Bioquímica e Biologia Molecular. Biologia Molecular

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1 Bioquímica e Biologia Molecular Biologia Molecular 1º Semestre /2010 2º ano - Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Instituo Superior Técnico Baseado nas aulas e no livro The Cell, A Molecular Approach, Cooper & Hausman Resumo por Inês Amorim

2 Índice Ácidos Nucleicos... 4 Replicação de DNA... 8 Reparação de DNA Recombinação de DNA Transcrição de DNA Regulação da Transcrição Processamento de RNA Tradução de RNA Ciclo Celular Laboratório Restrição de plasmídeos Página 2

3 Biologia Molecular A informação genética de uma célula encontra-se armazenada no DNA, um ácido nucleico, e é expressa sob a forma de proteínas. Para que essa informação seja passada de geração em geração é necessário que ocorra replicação e, para garantir a fidelidade desse processo e evitar mutações, as células desenvolveram diversos mecanismos de reparação do DNA. A informação para a síntese de proteínas contida no DNA encontra-se nos genes. Os genes são transcritos em RNA, outro ácido nucleico, num processo denominado transcrição e que é regulado por diversos mecanismos. Uma vez sintetizado o RNA correspondente ao gene que se quer expressar, este vai sofrer processamento (apenas nos organismos eucariotas) e dar origem a mrna (RNA mensageiro). De seguida, dá-se a sua tradução a síntese da proteína. A tradução ocorre ao nível dos ribossomas, moléculas especializadas neste processo e constituídas por rrna (RNA ribossomal) e proteínas, e requer a intervenção de RNA de transferência trna, que transporta os aminoácidos que vão constituir a proteína final. Página 3

4 Ácidos Nucleicos Ácidos nucleicos são macromoléculas (polímeros de nucleótidos) onde é armazenada a informação genética de uma célula. Estão presentes em todos os seres vivos e podem surgir sob a forma de DNA (ácido desoxirribonucleico) ou RNA (ácido ribonucleico). O DNA é actualmente a forma dominante de informação genética, embora alguns organismos, como os retrovírus, utilizem apenas RNA. As unidades fundamentais dos ácidos nucleicos, os nucleótidos, são formadas por uma base azotada e um grupo fosfato ligados a uma pentose (ribose RNA ou desoxirribose DNA). A estrutura básica de um nucleótido compreende então: Base azotada o Purinas: formadas por um anel duplo (penta-anel e hexa-anel) Adenina (A) Guanina (G) o Pirimidinas: formadas por um anel simples (hexa-anel) Citosina (C) Timina (T) exclusiva do DNA Uracilo (U) exclusiva do RNA Pentose açúcar de 5 carbonos o Ribose - RNA o Desoxirribose DNA (tem menos um grupo OH do que a ribose) Grupo fosfato responsável pelo carácter ácido das moléculas. Tem um pk a 1, pelo que em condições fisiológicas (ph 7) está sempre ionizado e com carga negativa. Na formação de cada nucleótido intervêm reacções de condensação: base azotada liga-se ao carbono 1 da pentose, dando origem a nucleósidos. As bases azotadas têm a capacidade de rodar em torno do açúcar a que estão ligadas, podendo apresentar configuração syn ou anti, sendo a última a mais comum. Página 4

5 Com a ligação de um grupo fosfato ao carbono 5 da pentose, forma-se um nucleótido. Os nucleótidos livres são tri-fosfatos - dntp, perdendo dois grupos fosfato durante as reacções de polimerização - passam a dnmp (ex: damp nucleótido de adenina monofosfato). No caso do RNA temos NTP e NMP, respectivamente. A polimerização de nucleótidos, que dá origem aos ácidos nucleicos propriamente ditos, requer a formação de ligações fosfodiesters entre o grupo hidroxilo do carbono 3 de um nucleótido e o grupo fosfato do carbono 5 do nucleótido seguinte. A cadeia polinucleotídica adquire assim uma direcção, apresentando no terminal 5 um grupo fosfato e no terminal 3 um grupo hidróxido, e a sua síntese é sempre feita na direcção 5-3. Em 1928, Fredrick Giffith descobre um factor genético nas bactérias e, em 1952, Rosalind Franklin obtém a primeira imagem de raio-x do DNA. Finalmente em 1953, com base nos resultados de experiências anteriores, James Watson e Francis Crick apresentam, na Universidade de Cambridge, o modelo de dupla hélice para o DNA. Segundo este modelo, a molécula de DNA é composta por duas cadeias polinucleotídicas, que se dispõem em sentidos inversos, designando-se, por isso, antiparalelas. No esqueleto da cadeia distinguimos duas cadeias laterais e degraus centrais: as bandas laterais são formadas por moléculas do grupo fosfato alternadas com pentoses e unidas por ligações fosfodiesters; os degraus centrais são pares de bases ligados por pontes de hidrogénio. A especificidade das ligações hidrogénio entre as purinas e pirimidinas é a chamada complementaridade de bases: a adenina liga-se à timina por uma ligação dupla (A = T) e a guanina liga-se à citosina através de Página 5

6 uma ligação mais forte, uma ligação tripla (G C) - a quantidade de adenina e timina, e de guanina e citosina numa célula é sensivelmente a mesma (Regra de Chargaff). O DNA de dupla-hélice (dsdna double-stranded DNA) adquire, geralmente, a forma β - uma dupla hélice de mão direita com aproximadamente 10 pares de bases (3.4 Å cada par) por volta, ou seja, tem um passo de 34 Å; 20 Å de diâmetro e uma rotação de 36 entre os resíduos. De um ponto de vista vertical, a distância entre as cadeias de DNA pode ser pequena minor groove, ou grande major groove. Já o RNA apresenta uma estrutura em cadeia simples e está presente em 3 formas: RNA mensageiro (mrna): cadeia de nucleótidos que transporta a informação para a síntese de proteínas aos ribossomas; RNA de transferência (trna): transfere os aminoácidos para os ribossomas; RNA ribossómico (rrna): entra na constituição dos ribossomas. Nos seres procariontes, o DNA encontra-se no hialoplasma e é um molécula circular. Já nas células eucarióticas, 99% do material genético está no núcleo e apresenta-se sob a forma de cromatina - filamentos de DNA associados a proteínas, as histonas. Tipo de cadeia Pentose Bases Azotadas Localização Quantidade Adenina (A) Constante para DNA Dupla hélice. Desoxirriobose Guanina (G) Principalmente todas as células Citosina (C) no núcleo. da mesma Timina (T) espécie. RNA Página 6 Simples, por vezes dobrada. Ribose Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U) Forma-se no núcleo e migra para o citoplasma. Variável de célula para célula e com a actividade celular. Uma vez que o DNA se encontra sob a forma de uma dupla hélice, a sua estrutura pode ser modificada por factores externos, como a temperatura ou acidez do meio.

