Biologia Molecular (BM) 2009/2010. Ana Cristina Ribeiro Gomes

Transcrição

1 Biologia Molecular (BM) 2009/2010

2 Principais Constituintes Químicos da Célula Componentes Químicos da Célula As células são constituídas por elementos químicos tais como: oxigénio, carbono, hidrogénio, azoto, fósforo e enxofre e representam aproximadamente 99% do seu peso: Água compõe 70% do volume celular. Dissolve e transporta materiais na célula e participa em inúmeras reacções bioquímicas; Sais minerais reguladores químicos; Hidratos de Carbono têm a função de fornecer energia através de oxidações e participar em estruturas celulares; Lípidos compostos insolúveis em água e solúveis em éter, como a acetona e o clorofórmio. Participam no fornecimento de energia através da oxidação; Proteínas constituem os polipeptídios (cadeias de aminoácidos), cuja função é na participar na estrutura celular, na defesa (anticorpos), no transporte de iões e moléculas e na catalisação de reacções químicas; Ácidos Nucleicos: o Ácido Desoxirribonucleico (DNA) responsável pela transmissão hereditária das características; o Ácido Ribonucleico (RNA) controla a síntese de proteínas. Trifosfato de Adenosina (ATP) armazena energia nas ligações fosfato; Elementos químicos: como o sódio, o magnésio, o cálcio, o potássio, o ferro, o cloro, o iodo, o bromo e o zinco, estão presentes em pequenas quantidades nas células (4% do total), e desempenham funções igualmente importantes. Estes componentes são classificados em inorgânicos (água e minerais) e orgânicos (ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos e proteínas).

3 Água, Sua Constituição e Importância Água (H 2 O) A água é uma molécula polar, formada por um dipólo eléctrico (sistema de cargas de igual intensidade e de sinais opostos, separadas entre si por uma distância muito curta). Esta molécula é constituída por 2 átomos de hidrogénio e 1 de oxigénio. Os átomos de hidrogénio estão ligados ao de oxigénio através de ligações covalentes simples (O-H), e é devido às suas cargas, que a molécula H 2 O tem a sua conformação própria, ou seja, os seus constituintes têm um arranjo específico. Assim, os átomos de hidrogénio afastam-se um do outro (pois têm ambos carga positiva) e aproximam-se do átomo de oxigénio (pois tem carga negativa). Os electrões da ligação química estão dispostos assimetricamente, ou seja, encontramse mais próximos de um dos átomos. No dipólo natural da molécula de água a carga é apenas parcial pois é mais fraca que a carga de um electrão ou protão, tendo, cada zona polar da ligação O-H, um momento dipolar. É, desta forma, que a molécula de água tem uma região electropositiva e outra electronegativa. Pontes de Hidrogénio e as Ligações da Molécula de Água Ligações / Pontes de Hidrogénio ligação não covalente entre o átomo electropositivo de hidrogénio com átomos electronegativos (de oxigénio ou Azoto), ou seja, são um tipo de interacção electrostática entre moléculas que ocorre entre as moléculas que têm o átomo de hidrogénio ligado a átomos muito electronegativos, como é o oxigénio. Estas ligações estabelecem-se devido ao facto de as moléculas serem fortemente polares, quando o átomo de hidrogénio parcialmente positivo de uma molécula é atraído pelo par de electrões não partilhado do átomo electronegativo de outra molécula. A ligação é tanto mais forte quanto maior for a polaridade da ligação covalente. É através deste tipo de ligações de hidrogénio que as moléculas de H 2 O estabelecem ligações fortes entre elas (formando água) ou então ligações com outras moléculas. Na ligação entre as 2 moléculas de H 2 O, a ligação de hidrogénio é feita entre um átomo de hidrogénio de uma molécula (átomo dador) e o átomo de oxigénio de outra molécula (átomo receptor). Nas várias ligações de hidrogénio que se podem realizar entre as diversas moléculas, este átomo comporta-se sempre como átomo dador, enquanto o átomo de oxigénio ou azoto, ao qual o hidrogénio se liga, é sempre o átomo receptor. As ligações / pontes de hidrogénio mais importantes a nível biológico são entre: o grupo hidróxido de um álcool e água; o grupo carboxilo de uma acetona e água; grupos peptídicos nos polipeptídios; as bases complementares de DNA. Água como Solvente A água é o solvente para muitas substâncias, pois como essas substâncias apresentam grupos polares estabelecem ligações com as moléculas de hidrogénio e destroem a sua estrutura. Assim a solubilidade das substâncias hidrofílicas (as que são atraídas pela água) é explicada pois a água hidrata os seus componentes e destrói a sua estrutura. Os iões positivos são hidratados pelos átomos de oxigénio, e os iões negativos são hidratados pelos átomos de hidrogénio.

4 Biomoléculas polares, apolares e anfipáticas Moléculas polares moléculas que estabelecem ligações com outras que têm uma carga diferente à que essa molécula possui, ou seja, são moléculas com grupos de átomos capazes de estabelecer ligações com a água. Os grupos polares mais importantes são a glicose, glicina, aspártato, lactato e glicerina. Moléculas apolares moléculas que estabelecem ligações entre dois átomos iguais, com igual carga negativa, ou seja, são moléculas com grupos de átomos incapazes de estabelecer ligações com a água. Moléculas anfipáticas moléculas que têm na sua estrutura grupos com características polares, que têm afinidade com a água, mas também apresentam grupos com características não polares. São o caso das moléculas de fenilalanina e o de fosfatodicolina. Comportamento da água A água intervém nas ligações dos complexos enzima-substrato. A molécula de H 2 O forma uma cadeia ordenada de água à volta do substrato e da enzima, quando ainda estão separados, formando interacções com esses componentes. Quando o substrato tiver para se ligar à enzima formando o complexo enzima-substrato, a água necessita de sair rapidamente do meio destes dois componentes para permitir a sua ligação, assim há uma dispersão de água, causada pela interacção da enzima e do substrato no momento anterior à sua ligação. Esta interacção é depois estabilizada pelas pontes de hidrogénio, os iões, e interacções hidrofóbicas. Processos e Efeitos Osmóticos Célula num meio isotónico a célula está num meio onde a concentração do meio extracelular é igual à concentração do meio intracelular, pelo que não há movimentação de água. Célula num meio hipertónico a célula está num meio onde o meio extracelular tem maior concentração que o meio intracelular, pelo que a célula vai permitir a saída de água, fazendo com que esta encolha. Célula num meio hipotónico - a célula está num meio onde o meio extracelular tem menor concentração que o meio intracelular, pelo que a célula vai permitir a entrada de água criando pressão na sua membrana citoplasmática, o que faz a célula aumentar e permitir que, provavelmente, ocorra lise celular. Aquoporinas proteínas inseridas na membrana citoplasmática e através das quais se dá rapidamente a passagem de água. Aparecem em grandes quantidades em células que necessitam de fazer sair água rapidamente das células, como é o caso das células dos rins. Algumas plantas contraem-se como resposta a um processo osmótico, devido à rápida saída de água das suas células. É o caso das plantas Dionacea muscipula e Mimosa pudica que em resposta ao toque fecham, pois este desencadeia um processo osmótico, e as aquoporinas vão deixar sair a água rapidamente.

