submeteu-se a vortex forte, durante 30 a 60 segundos Adicionou-se 50 µl de solução de Proteinase K (20 mg/ml). Incubou-se a 55ºC durante 1 a 2 horas. Colocou-se em gelo durante 2 a 3 minutos. Adicionou-se 4 ml de solução saturada de NaCl, sujbmetendo-se novamente a vortex. Centrifugou-se a 4500 rpm durante 15 a 20 minutos a 4ºC. Transferiu-se o sobrenadante cuidadosamente para um tubo limpo. Adicionou-se um volume de isopropanol frio (guardado a -20ºC) igual ao volume de isopropanol que fica no tubo. Removeu-se a medusa com uma pipeta de Pasteur para um tubo eppendorf 1,5 ml e lavou-se com 1 ml de etanol frio a 70%.

19 Resultados Não procedemos à QUANTIFICAÇÃO DO DNA, apenas o observamos. Quociente < 1.5 Quociente > 2 Sim 1 - EXISTE CONTAMINAÇÃO? 1,5 Quociente 2 Não 2 QUANTIFICAÇÃO [DNA] (mg/ml) = DO260 x 0,05 x factor diluição

20 Discussão PROCEDIMENTO RESULTADOS Os eritrócitos não têm núcleo nem mitocôndrias, logo não têm DNA. Para além disso, têm hemoglobina que, sendo uma proteína, pode danificar a qualidade da amostra. Assim sendo, os eritrócitos foram removidos, adicionando, para tal, o tampão A, que provoca a sua lise. Arrefecimento da solução de extracção diminuiu a ruptura das moléculas de DNA. Após a centrifugação, o que constituia o sobrenadante eram proteínas e células destruídas, daí este ser eliminado da amostra, ficando apenas o sedimento. Quanto mais clara for a cor do sedimento, maior será a sua pureza.

21 Discussão PROCEDIMENTO RESULTADOS As restantes proteínas foram removidas pelo tampão B, já que a sua função é a desproteinização. O detergente (SDS) provocou a lise das membranas celulares (incluindo nucleares) e desnaturou proteínas. A solução de Proteinase k utilizou-se para destruir as proteínas. O cloreto de sódio (NaCl) precipitou as proteínas e excluiu o DNA. O álcool (isopropanol/etanol) forçou o DNA a precipitar e a sair da solução. NOTA: - As plaquetas não têm núcleo, mas, como têm mitocôndrias, são relevantes para a quantificação do DNA. O RNA está em todas as partes da célula e é degradado muito facilmente, não sendo necessário removê-lo.

22 Discussão PROCEDIMENTO RESULTADOS Uma vez que não efectuámos os cálculos, não conseguimos saber se a amostra de DNA obtida tinha pureza adequada para aplicações posteriores. Isto verificava-se se o quociente entre os valores de densidade óptica a 260 nm e a 280 nm se situasse entre 1,5 e 2. Se o quociente fosse inferior a 1,5, haveria contaminação por proteínas. Caso se verificasse um valor superior a 2, poderíamos concluir que teria havido contaminação com RNA. [DNA] Se tivéssemos calculado a concentração de DNA que se obteve, poderíamos verificar a quantidade de DNA que foi possível obter a partir de 5 ml de sangue (rendimento da extracção), que, provavelmente, seria reduzida devido às perdas de DNA possíveis por: - Acção de DNases citoplasmáticas - Insuficiente e não imediata preservação a frio - Incompleta precipitação do DNA

23 Discussão PROCEDIMENTO RESULTADOS Possivelmente, podem pôr-se em causa alguns dos princípios básicos de manuseamento de ácidos nucleicos, tais como as pipetagens de precisão, a esterilidade de todos os materiais e soluções usadas, a pureza dos reagentes, a água (H 2 0 MilliQ estéril) usada para a preparação das soluções, o uso de bata e luvas de látex (para prevenir contaminações). Pode ter ainda havido uma centrifugação anómala ou o tempo de actuação dos reagentes ter sido menor que o necessário. Assim, tendo em conta a existência de erros, os resultados não são 100% fidedignos. A dupla hélice da molécula de DNA é demasiado pequena para se observar. Apesar de o DNA ser a maior molécula na célula, só pode ser visto com um microscópio electrónico. No entanto, pudemos observar o DNA na nossa experiência, isto por termos milhões de cadeias de DNA na amostra. Como o RNA está em todas as partes da célula e é degradado muito facilmente, espera-se que não tenha interferido na experiência, contaminando a amostra de DNA.

24 Discussão A extracção do DNA tem, posteriormente, várias aplicações: PCR (Polymerase Chain Reaction) - Permite ampliar milhões de vezes uma dada sequência nucleotídica de interesse - Permite o diagnóstico de doenças genéticas e a sequenciação de genes Electroforese - Permite avaliar a concentração do DNA extraído, por comparação de um marcador - Separação das moléculas de DNA de acordo com o tamanho RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - Corte do DNA num local específico por enzimas de restrição - que podem detectar mutações em fragmentos da sequência de DNA, chamados polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição SOUTHERN BLOT - Combina a electroforese em gel com a hibridação - Muito sensível para detectar sequências de DNA específicas MICROARRAYS - Usados para avaliar a expressão de muitos genes ao mesmo tempo (respostas fisiológicas específicas; no processo de desenvolvimento; em processos patológicos)

25 Conclusão A técnica de extracção utilizada permite fazer uma extracção eficiente do DNA genómico, sem necessidade de recorrer a solventes orgânicos, permitindo assim a sua análise, nomeadamente por PCR. A quantificação por espectrofotometria permite avaliar a pureza da amostra de DNA extraída e através do quociente entre DO260 e DO280 detectar se houve contaminação da amostra. A análise de DNA tem diversas utilidades tais como fazer o diagnóstico e encontrar as causas para diversas doenças, fazer testes preditivos e de paternidade ou mesmo análises forenses.

26 Bibliografia BERG, Jeremy M.; TYMOCZKO, John L.; STRYER, Lubert; Biochemistry; Freeman, 6th Edition, Protocolos experimentais de Bioquímica I.