7 O aquecimento do material genético enfraquece e quebra as ligações hidrogénio entre bases complementares, levando à desnaturação do DNA. A quantificação deste processo pode fazerse através da medição da absorvância a 260 nm (pico de absorção das bases azotadas), verificando-se que quanto maior for o valor medido maior é a desnaturação da cadeia em cadeia simples, as bases outrora viradas para o interior da molécula estão mais sujeitas à radiação, absorvendo-a em maior quantidade. Registando os valores de absorvância à medida que se aumenta a temperatura do meio verifica-se que estes vão aumentando, o que indica que a elevação da temperatura actua como agente desnaturante. Representando graficamente a Abs em função de T obtém-se as curvas de melting, nas quais se distingue um ponto de inflexão. Este ponto corresponde à temperatura à qual 50% da cadeia dupla de DNA se encontra desnaturada e designa-se temperatura de melting (TM), ou de fusão. Esta temperatura depende directamente do conteúdo de citosina e guanina da molécula, pois quanto maior for o conteúdo CG maior é o número de ligações triplas. Como estas ligações são mais fortes, para que sejam quebradas e ocorra desnaturação é necessária uma temperatura mais elevada, pelo que a um maior conteúdo CG corresponde uma maior TM. Após a desnaturação, se a temperatura diminuir há hibridação do DNA, ou seja, restabelecemse as ligações hidrogénio entre as bases complementares e volta a formar-se uma cadeia dupla. As moléculas de RNA são cadeias simples não lineares que apresentam estrutura secundária, como ganchos e hélices, pelo que pode ocorrer desnaturação do RNA. Cada molécula possui uma curva de melting diferente, em função do seu tipo de estrutura secundária, que pode não estar associada a nenhum ponto de inflexão, pelo que não se define temperatura de melting para o RNA. Página 7

8 Replicação de DNA Durante a divisão celular é necessário copiar o material genético para que toda a informação possa ser transferida da célula-mãe para a célula-filha sem erros. A célula cria cópias do seu próprio DNA através de um processo de replicação semi-conservativa no qual 50% do DNA da célula-filha pertenceu anteriormente à célula-mãe cria-se uma nova cadeia com base numa cadeia-molde original. Para que ocorra replicação é necessário que o DNA se encontre na forma de cadeia simples. Existem 3 enzimas responsáveis por esta tarefa (helicases, SSB e girases) que, embora não participem directamente no processo de replicação, são auxiliares de replicação. A replicação tem início em zonas específicas, denominadas origem de replicação (Ori). Nos procariotas existe apenas uma destas regiões, contrariamente ao que acontece nos eucariotas, que apresentam várias origens de replicação. As regiões Ori são ricas em timina e adenina a natureza desta ligações é mais fraca que as de guanina e citosina o que facilita a abertura da cadeia dupla, e são reconhecidas por um par de enzimas, as helicases. Cada helicase envolve uma cadeia simples do DNA e move-se num dado sentido, quebrando as pontes de hidrogénio entre bases complementares. Essa quebra é bidireccional - existem duas forças de replicação para cada origem de replicação, e requer consumo de ATP. Quando já se encontra em cadeia simples o DNA tem tendência a voltar a estabelecer uma cadeia dulpa, uma vez que esta é a sua forma mais estável. Para impedir esse processo existe um conjunto de proteínas, as SSB (single-stranded DNA-binding proteins), que actuam estabilizando a cadeia simples. Há medida que ocorre a separação do DNA um outro tipo de enzimas, as DNA-girases ou topoisomerases, vão distorcendo a cadeia para que esta não se enrole em si própria e dificulte ou impeça o processo de replicação. Uma vez separada em cadeia simples a molécula de DNA pode finalmente ser replicada. Os dntp s existentes na célula vão sendo mobilizados e inseridos sequencialmente na cadeia (respeitando a complementaridade de bases) libertando um pirofosfato (dois fosfatos), por acção das DNA polimerases. Estas enzimas actuam apenas no sentido 5-3 e são incapazes de Página 8

9 colocar os primeiros nucleótidos, pelo que não dão início à replicação. Para isso existem as RNA polimeraes, ou primases. As RNA polimerases começam o processo de replicação adicionando alguns NTP s à cadeia de DNA e formam os chamados primers, ou iniciadores, constituídos por cerca de 3 a 10 nucleótidos de RNA. Uma vez sintetizados estes pedaços de RNA a DNA polimerase III (pol III) continua a replicação no sentido 5-3, agora já utilizando dntp s. A replicação dá-se em simultâneo nas duas cadeias do DNA. No entanto, enquanto na cadeia 3-5 (leading strand) ocorre replicação contínua no sentido da abertura da cadeia, isto é, a pol III actua sem interrupções no sentido 5-3, na cadeia 5-3 (lagging strand) dá-se replicação descontínua. Como a polimerase só actua no sentido 5-3 e está acoplada a um complexo que se movimenta na direcção da abertura da cadeia dupla, o único modo de fazer com que a enzima vá nessa direcção é sintetizar a lagging strand por partes. 1 Os fragmentos descontínuos são chamados fragmentos de Okasaki e estão associados, cada um, a um novo primer. Quando a polimerase chega ao final de um destes fragmentos e encontra o fragmento anterior, dissocia-se da cadeia e a replicação desse pedaço termina. À medida de ocorre a replicação, a polimerase I (pol I) percorre as cadeias formadas em busca de erros de síntese, corrigindo-os, e de primers, substituindo-os pelos nucleótidos de DNA correctos. Tem, por isso, actividade de exonuclease hidrolisa DNA ou RNA nos sentidos 5-3 ou 3-5, para além de actividade de polimerase adiciona novos nucleótidos. Também as DNA polimerases III actuam como exonucleases. No entanto, enquanto as DNA polimerases I são capazes de reconhecer e corrigir erros de inserção de nucleótidos em qualquer ponto da cadeia e em qualquer sentido, as pol III apenas detectam erros nos últimos nucleótidos adicionados correcção in loco, e no sentido A separação da cadeia original de DNA dá origem a duas cadeias complementares, uma 5-3 (leading strand) e outra 3-5 (lagging strand). No sentido da abertura da cadeia pelas helicases a replicação contínua da cadeia 3-5 dá-se no sentido 5-3, pois as cadeias complementares são anti-paralelas. Já a replicação da cadeia 5-3 se fosse por replicação contínua dar-se-ia no sentido oposto, ou seja, no sentido 3-5. Como a polimerase III não actua neste sentido a replicação da lagging strand tem que ser descontínua. Página 9