5 Ácidos Nucleicos Ácidos Nucleicos Os ácidos nucleicos são polímeros de nucleotídios, ou seja, constituem cadeias de moléculas (nucleotídios) unidas quimicamente, que controlam a actividade celular. Nucleotídio são as subunidades dos ácidos nucleicos, constituídos por uma base azotada, um açúcar, e um (ou mais) grupo(s) fosfato(s). Há dois tipos de ácidos nucleicos: DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico). O Grupo Açúcar dos Nucleotídios O DNA e o RNA diferem os seus nucleotídios entre si devido ao grupo açúcar. O açúcar, dos nucleotídios dos ácidos nucleicos, é uma pentose, ou seja, um açúcar de 5 carbonos, que pode aparecer em dois tipos: β-d-ribose presente no ácido ribonucleico, tem um átomo de oxigénio no carbono-2; Β-D-2-desoxirribose presente no ácido desoxirribonucleico, não tem o átomo de oxigénio no carbono-2. Desta forma, no RNA é utilizada a pentose ribose e na constituição do DNA tem-se a pentose desoxirribose. As Bases Azotadas dos Nucleotídios (Nucleotídios e Nucleosídios) Para além do açúcar existem as bases azotadas, que são bases orgânicas que contêm azoto com propriedades básicas. As bases azotadas podem ser: Pirimídicas Timina (T), Citosina (C) e Uracilo (U), são moléculas pequenas e só apresentam uma estrutura circular; Púricas Adenina (A) e Guanina (G), são moléculas maiores e possuem uma dupla estrutura circular. A nomenclatura dos nucleotídios refere que as abreviaturas devem apresentar 3 letras maiúsculas, as quais referem o nome da base azotada, o número de fosfatos e a fosfato, quando são nucleotídios desoxigenados, acrescenta-se d minúsculo no início da abreviatura. (damp desoxiadenosina monofosfato). É possível provocar a hidrólise parcial de um nucleotídio, formando nucleosídios. Os nucleosídios são formados apenas pela base azotada e pelo açúcar. O Grupo Fosfato dos Nucleotídios Os grupos fosfato juntam-se, normalmente, ao carbono-5 da ribose ou da desoxirribose. Os fosfatos tornam a carga, do nucleotídio, negativa. Nas células existem nucleotídios com 1,2 e 3 fosfatos, sendo mono-, di- e trifosfatos. Estes grupos de fosfatos são comuns nas células e cada uma das moléculas apresenta funções bem definidas. O DNA e o RNA só têm 1 fosfato na sua molécula.

6 Nucleotídios e suas Funções Os vários nucleotídios que se podem formar são capazes de ter diversas funções, mas todas elas se encontram bem definidas e especificadas, podem: Transportar energia química através do grupo fosfato. É o caso do nucleosídio Adenina com 3 fosfatos, ou seja, a adenosina trifosfato (ATP); Formar combinações com outros grupos, originando coenzimas. É o caso da coenzima A (CoA) e dos transportadores de monossacarídios (UDPG); Ser usadas como moléculas sinalizadoras específicas da célula. É o caso da cyclic AMP (camp). Ligações fosfodiester Fosfodiester ligações características dos ácidos nucleicos, ou seja, são ligações que acontecem entre as moléculas de nucleotídios. Estas ligações são formadas em 3 5. Os nucleotídios conseguem ligar-se uns aos outros através de ligações fosfodiester entre o carbono-5 e o carbono-3, para formar os ácidos nucleicos. A sequência linear de nucleotídios num ácido nucleico é, normalmente, representada pela abreviatura de 1 letra, com o fim em 5. Composição e Estrutura do DNA No DNA consideram-se quatro categorias de nucleotídios que são designados pela base azotada que entra na sua constituição: nucleotídio adenina, nucleotídio guanina, nucleotídio citosina e nucleotídio timina. Na formação de cada nucleotídio intervêm reacções de condensação, formando-se cadeias polinucleotídicas. Princípio de complementaridade de bases o DNA é constituído por 2 cadeias complementares e anti-paralelas. As bandas laterais da hélice são formadas por moléculas de fosfato, que alternam com moléculas de desoxirribose, e os centrais são pares de bases ligados entre si por pontes de hidrogénio. A especificidade de ligações entre as bases é chamada de complementaridade de bases: Adenina liga-se à timina por 2 ligações de hidrogénio (A = T) Guanina liga-se à citosina por 3 ligações de hidrogénio (G C) As cadeias de DNA são cadeias anti-paralelas pois são iniciadas por uma extremidade 5 e terminam em 3. Assim, à extremidade 3 de uma cadeia corresponde a extremidade 5 da outra. Numa molécula de DNA duas cadeias anti-paralelas que são complementares na sua sequência de nucleotídios estão emparelhadas numa dupla hélice, com cerca de 10 pares de nucleotídios, por volta. O DNA possui timina em vez de uracilo por uma questão de segurança, ou seja, é uma forma de prevenir possíveis mutações. A citosina (que se liga à guanina) é susceptível de sofrer uma alteração espontânea e originar uracilo (que se liga à adenina). Assim, se o uracilo fosse constituinte do DNA, quando a citosina se convertesse em DNA faria com que os sistemas de reparação do DNA dificilmente reconhecessem essa alteração, por isso, tendo o DNA a timina, caso haja a transformação da citocina para uracilo, este nucleotídio é facilmente reconhecido pelas enzimas, sendo possível a excisão da mutação na sequência. Composição e Estrutura do RNA O ácido ribonucleico, RNA, é um polímero de nucleotídios, geralmente em cadeias simples, formado por moléculas de dimensões muito inferiores à dimensões das moléculas de DNA. O RNA pode dobrar e formar ligações entre os seus nucleotídios, mas continua a ser uma cadeia simples. Estas interacções não-convencionais permitem que a molécula de RNA se converta numa estrutura tridimensional que é determinada pela sequência de nucleotídios.

7 O RNA tem na sua constituição: um grupo fosfato, uma ribose e uma base azotada que pode ser adenina, guanina, citosina ou uracilo. As ligações feitas são: A = C e G U. Como se observa, o RNA contém a base uracilo que difere da timina, a base equivalente no DNA. As pontes de hidrogénio que ligam os nucleotídios do RNA são iguais às do DNA. O RNA pode ter várias funções, de entre as quais a função enzimática (riboenzimas). Duplicação do DNA: Mecanismos de Duplicação Num processo de replicação da molécula de DNA é necessário que as duas cadeias de DNA se separem, temporariamente. Isto permite que cada cadeia sirva de base complementar. Assim, forma-se uma cadeia nova com molde na cadeia antiga e é feita sempre por complementaridade, originando 2 moléculas iguais. Para a separação das pontes de hidrogénio, tem de existir uma hidrolização das mesmas. Existem 2 mecanismos diferentes para a replicação do DNA: Mecanismo Conservativo as 2 cadeias separam-se e sintetizam-se novas cadeias. Após a duplicação, as 2 cadeias antigas voltam-se a unir e ficam na célula-mãe, enquanto as 2 cadeias recém-formadas associam-se e vão para a nova célula formada; Mecanismo Semi-conservativo após a duplicação, cada uma das moléculas aparece com 1 cadeia nova e 1 cadeia antiga. Ou seja, é uma hipótese de auto duplicação do DNA, na qual, cada uma das 2 cadeias da molécula serve de molde à síntese de uma nova cadeia complementar, constituindo-se duas moléculas idênticas. Cada uma destas moléculas conserva assim uma cadeia da molécula original, ou seja, há uma réplica integral de cada uma das cadeias constituintes da molécula original através da polimerização ordenada de nucleotídios, segundo a regra de complementaridade de bases. As experiências para provar este tipo de teorias partem, sempre, de organismos mais simples (procariontes) para chegar aos mais complexos (eucariontes), como Meselson-Stahl para comprovar o mecanismo semi-conservativo. A experiência de Meselson-Stahl consistiu na demonstração experimental da replicação semi-conservativa: as E. coli (procarionte) que crescem num meio contendo o isótopo 14N (leve), são transferidas para um meio contendo o isótopo pesado 15N, onde se multiplicam. São transferidas de novo para um meio contendo o isótopo 14N e multiplicam-se apenas 1 vez. Os resultados da ultra centrifugação do DNA é um sedimento de moléculas de DNA localizadas a meio do tubo de ensaio, pelo que têm uma densidade intermédia. Para se explicar a posição do DNA, as moléculas necessitam de ter uma cadeia nova e outra antiga, ou seja, a posição intermédia do sedimento de DNA indica que este representa uma molécula híbrida com uma banda pesada e outra leve, pois se só tivesse cadeias pesadas o sedimento estaria em baixo, e se só tivesse cadeias leves o sedimento estaria em cima, explicando-se, assim, o mecanismo semi-conservativo. A replicação semi-conservativa ocorre da seguinte forma: 1. As duas cadeias da dupla hélice, na presença de enzimas específicas (DNApolimerases) separam-se por ruptura das ligações hidrogénio; 2. Cada uma das cadeias serve de molde à formação de uma cadeia complementar, sendo utilizados nucleotídios, que existem livres na célula 3. Formam-se, simultaneamente, duas cadeias novas de desoxirribonucleótidos de acordo com a regra de complementaridade de bases. Estas novas cadeias são complementares das duas cadeias originais, sendo cada uma anti-paralela em relação à que lhe serviu de molde.