10 Como a pol I não consegue estabelecer a ligação entre os nucleótidos que substitui e os que se encontram nas extremidades dos fragmentos de Okazaki, formam-se lacunas entre o grupo fosfato de um nucleótido e o carbono 3' do outro. Essas falhas são posteriormente corrigidas pelas DNA ligases através do estabelecimento de uma ligação covalente. Como as DNA polimerases apenas estendem os primers na direcção 5-3 são incapazes de copiar a extremidade 5 (onde ocorre replicação descontínua) de cromossomas lineares, pelo que se torna necessária a intervenção de mecanismos especializados nesta tarefa. Existem então projecções de nucleótidos na extremidade 3, os chamados telómeros, que não são mais do que sequências repetidas de nucleótidos nos terminais dos cromossomas. Estas sequências são replicadas à custa de enzimas, as telomerases, que catalisam a síntese dos telómeros mesmo na ausência da DNA polimerase. As telomerases são transcriptases reversas, ou seja, sintetizam DNA a partir de um molde de RNA, e cada telomerase tem um molde complementar da sequência do telómero. As telomerases ligam-se então ao telómero e prolongam-no, sintetizando uma cadeia simples de DNA a partir do RNA complementar. Findo este processo, a telomerase desconecta-se e a replicação de mais uma porção da cadeia de DNA pode dar-se por replicação descontínua convencional. Forma-se um novo telómero que pode ser prolongado de novo. A maioria das células somáticas não tem níveis de telomerases suficientemente altos para manter o comprimento dos seus telómeros por um número indefinido de divisões celulares. Deste modo, à medida que a célula envelhece verifica-se o desaparecimento progressivo dos telómeros e o encurtamento dos cromossomas, o que pode levar à morte ou senescência celular. Algumas patologias humanas, como o envelhecimento precoce, têm vindo a ser associadas a mutações nas telomerases. Por outro lado, verifica-se que células cancerígenas apresentam níveis anormalmente altos destas enzimas, o que lhes permite dividirem-se indefinidamente. O problema da existência e replicação dos telómeros não se põe nos organismos procariotas pois estes têm um cromossoma circular. Neste caso, não existe nenhuma ponta solta e, portanto, todo o DNA é replicado sem problemas. Página 10

11 É importante referir que a replicação do DNA mitocondrial é feita por enzimas específicas e que as enzimas mencionadas anteriormente, nomeadamente as polimerases, são responsáveis pelo processo de replicação em E.coli. Nos mamíferos intervêm outros complexos, como exemplificado na imagem seguinte: Página 11

12 Reparação de DNA Alterações no DNA são de grande importância visto esta molécula guardar uma cópia permanente do genoma da célula. Se uma alteração não for corrigida antes da replicação então vai ser perpetuada para todas as gerações seguintes. Apesar de a replicação ser muito fiável podem verificar-se algumas modificações do DNA no final deste processo devido à inserção de bases incorrectas. E não só nesta fase da vida célula, mas em todas as fases do ciclo celular, podem ocorrer alterações na sequência e estrutura do DNA, espontâneas ou induzidas por diversos factores externos como químicos e radiação. Alterações ao nível da molécula de DNA podem impedir os processos de replicação e transcrição, bem como aumentar a frequência de mutações. Para manter a integridade dos seus genomas as células desenvolveram mecanismos de reparação que actuam no sentido de reverter reacções químicas responsáveis pela alteração do DNA e/ou substituir bases incorrectas ou danificadas. As alterações espontâneas dos nucleótidos manifestam-se de duas formas principais: deaminação (remoção de um grupo amina de uma base) e depurinação (remoção da base purina de um nucleótido). Pode ainda ocorrer metilação (adição de grupos metilo) que embora seja um processo normal nos nucleótidos se se der de forma incontrolada é prejudicial. A deaminação ocorre principalmente nos nucleótidos de citosina e adenina e é o resultado da substituição, na base, de um grupo amina (NH 2 ) por um átomo de oxigénio. A deaminação da adenina dá origem a hipoxantina, uma base modificada, e da alteração da citosina resulta uracilo pelo que esta base, considerada exclusiva do RNA, pode surgir em DNA danificado. Durante a replicação de uma região que sofreu deaminação vai formar-se uma cadeia mutada e outra cadeia intacta pois apenas uma das cadeias originais está modificada. Na deaminação da citosina, por exemplo, um dos moldes terá um nucleótido de uracilo pelo que a cadeia complementar irá apresentar uma adenina no local de guanina - ocorre uma mutação. A outra cadeia molde, como tem um nucleótido de guanina que é complementar da citosina, vai manter-se inalterada. Página 12

13 Na depurinação há remoção total da base de um nucleótido, por clivagem da ligação entre essa base e a desoxirribose. No local do nucleótido fica apenas a base associada ao grupo fosfato e designa-se esse local por local AP - local apurínico ou apirimidínico. À semelhança do que acontece na deaminação, a replicação de uma região danificada vai dar origem a uma cadeia mutada e outra cadeia intacta. Só que neste caso, a cadeia mutada tem um nucleótido a menos no local em que ocorre depurinação pois não apresenta nenhuma base que permita a ligação de uma base complementar. Esta mutação pode ter consequências gravíssimas para a célula, visto que se ocorrer numa região codificante pode modificar completamente a proteína resultante. Das alterações induzidas por radiação ou químicos, podemos destacar a formação de dímeros de timina e de aductos de DNA, e a alquilação. A exposição à radiação UV induz a formação de ligações entre timinas de nucleótidos adjacentes, dando origem a um dímero de timina. As duas bases de timina ligam-se entre si formando um anel de ciclobutano e deixam de estabelecer ligações com as adeninas da cadeia complementar (ligação T-T é mais forte que a ligação A-T). Consequentemente há distorção da estrutura das cadeias de DNA, o que pode bloquear a transcrição ou replicação. A reparação directa dos dímeros de timina dá-se através de fotoreactivação. Nesta reacção, inversa à dimerização, é utilizada energia da luz visível para quebrar o anel de ciclobutano e permitir que as timinas se liguem de novo às adeninas complementares. Apesar de as bactérias utilizarem este processo muito frequentemente os mamíferos e, nomeadamente, os seres humanos não são capazes de corrigir os dímeros de timina directamente, estando por isso mais sujeitos aos efeitos noviços da radiação UV. Página 13