8 Síntese Química de DNA A adição de um desoxirribonucleótido ao fim 3 da cadeia de polinucleótidos é a reacção fundamental para a síntese de DNA. O emparelhamento entre um desoxirribonucleosídeo de trifosfato livre e uma cadeia de DNA existente leva à formação de uma nova cadeia de DNA, o que implica que haja uma sequência de nucleotídios complementares. Os nucleotídios livres na célula para a duplicação do DNA são o trifosfato, no entanto, só entram na síntese monofosfatos por complementaridade, logo, os outros 2 fosfatos são libertados sob a forma de pirofosfato. DNA Polimerase Kornberg liderou a equipa que demonstrou que era a DNA polimerase a responsável pelo estabelecimento da ligação entre a cadeia antiga (molde) e a nova, na duplicação de DNA. DNA polimerase catalisa uma nova cadeia de DNA durante a replicação do DNA, usando uma cadeia já existente como molde. A DNA polimerase apresenta locais de ligação e locais de entrada dos novos nucleotídios. Esta é única, só com uma extremidade 3 livre, pelo que a síntese só se realiza de 5 para 3, originando problemas no modelo. Durante a duplicação, as cadeias vão-se separando, formando uma forquilha de duplicação onde são adicionados nucleotídios livres, formando, por complementaridade, a nova cadeia. A DNA polimerase fixa-se a uma das cadeias de DNA e vai incorporando desoxinucleosídios trifosfatos para formar a nova cadeia, que após estar na posição devida, liberta os pirofosfatos, permanecendo na cadeia nova apenas o nucleotídio correcto. Síntese Contínua e Síntese Descontínua A síntese de cada uma cada uma das novas cadeias de DNA através das cadeias molde faz-se de diferente forma pela DNA polimerase, devido ao facto de esta só sintetizar de 5 para 3. Assim, o processo de DNA não é idêntico para as 2 cadeias antigas: Processo de síntese contínua realiza-se na cadeia 3 5 Processo de síntese descontínua realiza-se na cadeia de 5 3. Fragmento de Okasaki explicação para a duplicação da cadeia 5 3 da molécula molde. Na síntese contínua, o processo ocorre com a adição contínua de nucleotídios seguidos, até ao fim da sequência. Na síntese descontínua, a formação da nova cadeia tem uma série de pequenos fragmentos que são subsequentemente unidos. Esta cadeia, orientada de 5 3 não pode ser sintetizada nessa direcção, logo a síntese procede-se de uma forma não contínua, numa série de passos repetidos. A descontinuidade produz uma série de pequenos fragmentos de DNA (fragmentos de Okasaki) complementares à cadeia original. Posteriormente, estes fragmentos são unidos através de uma enzima, a DNA ligase (enzima capaz de unir 2 porções de DNA), formando uma cadeia contínua e completando a replicação. DNA Helicases DNA helicase complexo proteico que tem moléculas de ATP associadas. Para que o complexo possa progredir e actuar no DNA precisa de energia proveniente da hidrólise do grupo fosfato do ATP. O complexo alia-se ao DNA para separar as 2 cadeias da hélice antes da actuação da DNA polimerase.

9 Primase e Primers (RNA Iniciador) A DNA polimerase não consegue iniciar o processo de síntese pois não é capaz de sintetizar os 2 primeiros nucleotídios da sequência. DNA primases enzima que cria uma pequena sequência iniciadora necessária à replicação do DNA. É uma RNA polimerase que sintetiza este primer, formado por RNA. Ou seja, as primases vão iniciar o processo de replicação, levando à síntese de um pequeno fragmento de RNA, o iniciador (primer). Primer sequência de RNA, que não apresenta mais de 10 nucleotídios, e que é sintetizada para a DNA polimerase ser capaz de se fixar à cadeia de DNA e iniciar a sua actividade. O facto de o primer ser RNA não tem qualquer interesse pois a DNA polimerase só necessita de uma extremidade 3 para se fixar e iniciar o processo. No processo descontínuo existem vários iniciadores por parte da DNA primase, de modo a que a DNA polimerase se possa fixar em 3, em todos os fragmentos de Okasaki. Assim, quando um primer é sintetizado pela DNA primase, a DNA polimerase fixa-se nesse primer para iniciar um novo fragmento de Okasaki. Quando a sua acção termina e acaba a síntese do fragmento de DNA, uma DNA polimerase retira os fragmentos de RNA iniciadores e depois a DNA ligase intervém com a capacidade de ligar os fragmentos e formar a cadeia de DNA completa. É necessário a ligação de proteínas à cadeia nuclear para que se fixe e mantenha a DNA polimerase na cadeia até todos os fragmentos de Okasaki estarem sintetizados. Sintetiza-se o iniciador Fixa-se a proteína Fixa-se a DNA polimerase Sintetiza-se o fragmento de Okasaki Desintegra-se o complexo proteico Liga-se outro iniciador e o processo repete-se Telomerase Há medida que as células se dividem e os organismos envelhecem, as extremidades do DNA não vão ser sintetizadas, fazendo com que as células entrem em recessão, acabando por morrer. Telomerase enzima que acrescenta, em cada uma das extremidades do DNA um bocado de RNA, aumentando a molécula em comprimento. Desta forma, o primer fixa-se nesse segmento, garantindo que toda a molécula de DNA se sintetize. Apesar de a telomerase existir, esta deixa de actuar ao longo do tempo com o envelhecimento das células até ficar inactiva, e assim a molécula de DNA não é completamente sintetizada, entrando em cinestesia. Desta forma, a enzima telomerase garante que a replicação do DNA seja completa e da molécula toda, enquanto é capaz de desempenhar a sua função em pleno. Proteínas Destabilizadoras da Hélice e DNA Topoisomerases No processo de duplicação, após a actuação da helicase, a molécula de DNA tem a tendência de voltar a estabelecer a ligação de dupla hélice, para isso as proteínas destabilizadoras da hélice ligam-se à cadeia impedindo que estas voltem a formar as pontes de hidrogénio, e permitem a duplicação da molécula, pois mantêm as cadeias separadas de modo a que a DNA polimerase possa actuar. DNA topoisomerases funcionam para impedir a rotação da molécula de DNA quando esta está a ser separada, impedindo grandes gastos de energia. As proteínas vão quebrar a molécula de DNA permitindo que a parte cortada pare a rotação e a molécula de DNA permaneça estática. Após a síntese da molécula, as proteínas degradam-se e a molécula de DNA restitui-se. A DNA polimerase e as primases formam um complexo enzimático.