14 Muitos agentes químicos são agentes alquilantes, isto é, são agentes reactivos que transferem grupos metilo ou etilo para bases do DNA, modificando-as quimicamente. A alquilação da guanina em particular dá origem a O 6 -metilguanina, uma base complementar da timina em vez da citosina, pelo que a cadeia complementar desta molécula virá alterada. Este tipo de alteração do DNA pode ser reparada directamente por acção de enzimas (O 6 metilguanina metiltransferase) que transferem o grupo metilo, adicionado à posição O 6 da guanina, por um resíduo de cisteína presente no sítio activo da enzima. Muitos agentes carcinogénicos danificam o DNA pela introdução de grandes grupos aos nucleótidos, os aductos de DNA, que alteram a configuração normal das cadeias e, por vezes, até da própria molécula de DNA. Página 14

15 Nem todas as alterações do DNA podem ser reparadas directamente, como acontece com os dímeros de timina e a alquilação, pelo que as células têm mecanismos que permitem reparar vários tipos de danos. Os mecanismos mais importantes, tanto em procariotas como em eucariotas, são os métodos de reparação por excisão - excisão de base, excisão de nucleótido e mismatch repair. Estes mecanismos reconhecem a zona danificada e eliminam a base ou nucleótido alterados permitindo depois a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir da cadeia complementar intacta. A reparação por excisão de base permite corrigir problemas em bases individuais, quer estas tenham sido danificadas por oxidação ou ionização quer sejam o resultado de deaminação ou depurinação. Neste processo de reparação a base danificada é reconhecida e por acção de enzimas específicas é clivada a ligação entre a pentose e a base, formando-se um local AP. Este local é posteriormente reconhecido por uma AP endonuclease que quebra a ligação fosfodiester entre o fosfato do local AP e a pentose do nucleótido adjacente, deixando um nick (interrupção) na cadeia. O que resta do nucleótido a ser reparado é então removido e, por acção da DNA polimerase e DNA ligase, é adicionada uma nova base. A reparação por excisão de nucleótidos corrige dímeros de timina e aductos de ADN através da remoção de uma porção da cadeia de DNA que contém a lesão. Em E.coli existe um sistema, o sistema Uvr, constituído por 3 proteínas (UvrA, UvrB e UvrC) que actua neste sentido. A zona danificada é reconhecida por uma proteína (UvrA) e outras proteínas, as nucleases, clivam ligações fosdiesters na extremidade 3 e 5 da lesão (UvrB e UvrC, respectivamente). Por acção de helicases, são quebradas as pontes hidrogénio entre as bases complementares e é removido um oligonucleótido (com cerca de 12 a 13 bases) que contém a região alterada. DNA polimerase I e ligases actuam, de seguida, no sentido de sintetizar correctamente o pedaço da cadeia excisado. Página 15

16 O sistema mismatch repair reconhece e corrige bases não complementares adicionadas à nova cadeia de DNA durante o decorrer da replicação. Em E.coli esse sistema, designado sistema MUT, é formado por um conjunto de 3 proteínas (MutS, MutL e MutH) que reconhecem a cadeia-filha por esta ainda não estar metilada (a metilação ocorre nos resíduos de adenina de sequências GATC). MutS reconhece a base alterada e forma um complexo com as restantes proteínas. De seguida, a MutH, uma endonuclease, cliva a nova cadeia (ainda não metilada) no local da sequência GATC e a MutS e MutL, juntamente com uma helicase e uma endonuclease, removem a cadeia de DNA entre o local de clivagem e a base mal colocada. Posteriormente, polimerases e ligases procedem à síntese do DNA em falta. Existem diversas polimerases, tanto nos procariotas como nos eucariotas, que podem participar na replicação ou na reparação do DNA. Na tabela seguinte sumarizam-se algumas características de certas polimerases de eucariotas: Enzima Localização Função Pol α (tem actividade da RNA primase inicia a replicação do DNA) Núcleo Replicação de DNA Pol δ (substitui a pol α para continuar a replicação e também tem actividade correctora) Pol ε (similar a pol δ, existe em leveduras) Núcleo Núcleo Replicação de DNA Replicação de DNA Pol β Núcleo Reparação de DNA Pol ζ Núcleo Reparação de DNA Pol γ Mitocôndria Replicação de DNA mitocondrial Página 16

17 Recombinação de DNA O genoma de um organismo tem uma enorme plasticidade, facto para o qual contribui a recombinação genética - troca de material genético. Podem distinguir-se 2 tipos de recombinação: Recombinação homóloga: entre sequências de DNA semelhantes - homólogas; o Site-specific: requer homologia localizada e pode ser considerada um subgrupo da recombinação homóloga; Recombinação não homóloga ou heteróloga: entre sequências de DNA não homólogas; o Transposão: elementos genéticos (transposões) movem-se ao longo do genoma, sendo inseridos e/ou retirados de diferentes locais. Do ponto de vista biológico, a recombinação têm diversos papéis importantes, dos quais podemos destacar: Gerar novas combinações de genes/alelos. Ex: crossing-over da meiose; Gerar novos genes. Ex: rearranjo de imunoglobulinas; Integrar elementos de DNA específicos. Ex: virús; Reparar DNA. Relativamente à utilidade prática deste fenómeno, em biologia molecular utiliza-se recombinação para, por exemplo, mapear genes em cromossomas e criar células e organismos transgénicos. A recombinação homóloga requer extensa homologia genética, ou seja, é necessário que haja uma extensa complementaridade entre os nucleótidos de 2 cadeias de cromossomas diferentes, ou mesmo de zonas do mesmo cromossoma que estejam repetidas ou invertidas. Usualmente a recombinação envolve a quebra de duas moléculas de DNA na mesma região, onde as sequências são muito semelhantes, e a junção de um DNA ao outro, o que resulta num processo de "cross-over". Neste tipo de recombinação o local de troca pode estar localizado em qualquer zona da região homóloga e não implica a alteração do arranjo dos genes nos cromossomas. O processo é mediado por enzimas e pode dar-se segundo dois modelos: Recombinação por copy choice dá-se durante a replicação, quando duas cadeias de DNA próximas e homólogas estão a ser replicadas simultaneamente e, a dada altura, trocam de cadeia molde; Recombinação por breakage and rejoining não se dá durante o decorrer da replicação e requer que as duas cadeias de DNA homólogas sofram um nick no mesmo local. A partir desses nicks, uma das cadeias de cada molécula é parcialmente separada e emparelha com a cadeia da outra molécula que lhe é complementar. Em ambos os casos, há o cruzamento de duas cadeias de DNA e a formação de heteroduplexes, regiões da molécula de DNA formadas por cadeias de origens diferentes. À zona de cruzamento dá-se o nome de junção de Holliday e da sua resolução pode resultar uma recombinação com ou sem alteração de genes. Página 17

18 Após a formação da junção de Holliday, que pode migrar ao longo da cadeia, as duas moléculas rodam em torno do seu ponto de ligação. Dependo do sentido dessa rotação, as cadeias cruzam em direcções diferentes e o produto final deste processo pode resultar em heteroduplexes recombinantes ou não recombinantes. Para separar as duas moléculas é então necessário cortar as cadeias cruzadas ao nível da junção. Se o corte for horizontal (imagem à esquerda) então, após a ligação das cadeias obtém-se moléculas iguais às originais heteroduplexes não-recombinantes. Por outro lado, se o corte for vertical (imagem à direita) verifica-se a recombinação propriamente dita, pois só neste caso há alteração na composição da cadeia as moléculas resultantes são heteroduplexes recombinantes. Página 18

19 Tomemos como exemplo as seguintes sequência A, B e as suas sequências complementares a,b, respectivamente: A: AATCGGTCTT a: TTAGCCAGAA B: CTGACCC b: GACTGGG As moléculas de DNA originais, que são iguais entre si, têm a seguinte sequência de nucleótidos: (1) AATCGGTCTTCTGACCC (2) TTAGCCAGAAGACTGGG AATCGGTCTTCTGACCC TTAGCCAGAAGACTGGG Após um corte horizontal, obtivemos moléculas de DNA com sequência AB e ab, iguais às moléculas originais. Logo, embora tenha ocorrido troca de informação não se verificou recombinação porque não houve alteração dos genes. Já no caso do corte vertical, as moléculas obtidas têm sequências Ab e ab. Apesar de B e b, e A e a, serem complementares, Ab (3) é diferente de AB (1) e ab (4) não é igual a ab (2), pelo que as sequências resultantes são diferentes da original deu-se recombinação. Caso esta região seja codificante, o gene pode deixar de ser transcrito ou a sua tradução pode resultar numa proteína completamente diferente da proteína original. (3) AATCGGTCTTGACTGGG (4) TTAGCCAGAACTGACCC AATCGGTCTTGACTGGG TTAGCCAGAACTGACCC No processo de recombinação homóloga intervêm enzimas e proteínas específicas, como as DNA polimerase e ligase e proteínas SSB. Em E.coli, existem dois sistemas principais que têm um papel fundamental na regulação dos mecanismos de recombinação sistema Rec e sistema Ruv. O Sistema Rec é constituído por 4 proteínas RecA e complexo RecBCD, e está envolvido nos passos centrais da recombinação homóloga. O complexo RecBCD liga-se ao DNA de cadeia dupla (dsdna) e processa-o, transformando-o em cadeias simples (ssdna) prontas a serem utilizadas pela RecA. A proteína RecA tem três locais específicos de ligação ao DNA, pelo que começa por se ligar a ssdna (1), formando um filamento de DNA-proteínas, e, de seguida, associa-se também a dsdna (2). Segue-se o alinhamento das cadeias homólogas e a RecA, à custa de ATP, catalisa o emparelhamento da cadeia simples com a sua cadeia complementar proveniente do dsdna (3), dando origem a um heteroduplex. Página 19

20 O Sistema Ruv é responsável pela resolução das junções de Holliday. A proteína RuvA reconhece a junção e recruta a proteína RuvB. O complexo RuvAB, que tem actividade de helicase, catalisa a migração da junção, promovendo a variação da extensão do heteroduplex, e RuvC, que tem actividade de endonuclease, cliva as cadeias cruzadas. DNA ligases actuam no sentido de ligar as cadeias das moléculas recombinantes, e termina o processo recombinação. A recombinação site-specific apenas requer homologia de pequenas regiões específicas e permite a introdução ou perda de informação genética. A grande variedade de imunoglobulinas do organismo humano deve-se a fenómenos de recombinação site-specific durante a maturação de linfócitos B e a construção de organismos geneticamente modificados pode ser feita utilizando este processo. Na criação de OGM s e também em processos de recombinação, por exemplo, entre cromossomas de bactérias e plasmídeos, o que acontece é que existem genes flanqueados por informação genética homóloga a uma região do DNA. Por recombinação, essa informação é inserida na molécula. Por outro lado, recombinação entre sequências homólogas de uma mesma molécula pode levar à perda da região entre essas sequências. Página 20

21 Os eventos recombinantes podem ser classificados em dois grupos: Recombinação intermolecular: entre moléculas diferentes; o Cross-over simples: forma-se uma única junção de Holliday; o Cross-over duplo: formam-se duas junções de Holliday; Recombinação intramolecular: entre regiões da mesma molécula; o Repetições directas: as sequências homólogas são exactamente iguais. Implica a perda irreversível de DNA; o Repetições invertidas: as sequências homólogas estão invertidas. Pode resultar na perda de funcionalidade de um gene mas é um processo reversível. Este tipo de recombinação é muito utilizada por bactérias patogénicas que, ao inverterem as suas sequências, baralham o sistema imunitário do hospedeiro. A produção de flagelina, um agente virulento, por parte das salmonelas é um bom exemplo de recombinação intramolecular com repetições invertidas. As bactérias podem produzir, alternadamente, flagelina H1 ou H2 conforme a orientação de uma das suas sequências, o chamado segmento H. Este segmento é flanqueado por duas sequências invertidas, podendo sofrer inversão por recombinação, e contém o promotor do gene da flagelina H2 e de um repressor do gene da flagelina H1. Quando o segmento H se encontra numa orientação que permite a sua transcrição, é produzida H2 e silenciado o gene da H1. Quando ocorre recombinação, o gene de H2 deixa de ser transcrito e passa a ser produzida H1. A alteração do tipo de flagelina produzida pela salmonela permite-lhe resistir mais tempo num organismo pois assim que o sistema imunitário do hospedeiro já está preparado para combater um tipo de virulência ela altera o tipo de flagelina produzida, desencadeando uma nova resposta imunitária. Página 21