10 A DNA polimerase α inicia o processo de síntese mas é rapidamente substituída, por uma DNA polimerase δ, após ter sintetizado um pequeno fragmento iniciador, continuando a síntese com este ultimo tipo de DNA polimerase. Duplicação do DNA Geral Série Contínua DNA helicase fixa-se na molécula de DNA e separa a dupla cadeia. Série Descontínua DNA polimerase δ e a proteína fixam-se na cadeia de DNA. DNA polimerase α fixa-se na primeira primase, e as proteínas destabilizadoras da hélice vão-se ligando ao longo da cadeia. A cadeia é replicada pela DNA polimerase δ de uma forma contínua, até ao fim da cadeia. A DNA polimerase α após a síntese do primeiro fragmento de Okasaki, desintegra-se. A DNA polimerase δ, juntamente com a proteína, fixa-se no iniciador do 2º fragmento de Okasaki. A replicação continua até todos os fragmentos de Okasaki estarem replicados. A DNA ligase junta todos os fragmentos de Okasaki e forma a molécula de DNA. Duplicação do DNA em Procariontes e em Eucariontes : Origens da Duplicação Procariontes existe uma só origem de duplicação que é reconhecida por uma combinação de proteínas, numa zona essencialmente de adenina e timina, pois como é uma ligação dupla apenas, a sua separação é mais simples. São duplicações mais rápidas que nos eucariontes, pois a molécula de DNA nestes seres é mais pequena. Assim, a duplicação apenas se inicia num único local, em toda a molécula. As forquilhas de replicação ocorrem apenas em duas direcções a partir de um mesmo local. Eucariontes há várias origens da duplicação, visto que a molécula de DNA, nestes seres, é significativamente maior. Existem vários pontos onde a duplicação se possa iniciar, de modo que a duplicação seja rápida o suficiente para a sobrevivência da célula. Assim, nestes seres, a duplicação tem vários locais onde se pode iniciar a duplicação, ao longo de toda a molécula de DNA. A forquilha de replicação movimenta-se em ambas direcções a partir de múltiplas origens de duplicação, num cromossoma eucariótico. Alteração do DNA e Principais Mecanismos de Reparação Diariamente, ocorrem várias alterações no DNA, cuja maioria é reversível pois a célula possui mecanismos de reparação da molécula, no entanto algumas persistem, ou não são detectadas, e vão originar verdadeiras mutações. Alterações espontâneas alterações ao nível do genoma humano, que ocorrem espontaneamente, devido a um qualquer erro na replicação do DNA aquando a mitose; Depurinação perda de bases púricas, obtendo-se um nucleotídio sem a base azotada. Leva à perda de guanina ou de adenina; Desaminação perda do grupo amina (NH 3 ), pelo que afecta as bases que apresentam um grupo amina, levando a que a citosina se converta em uracilo,, ou a erros entre outras bases; Alteração das bases alteração de uma base por outra;

11 Dimerização de bases pirimídicas (como as timinas) estabelecem-se ligações entre duas bases adjacentes da cadeia, formando um dímero. É provocada por exposições a radiações ultra-violeta- Os mecanismos de alterações são regulados por enzimas. Assim, quando existe um erro, este é reconhecido pelas respectivas enzimas que tentam ultrapassar esse mesmo erro. Excisão de uma base há a remoção da base errada por enzimas específicas (glicosilase remove o uracilo, mas existem enzimas para remover todos os grupos), de seguida, as DNA polimerases de reparação introduzem o nucleotídio correcto e as ligases ligam-no ao resto da cadeia; Excisão de um nucleotídio removem um segmento de Nucleotídios que contém as bases incorrectas e volta a sintetizar esse mesmo segmento correctamente. De seguida, as ligases ligam o segmento de novo à cadeia. Transcrição Transcrição do DNA Tradução do DNA Origina-se a proteína, segundo a informação contida no DNA Transcrição O processo de transcrição apresenta pontos de semelhança com a replicação do DNA. Intervém a enzima RNA polimerase que é muito menos exigente que a DNA polimerase, pois é capaz de se ligar directamente a qualquer parte de DNA, e também, de separar a dupla hélice para ter uma única cadeia molde, assim sendo, é capaz de iniciar o processo e de formar ligações fosfodiester, no entanto, à semelhança da DNA polimerase, só sintetiza de 5 para 3. A molécula de RNA transcrita é menor que a cadeia de DNA que é transcrita, pois é só um gene funcional dessa cadeia que é transcrito e não toda a sua sequência. Da transcrição originam-se vários tipos de RNA, ou seja, as sequências de DNA não codificam o mesmo tipo de RNA. mrna RNA mensageiro, codifica as proteínas; rrna RNA ribossómico, forma as estruturas básicas dos ribossomas e catalisa a síntese de proteínas; trna RNA de transferência, intervém na síntese de proteínas como adaptador entre o mrna e os aminoácidos; snrna small nuclear RNA, tem variadas funções nos processos nucleares e na transcrição; snorna small nucleolar RNA, usado no processamento e modificação química do rrna, sendo importante na transcrição; scarna small cajal RNA, usada para modificar snorna e snrna; mirna microrna, regulador da expressão genética, que bloquea a translação de mrna selectivos, tendo um papel importante na regulação da expressão genética; sirna small interfering RNA, desliga a expressão genética, induzindo a degradação de mrna selectivos e na estabilização de estruturas cromossómicas compactas, tendo um papel importante na regulação genética; Outros RNA intervêm em vários processos celulares. Podem ligar-se vários RNA polimerase à mesma sequência de DNA, transcrevendo-se sequencialmente a molécula, para originar várias cadeias de RNA do mesmo gene.

12 Transcrição em procariontes Todos os genes dos procariontes são transcritos pela acção de uma única RNA polimerase. Existe um factor σ (proteico) que se liga à cadeia de DNA para depois ser possível o reconhecimento do promotor, ou seja, de uma sequência específica inicia-se a transcrição, de modo a que seja detectado pela RNA polimerase e através da qual se inicia a actividade de transcrição. Este RNA liberta-se para o núcleo da célula, não se associando à sequência de DNA, por isso é uma molécula livre para desempenhar a sua função. A escolha da cadeia para ser transcrita é determinada pela ligação do promotor e pelo facto de a transcrição ser só de 5 3. Policistrónico característica do mrna, na qual a mesma sequência de mrna tem a capacidade de codificar mais que uma proteína. Transcrição nos eucariontes Os genes são transcritos pela acção de 3 RNA polimerase diferentes, dependendo do tipo de RNA que é codificado: RNA I, II e III. TFIIH funciona como helicase. É o factor proteico que divide as cadeias para se iniciar a transcrição. Cinases adicionam grupos fosfatos ao substrato. Fosforila a RNA polimerase. Complexo TATA sequência de DNA contida no promotor. Sem que o complexo iniciador da transcrição, que é formado pelas enzimas TFIIE e TFIIH, e as cinases estejam ligados à polimerase, esta não é activada e não avança, assim a transcrição não e iniciada. A transcrição termina quando a RNA polimerase encontra uma sequência específica, abandonando o DNA e libertando o RNA. Há outras proteínas que necessitam de se ligar à RNA polimerase para regularem a transcrição da molécula. O promotor contém o complexo TATA, que antecede a sequência a transcrever O complexo TATA é reconhecido e limitado pelo factor TFIID da transcrição, que inactiva o factor TFIIB Os restante factores gerais de transcrição (TFIIE e TFIIH), bem como a RNA polimerase fixam-se ao promotor TFIIH usa ATP para separar a dupla hélice de DNA no ponto de começo da transcrição Os antibióticos interferem na transcrição: Rifampicina inibe as ligações fosfodiester; Actinomicina D inibe ligações ao DNA; Amanitina inibe a acção da RNA polimerase II. A transcrição acontece no núcleo da célula. O DNA primário proveniente da transcrição não é funcional, pelo que tem de sofrer alterações, ou seja, tem de ser processado. Este processamento consiste na remoção dos intrões (sequências não codificantes de aminoácidos), tornando-se funcional. Assim, migra para o citoplasma, nomeadamente, para os ribossomas, onde será traduzido. Monocistrónico característica do mrna, pelo que cada mrna só traduz uma única proteína.