22 A recombinação não homóloga não requer qualquer semelhança entre sequências de DNA, estando antes associada ao movimento de sequências transposões, ao longo do genoma. Os transposões são encontrados tanto em procariotas como em eucariotas e, em algumas leveduras e protozoários, fazem parte de mecanismos de regulação de genes. A unidade fundamental dos transposões são as sequências de inserção (IS), sequências de entre 800 a 2000 nucleótidos que contém um gene que codifica a proteína transposase flanqueado por curtas sequências invertidas repetições invertidas (IR). A transposase é responsável por encontrar sequências específicas de DNA e cortar a molécula nessa zona, separando a dupla-cadeia e deixando as sequências complementares por emparelhar. Ao nível dos transposões, esta proteína cliva as extremidades da sequência de inserção e junta a IS à cadeia previamente cortada. As falhas no DNA resultantes deste processo são reparadas por DNA polimerase e ligase. Podemos destacar 2 tipos de mecanismos de transposição: Transposição mediada por DNA: o Transposição conservativa: o transposão move-se do sítio dador para o local alvo; o Transposição replicativa: uma cópia do transposão é inserida no local alvo, mantendo-se o elemento original; Página 22

23 Transposição mediada por RNA: é feita uma cópia de RNA do retrotransposão que é depois traduzida em DNA e inserida no genoma. Este tipo de transposição ocorre, por exemplo, nos retrovírus como o HIV. A inserção de transposões em locais não específicos do genoma pode interferir com a expressão de genes, o que pode ter consequências negativas para a célula. No entanto, em algumas leveduras e protozoários, transposões fazem parte de mecanismos de regulação genética. Alguns transposões mais complexos, como os transposões compostos, são formados por genes flanqueados por sequências de inserção. Esses genes, por exemplo de resistência a antibiótico, podem ser copiados para vários locais do genoma e contribuir para uma maior resistência por parte desse organismo. Página 23

24 Transcrição de DNA Transcrição é o processo através da qual se sintetiza RNA a partir da informação contida nos genes da molécula de DNA. Este processo apresenta algumas diferenças nos organismos procariotas e eucariotas e está sujeito a mecanismos de regulação, verificando-se que os genes são transcritos de acordo com as necessidades da célula. O genoma de procariontes é constituído maioritariamente por regiões codificantes, isto é, regiões que contém genes e codificam a síntese de RNA. Já nos eucariotas, a maior parte do seu genoma está sob a forma de regiões intergénicas regiões não codificantes (cerca de 98% do genoma humano são regiões não codificantes). Sabe-se actualmente que estas regiões, anteriormente sem qualquer função atribuída e designadas por junk-dna, têm um papel importante na transcrição. Os genes contêm informação para a síntese de vários tipos de RNA, cujo processo de transcrição é o mesmo: RNA mensageiro, mrna: molde utilizado pelos ribossomas para a síntese de proteínas; RNA de transferência, trna: intermediário entre mrna e os aminoácidos durante a síntese proteica ao nível dos ribossomas; RNA ribossomal, rrna: um dos constituintes dos ribossomas. Um gene apresenta 3 regiões: Região promotora: onde se encontra o promotor, é o local onde a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição - é essencial ao início da transcrição mas não é transcrito. Tem sequências específicas em determinados locais as zonas consenso, que são reconhecidas pela polimerase e que têm que ser semelhantes para todos os genes pois nos procariotas só existe uma RNA polimerase (apesar de se verificar a existência de vários factores σ que direccionam a transcrição para locais diferentes, de acordo com as condições a que a célula é sujeita). Nos procariotas existem duas zonas consenso de 6 nucleótidos cada uma, uma na região -10 e outra na região -35, respectivamente 10 e 35 nucleótidos antes do inicio da transcrição propriamente dita, em +1. A região -10, também designada caixa TATA, é rica em adenina e timina e, devido à natureza mais fraca das suas ligações, é mais sensível à acção das helicases pelo que a cadeia dupla se abre preferencialmente nesta zona. Os promotores dos eucariotas são maiores e mais complexos. A sua caixa TATA encontra-se na posição -25 e outras zonas consenso localizam-se em -50, -75 e Página 24

25 Parte estrutural: zona transcrita. Encontra-se apenas numa das cadeias e a sua região complementar, não codificante, denomina-se zona nonsense. Zona de terminação: onde a transcrição é terminada. Na transcrição intervém uma enzima específica, a RNA polimerase. Esta enzima transcreve a informação contida no DNA para RNA e, à semelhança das DNA polimerases, catalisa o crescimento de cadeias de RNA no sentido 5-3. No entanto, não necessita de um primer para iniciar o processo. A RNA polimerase, assim como o processo de transcrição de procariotas e eucariotas apresenta algumas diferenças: A RNA polimerase de E.coli é um complexo enzimático formado por 5 subunidades (duas α, β, β, ω e σ). O factor σ é essencial para o reconhecimento da região promotora do gene e para a correcta ligação da RNA polimerase ao DNA mas não tem actividade catalítica, libertando-se da enzima quando já se encontram sintetizados alguns nucleótidos de RNA; Nos eucariotas existe uma polimerase diferente para cada tipo de RNA (mensageiro, de transferência e ribossomal) mas todas são complexos formados por 12 a 17 subunidades e partilham algumas características, tanto entre si como com a polimerase dos procariotas. Tipo de RNA sintetizado RNA polimerase Genes nucleares mrna II mirna II trna III rrna 5.8S, 18S, 28S I 5S III snrna e scrna II e III Genes mitocondriais Mitocondrial Semelhantes à RNA Genes dos cloroplastos Cloroplastos polimerase bacteriana. O processo de transcrição pode ser dividido em 3 fases: Iniciação: RNA polimerase liga-se a uma zona não específica do DNA e migra ao longo da cadeia até encontrar o promotor. Aí liga-se especificamente às zonas -35 e -10 e, ao nível da caixa TATA, helicases e girases promovem a abertura da cadeia dupla de DNA ao longo de nucleótidos. A transcrição é iniciada na posição +1 pela adição de 2 NTP s à cadeia molde e, após a polimerização de cerca de 10 nucleótidos no sentido 5-3, o factor σ é libertado e dá-se inicio à proxima fase. Nota: os nucleótidos livres encontram-se na forma de trifosfatos - NTP s, pelo que durante a sua polimerização são libertadas moléculas de pirofosfato (dois fosfato); Página 25