13 Exões e Intrões Os genes têm mais intrões que exões. Os intrões são removidos por recurso a snrna (a maior parte). Os processamentos mais complexos são em mrna de eucariontes e em trna de bactérias e eucariontes. Após ser transcrita uma certa sequência de DNA, é produzido um pré-mrna que necessita de ser processado. Este processamento consiste na excisão de intrões pelas snrnp (small nuclear ribonucleoproteins), que faz parte de um mecanismo do RNA splicing. Mecanismos de excisão de intrões Auto-excisão de intrões há activação de 1 nucleotídio extra de guanina que quebra uma ligação fosfodiester, a outra é quebrada pela própria molécula de RNA. o o Grupo I - Actua em alguns rrna, mrna e trna do núcleo mitocôndrial e de cloroplastos. Ribozimas ácidos nucleicos que têm a capacidade de remover os próprios intrões. Grupo II actua em alguns mrna de mitocôndrias e cloroplastos de fungos, algas e plantas; Excisão defeituosa a alteração de nucleotídios faz com que um gene seja reconhecido como um intrão, sendo removido, provocando uma alteração na proteína; Excisão alternativa nem todos os intrões são removidos e originam diferentes mrna pelo que surgem diferentes proteínas; o Tropomiosina proteína relacionada com a contracção dos músculos. De acordo com o tipo de músculo em que se encontra, a tropomiosina tem constituições ligeiramente diferentes, que resultam desta excisão alternativa. Processamento de rrna O primeiro RNA a ser transcrito é um precursor do RNA ribossómico (rrna) que não é funcional, sendo quimicamente modificado de modo a dar origem a 3 tipos de RNA. Este processamento do precursor, que ocorre no nucléolo, consiste: Adição de um grupo CH3 (nucleotídios metilados); Aparecimento de uracilos anormais. O snorna estabelece ligações com o precursor, quebrando-o e dando origem aos 3 tipos de rrna, que se associam a proteínas e formam as subunidades dos ribossomas. As proteínas são sintetizadas no citoplasma e entram no núcleo pelos poros, enquanto os ribossomas são sintetizados ao nível do nucléolo. Passam pelos poros, novamente, para o citoplasma e realizam a síntese proteica. Processamento de trna Retira-se o intrão e a extremidade 5. Este trna inicialmente não é uma molécula funcional, pelo que a extremidade 3 é alterado pela adição de uma sequência de 1 nucleotídio de adenina e 2 de citosina. É à extremidade 3 que se liga o aminoácido que o TRNA transporta. Nucleotídios anómalos no trna: 2 grupos metil adicionado à guanina, 2 hidrogénios adicionados ao uracilo; Sulfato substitui o oxigénio num uracilo; Deaminação de uma adenina.

14 Síntese Proteica As células de um organismo têm todas a mesma informação genética mas têm diferentes proteínas, ou seja, certos genes são expressos numa célula e noutras não. Pode também acontecer a síntese de uma proteína e ela ser degradada, tornando-se, assim, inactiva. Do DNA para o RNA a informação é transportada pelo mensageiro. Do RNA para as proteínas são necessários adaptadores que adaptem a linguagem do RNA para a proteica, que só é possível através de um processo de tradução proteica. Os codões não reconhecem directamente o aminoácido que especificam, pelo que, para a tradução ocorrer, depende de uma molécula adaptadora que reconhece e se liga a um codão e a um aminoácido (noutro local da sua molécula). Esta molécula adaptadora é o trna. Código Genético A transferência da linguagem do DNA contida na sequência de nucleotídios para a linguagem das proteínas, expressa na sequência de aminoácidos, envolve a codificação dos 22 aminoácidos a partir de quatro nucleotídios diferentes. 3 Nucleotídios consecutivos de DNA constituem o codogene, tripleto que representa a mais pequena unidade de mensagem genética necessária à codificação de um aminoácido. São apenas sequências de 3 nucleotídios, mas a partir destes existem possibilidades suficientes para codificar os aminoácidos conhecidos. Essas sequências vão permitir codificar a ordenação de séries de aminoácidos que caracterizam diversas proteínas. Assim, um código de tripletos forma 1 codão. O código genético é: Código degenerado contém redundâncias; É universal; Ambíguo; Tem codões de finalização; Há tripletos com dupla função; O terceiro nucleótido de cada codão é o menos específico; Codões sinónimos codões que codificam proteínas iguais. Há 3 grelhas de leitura possíveis para uma determinada sequência de DNA, no entanto, a única possível na realidade é determinada pelo codão de iniciação (AUG) e a sua localização. trna Tem uma conformação tridimensional característica devido ao emparelhamento de bases entre diferentes regiões da molécula. Uma das extremidades forma o anti-codão (sequência de 3 nucleotídios que emparelham com o codão complementar do mrna). Na outra extremidade existe o local de ligação do aminoácido. Os trna são sintetizados como um precursor que é processado, sofrendo remoção de sequências, substituição dos 3 nucleotídios 3 e modificações de bases. Modificações dos nucleotídios do trna: 2 grupos metil adicionados à guanina; 2 grupos hidrogénios adicionados ao uracilo; Sulfato substituiu o oxigénio no uracilo; Deaminação da adenina. A associação do trna ao aminoácido correcto depende das aminoacil-trna sintetases, onde 20 enzimas reconhecem o trna e estabelecem ligações com gastos de energia, ou seja, estabelecem uma ligação covalente entre cada aminoácido e as moléculas de trna apropriadas. Esta reconhece o trna adequado pela sequência do anti-codão e sequências específicas do braço aceitador do trna. Esta actividade depende da hidrólise de ATP pois há a