26 Elongação: o crescimento da cadeia de RNA continua. A polimerase mantém-se ligada ao DNA e vai desenrolando a cadeia dupla à sua frente e hibridizando a cadeia que deixa para trás, ficando apenas uma região com cerca de 15 pares de nucleótidos na forma de cadeias simples. A transcrição continua até que a polimerase encontre um sinal de terminação; Página 26 Terminação: quando a RNA polimerase encontra a zona de terminação dissocia-se do DNA e o processo de transcrição termina. Existem dois mecanismos diferentes responsáveis pela terminação: o Dependente de factor ρ, independente da sequência: a terminação está dependente de uma proteína, o factor ρ, que se liga a longos segmentos (cerca de 60 nucleótidos) no final da molécula de RNA; o Independente de factor ρ, dependente da sequência: a zona de terminação é formada por duas sequências invertidas de citosina e guanina, intercaladas por outras bases e seguidas de nucleótidos de adenina. A transcrição das zonas ricas em CG leva à associação das bases complementares e à formação de uma estrutura secundária - um gancho de terminação, que destabiliza a ligação da RNA polimerase ao DNA e leva à sua dissociação.

27 Para além do seu papel na terminação da transcrição, os ganchos de terminação desempenham também um papel protector: o RNA mensageiro tem um tempo de vida muito curto, sendo rapidamente digerido por RNAses no sentido 3-5. A formação de ganchos de terminação nos terminais do mrna dificulta a sua digestão por parte dessas enzimas e funciona como uma forma de protecção, permitindo que o RNA se mantenha integro o tempo suficiente para que ocorra tradução. O processo de transcrição acima descrito diz respeito aos organismos procariotas. Nos eucariotas, como já vimos anteriormente, a estrutura dos promotores e das RNA polimerases é diferente, pelo que vão existir algumas diferenças nos mecanismos de transcrição. O reconhecimento do promotor e a ligação da RNA polimerase não estão associados a um factor σ mas dependem de diversos factores de transcrição - factores gerais, comuns à transcrição de todos os genes, ou específicos para determinados genes. Os factores de transcrição são, geralmente, proteínas que têm uma região que se liga ao DNA e outra região que interage com outras proteínas e estimula a transcrição. Na iniciação da transcrição, a RNA polimerase II associa-se ao promotor, ao mediador e a outros factores de transcrição, dando origem ao complexo RNA polimerase II/Mediador - o complexo de iniciação. A este complexo podem ligar-se ainda estimuladores (enhancers), que são sequências de DNA que se associam a factores de transcrição que regulam a actividade da RNA polimerase. Os estimuladores situam-se em regiões intergénicas que podem estar localizadas em qualquer ponto dos cromossomas, sendo a sua ligação possível devido à existência de loops na molécula de DNA. Página 27

28 A transcrição é iniciada quando se dá a fosforilação dos resíduos de serina e trionina do CDT (carboxi terminal domain), uma sequência de aminoácidos que faz parte da RNA polimerase. Iniciada a transcrição, o complexo de iniciação dissocia-se e o CDT fosforilado permite a ligação de factores de transcrição que intervêm na elongação e no processamento de RNA. Na terminação da transcrição em eucariotas, a RNA polimerase reconhece uma sequência de terminação e é libertada cerca de nucleótidos depois. As sequências de terminação, por exemplo AAUAAA, são sempre semelhantes, embora possam não ser exactamente iguais em todos os genes. Página 28

29 Regulação da Transcrição O genoma de um organismo contém milhares de genes que não são todos transcritos em simultâneo. Existem mecanismos de regulação, tanto em procariotas como em eucariotas, que actuam ao nível da iniciação ou da elongação no sentido de silenciar ou promover a transcrição de determinados genes, de acordo com as necessidades da célula. Em organismos procariotas a regulação dá-se principalmente na etapa da iniciação e pode envolver diversos mecanismos, dos quais iremos estudar dois exemplos: a regulação do operão da lactose e do operão do triptofano em E.coli. (operão ver capítulo Tradução) Operão da lactose A lactose pode ser degrada em glicose e galactose, moléculas de onde é extraída energia metabólica, por acção de uma enzima específica, a β-galactosidase. Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo da lactose só são sintetizadas quando existe lactose disponível na célula, evitando assim a síntese de proteínas e RNA desnecessárias, pelo que se diz que há regulação da transcrição por indução do substrato. Essa indução pode ser positiva ou negativa, como veremos de seguida. Os genes responsáveis por esse metabolismo distribuem-se por uma estrutura monocistrónica e por uma estrutura tricostrónica. O operão da lactose, a estrutura tricistrónica, é constituído um promotor, um operador e por 3 genes que são transcritos em conjunto: Promotor (P): sequência promotora, local de ligação da polimerase; Operador (O): sequência à qual se pode ligar uma proteína reguladora (LacI), que impede a transcrição dos genes do operão; Gene LacZ: codifica a β-galactosidase, enzima responsável pela quebra da ligação glicosídica entre a glucose e a galactose. É o gene mais importante, apresentando maior afinidade na região RBS (RBS - ver capítulo Tradução), e o facto de estar na extremidade 5 protege o seu transcrito de mrna de uma degradação demasiado precoce; Gene LacY: codifica a permease, uma proteína de membrana específica para o transporte de lactose para o interior das células; Gene LacA: codifica a transacetilase, uma proteína que modifica a galactose mas que não é essencial ao seu metabolismo. É o gene menos importante. A estrutura monocistrónica consiste em: Promotor (Pi): promotor do gene LacI; Gene LacI: gene repressor que codifica uma proteína reguladora (LacI). Na ausência de lactose LacI liga-se ao operador do operão da lactose e impede a transcrição dos seus genes. Quando há lactose disponível na célula, esta liga-se à proteína reguladora LacI, alterando a sua configuração tridimensional. Consequentemente, deixa de existir afinidade entre esta proteína e o operador pelo que os genes dos operão podem ser transcritos. São sintetizadas as proteínas LacZ, LacY e LacA e a lactose é degradada. Este tipo de regulação diz-se por indução negativa visto a presença de LacI impedir a transcrição. Página 29