15 formação de uma ligação energética cuja energia é utilizada posteriormente para a formação da ligação peptídica. Muitos antibióticos utilizados têm a função de intervir com a síntese proteica das bactérias, sem interferir na síntese das proteínas do organismo onde estão aplicados. Estes antibióticos matam as bactérias por inibição da sua síntese proteica devido à ligação no local de ligação dos ribossomas ao trna. Tradução Aminoacil-tRNA Sintetase e Activação dos Aminoácidos Este processo implica o funcionamento sequencial por parte de 2 adaptadores: o aminoacil-trna sintetases e o trna. O funcionamento destes adaptadores resulta numa selecção de cada aminoácido tendo em conta o seu codão. O aminoácido fixa-se na aminoacil-trna sintetase, com gastos de ATP Há fosforilação de ATP para formar a ligação e são libertados 2 fosfatos Liberta-se AMP e o trna fixa-se na aminoacil-trna sintetase com o aminoácido O aminoacil trna é libertado da sintetase sob a forma de aminoácido activado Desta forma os aminoácidos são activados para constituir a cadeia polipeptídica e, consequentemente, a proteína. O reconhecimento do trna pela aminoacil-trna sintetases ocorre ao nível do anti-codão e do braço onde se liga o aminoácido. A sintetase é capaz de reconhecer codões mal sintetizados, rejeitando essas proteínas, ou seja, as aminoacil-trna sintetases são capazes de corrigir a adição de um aminoácido errado, sendo este rejeitado, numa zona de edição da molécula. Tradução do mrna Esta ocorre de 5 3. Inicia-se num codão AUG (codão de iniciação) ao qual se liga um trna especial (trna iniciador) fixo no aminoácido metionina (posteriormente removida por uma protease). O fim da tradução é indicado pela presença dos codões stop (UAA, UAG, UGA). A cadeia polipeptídica tem início na extremidade amina e cresce pela adição de aminoácidos à extremidade C-terminal utilizando a energia da ligação covalente ao trna. Processo de Tradução Início da tradução há ligação do trna iniciador à extremidade 5 do mrna com a ajuda de proteínas (factores de iniciação). Este inicio é determinado por uma série de proteínas, e é a subunidade pequena dos ribossomas a responsável por este processo até à fixação do codão de iniciação. Assim, é a ligação do mrna e de um trna iniciador que transporta a metionina até à subunidade pequena de um ribossoma. A subunidade grande de um ribossoma liga-se ao conjunto. O ribossoma está assim funcional. O factor de iniciação liga-se à subunidade pequena do ribossoma A este 'complexo' liga-se o mrna com os factores de iniciação liados à extremidade 5' da sequência e a unidade ligada no codão de iniciação A subunidade grande liga-se à subunidade pequena permitindo o início da tradução O primeiro aminoácido codificado pelo codão de iniciação fixa-se e é formada a primeira ligação peptídica

16 Alongamento (continuação) - fase de tradução dos codões sucessivos e da ligação dos aminoácidos. Um novo trna, que transporta um segundo aminoácido, liga-se ao segundo codão. Há a formação de uma 1ª ligação peptídica entre o aminoácido que ele transporta e a metionina. O ribossoma avança 3 fases. O processo repete-se ao longo do mrna. A tradução é sempre feita com gastos de energia e a associação de várias proteínas Finalização consiste na ligação de um factor de libertação a um codão stop. Esta requer proteínas adicionais, não representadas, e energia. Os codões de finalização não têm nenhum anticodão complementar. Quando o ribossoma chega a um destes codões a síntese acaba. A cadeia polipeptídica destaca-se passando por várias transformações. As subunidades dos ribossomas separam-se e ficam livres para iniciar outro processo de tradução de uma nova proteína. Esta síntese é um processo simples e rápido para garantir a sobrevivência da célula. Ribossomas Para uma tradução rápida do mrna para proteína é requerida uma molécula capaz de migrar ao longo da cadeia de mrna, capturar o trna complementar a cada codão e ligar os aminoácidos para formar uma cadeia, este processo é realizado pelo ribossomas. A grande quantidade de ribossomas no citoplasma é devido à grande capacidade que a célula tem de ter para sintetizar a grande quantidade de proteínas que necessita para as suas funções, garantindo que estas sejam contínuas. Estes ribossomas são constituídos por 2 subunidades, uma grande e outra pequena, que são construídas no núcleo e exportadas para o citoplasma, mais especificamente, estas subunidades são montadas no nucléolo e exportadas para o citoplasma onde se unem apenas quando estão a sintetizar uma proteína a partir da informação de um mrna. Subunidade pequena emparelha o trna com o codão do mrna; Subunidade grande catalisa a formação das ligações peptídicas. As 2 subunidades associam-se uma à outra sobre uma molécula de mrna próxima da sua extremidade 5. A capacidade que o ribossoma tem, de se mover ao longo do mrna e traduzir a sequência de nucleotídios numa sequência de aminoácidos, deve-se à utilização de trna adaptadores. Os ribossomas possuem 4 locais de ligação para moléculas de RNA, que ligam as 2 subunidades: 1 local para o mrna; 3 locais para o trna: o Local A (aminoacil-trna); o Local P (peptidil-trna); o Local E (exit). O ribossoma procariótico está bem estudado pelo que o número de proteínas que possui é bem conhecido, por outro lado, o ribossoma eucariótico não está bem estudado, pelo que não se sabe exactamente o número de proteínas de cada subunidade que possui. Polirribossomas Normalmente, ocorre uma iniciação múltipla de síntese proteica em cada molécula de mrna que sofre tradução, por isso mal um ribossoma avança na molécula, liga-se outro à extremidade 5 da mesma cadeia. Assim, cada molécula de mrna a sofrer tradução aparece ligada a uma série de ribossomas permitindo a síntese simultânea de várias moléculas de proteínas a partir de uma única molécula de mrna, facto pelo qual a capacidade se designa de polirribossomas. Os ribossomas ligam-se em polirribossomas, de modo a que a mesma cadeia seja sintetizada várias vezes ao mesmo tempo, sendo o processo de síntese, rápido e eficaz.