30 Apesar de a lactose ser uma fonte de energia, como a glicose é um açúcar mais simples o seu metabolismo é mais rápido. Como tal, quando existe glucose disponível na célula esta vai ser utilizada primeiro e, só quando a glucose se tiver esgotado, é que a lactose começa a ser usada como fonte de energia. Na presença apenas de um açúcar, um gráfico do crescimento populacional de uma colónia de bactérias é do tipo (1). Mas na presença de dois açúcares, digamos glucose e lactose, o crescimento é do tipo (2) e diz-se um crescimento diauxico. Em (2) verifica-se que as bactérias se dividem exponencialmente para depois o seu crescimento estabilizar (a) à medida que o açúcar mais simples, neste caso a glucose, é consumido. Segue-se uma nova etapa de crescimento e estabilização (b) quando é consumido o açúcar restante, a lactose. Se representássemos os níveis de β-galactosidade na célula ao longo do tempo obteríamos uma curva do tipo (c). Página 30

31 Verifica-se então que a o operão da lactose é reprimido na presença de glucose. Esta repressão catabólica pela glucose é mediada por um mecanismo de indução positiva associado aos níveis de AMP cíclico (camp adenosina monofosfato ciclica): camp associa-se a uma proteína reguladora, CAP (catabolic activator protein), que se liga a uma sequência de DNA perto do promotor do operão da lactose. A CAP actua interagindo com a subunidade α da RNA polimerase e facilita a sua ligação ao promotor, promovendo a transcrição. Quando os níveis de glucose na célula são baixos há maior produção de camp, pelo que é favorecido o metabolismo da lactose. Por outro lado, em condições de elevada disponibilidade de glucose, a produção de camp é baixa e o operador da lactose é silenciado. Resumindo, a regulação da transcrição do operão da lactose é uma regulação por indução do substrato: Indução negativa: LacI impede a transcrição. Na presença de glucose LacI é desactivado e a lactose é degrada; Indução positiva: CAP promove a transcrição do operão. Na presença de glucose camp não activa o CAP e não há degradação da lactose. Lactose LacI inactivado camp-cap funcional Elevada transcrição do operão Lactose + Glucose LacI inactivado camp-cap não funcional Baixa transcrição do operão Em engenharia genética é comum utilizar-se o promotor do operão da lactose (Plac) para clonar genes de interesse em plasmídeos, pois para iniciar a transcrição basta fornecer lactose à célula. No entanto, em vez de lactose utiliza-se uma molécula sintética análoga à lactose mas não metabolizável, IPTG (IsoPropilTrioGalactosídeo), que inibe o repressor LacI mas não é consumida pela célula, o que torna o processo mais rentável e igualmente eficaz. Página 31

32 Operão do Triptofano A regulação da transcrição do operão do triptofano pode ser generalizada para os restantes aminoácidos e é uma regulação por repressão do produto final pois, ao contrário do operão da lactose que está sempre silenciado na ausência do substrato, o operão do triptofano está sempre activo, sendo reprimido apenas quando este aminoácido abunda na célula. A repressão da transcrição requer dois elementos: Apo-repressor: proteína que por si só não é capaz de se ligar ao operador e inibir a transcrição. Necessita de um co-repressor para adquirir a sua forma activa; Co-repressor: elemento que se liga ao apo-repressor, activando o complexo repressor e inibindo a transcrição. Neste caso, o co-repressor é o próprio triptofano. O operão do triptofano é uma estrutura pentacistrónica que apresenta regiões específicas: Promotor (P): região promotora, local de ligação da polimerase; Operador (O): tal como no operão da lactose, é uma sequência à qual se podem ligar proteínas reguladoras que impedem a transcrição dos genes do operão; Região R (R): codifica o apo-repressor; Região Líder (L) e região do Atenuador (A): localizadas entre o promotor/operador e os genes. Participam na regulação da transcrição por um mecanismo diferente do repressor, o mecanismo de atenuação; Genes E, D, C, B, A: codificam as proteínas que intervêm na síntese de triptofano. Para além da regulação por um complexo repressor existe um outro mecanismo que controla a transcrição de triptofano. Este mecanismo, associado às regiões L e A, é de regulação por atenuação e permite que a transcrição seja inibida mesmo quando a quantidade de triptofano na célula não é suficiente para activar o apo-repressor ou quando este mecanismo não é eficaz. Se não houve repressão ao nível do operador inicia-se a transcrição das regiões L e A. O RNA resultante pode ser dividido em 4 zonas 1 (L) e 2, 3 e 4 (A), ricas em conteúdo CG e que Página 32

33 tendem a formar ganchos. Dependo dos ganchos que se formam pode ou não ocorrer transcrição: Gancho 2-3, gancho de anti-terminação: este gancho forma-se relativamente longe da RNA polimerase, não a destabilizando, pelo que a transcrição dos genes continua; Gancho 3-4, gancho de terminação: a sua formação destabiliza a RNA polimerase e provoca a sua dissociação do DNA, interrompendo a transcrição. A quantidade de triptofano disponível na célula é que vai determinar o tipo de gancho que se forma. Logo após a transcrição inicia-se a tradução da região L no chamado péptido Líder. Este péptido é formado por 14 aminoácidos e na posição 11 e 12 requer a introdução do aa triptofano. De acordo com a quantidade de Trp disponível duas situações são possíveis: Se a concentração de Trp é elevada a tradução é rápida, o que apenas permite a formação de um gancho 3-4. A transcrição pára e não é sintetizado Trp, que existe em abundância; Se existe carência de Trp a tradução é mais demorada e as zonas 2, 3 e 4 ficam livres para se associarem entre si. Como o gancho 2-3 é mais forte forma-se preferencialmente, implicando a continuação da transcrição e a posterior síntese de triptofano. A regulação por atenuação é exclusiva dos procariotas pois implica que a transcrição e a tradução ocorram em simultâneo, o que não se verifica em organismos eucariotas. Página 33