17 Tecnologia do DNA Recombinante DNA Recombinante DNA recombinante DNA que resulta da junção não natural de DNA, proveniente de 2 fontes diferentes. Na tecnologia do DNA recombinante utilizam-se técnicas específicas, nas quais se recorre a enzimas de restrição (endonucleases) para cortar o DNA em pontos específicos e a ligases do DNA para reconstruir a molécula, de modo a inserir uma porção de DNA, natural ou sintético, noutro DNA estranho. Técnicas utilizadas na tecnologia do DNA recombinante: Corte do DNA em locais específicos utilizando enzimas de restrição o que facilita o isolamento e manipulação dos genes. Electroforese em gel de agarose a separação electroforética é o método mais utilizado para estimar o tamanho do fragmento de DNA ou RNA. Clonagem utilizando vectores / PCR uma molécula é copiada de maneira a gerar muitas moléculas iguais. Hibridação capacidade que uma sequência de ácido nucleico tem para se ligar a uma sequência complementar e serve para identificar uma determinada sequência. Sequenciação determinação da sequência de bases que permite identificar genes e deduzir a sequência das moléculas. Estas técnicas, que resultam na produção de DNA recombinante, foram possíveis devido à descoberta de 2 tipos de enzimas: Enzimas de restrição cortam o DNA em locais específicos gerando um conjunto reprodutível de fragmentos de DNA; DNA ligases restabelecem as ligações fosfodiester entre os grupos fosfato 5 e o hidroxilo 3, numa reacção dependente de energia biológica (ATP). Enzimas de Restrição Verificou-se que algumas bactérias resistiam aos fagos (bacteriófagos vírus que destroem bactérias) porque apresentavam enzimas de restrição que eliminavam o DNA estranho que os fagos inseriam dentro do seu organismo. Enzimas de restrição / Endonucleases enzimas que fragmentam o DNA por hidrólise em locais específicos. Reconhecem uma dada sequência de nucleotídios, fragmentando o DNA sempre que essa mesma sequência é encontrada. Estas são isoladas de bactérias, por isso, o seu nome tem origem no nome do organismo do qual foi isolada, ou seja, apresenta 3 letras em itálico que correspondem ao nome do organismo seguido da sua estirpe e da ordem de identificação (EcoRI Escherichia coli, RY13). Locais de restrição nucleotídios que as enzimas de restrição reconhecem, cortando o DNA nessa mesma sequência. A mesma enzima de restrição corta sempre na mesma sequência de nucleotídios em qualquer DNA, mas depende do organismo onde actua, ou seja, no mesmo organismo, as enzimas de restrição cortam no mesmo local, originando sempre o mesmo conjunto de fragmentos, mas noutro indivíduo origina fragmentos diferentes. As bactérias possuem um sistema que impede que as enzimas de restrição do organismo cortem o seu próprio DNA, ou seja, são protectores de CH 3 que impedem a destruição do DNA próprio da bactéria, mas induzem a destruição do DNA desconhecido. Este sistema é constituído por enzimas de restrição e metilases (grupos de nucleotídios onde a enzima de restrição actua). Sequência palindrómicas locais de restrição onde a sequência das duas cadeias é igual quando lida de 5 para 3.

18 As enzima de restrição podem cortar o DNA: A direito originam extremidades em cadeia dupla que são mais difíceis de ligar; Em ziguezague cortam a partir de 3 ou de 5, originando extremidades coesivas de cadeia única. Permite o emparelhamento de caudas de diferentes fragmentos de DNA cortados com a mesma enzima, estes fragmentos podem depois ser unidos pela DNA ligase com o consumo de ATP (se as ligações não emparelharem podem-se modificar as extremidades de modo a torná-las compatíveis). Isosesquizómeros e Isocaudâmeros Isosesquizómeros endonucleases de restrição provenientes de organismos diferentes que reconhecem e cortam de igual forma a mesma sequência de bases, ou seja, têm nomes diferentes por virem de organismos diferentes, mas reconhecem a mesma sequência de DNA. São enzimas diferentes que podem ter configurações diferentes, mas cuja função é semelhante por terem a configuração do centro activo semelhante. Isocaudâmeros endonucleases que originam extremidades coesivas compatíveis, ou seja, são endonucleases distintas, cujas extremidades coesivas são compatíveis apesar de serem originadas por organismos diferentes. Factores que Influenciam a Actividade das Enzimas Temperatura Tampão (ph) Electroforese em Gel de Agarose Electroforese em gel de agarose é utilizada na análise de fragmentos de restrição (ou outros fragmentos de DNA), nos quais há separação das moléculas de DNA, de acordo com o seu tamanho, por migração, num campo eléctrico, através de um gel poroso (a velocidade de migração é inversamente proporcional ao logaritmo do tamanho dos fragmentos). O DNA (básico) adquire carga negativa, devido ao grupo fosfato, sendo atraído para o pólo positivo, ou seja, migra, ao longo do gel, no sentido do pólo positivo. Agarose polissacarídeo extraído de algas, formando um gel com poros maiores do que a policrilamida, dependendo da sua concentração. Quanto menor a concentração de agarose, maior são os poros do gel, e vice-versa. Gel colocado no tanque de electroforese imerso em tampão A amostra e o tampão são inseridos nos poços, que se encontram do lado do cátodo Os fragmentos de DNA migram para o pólo positivo (ânodo) Visualização das bandas de DNA por adição, ao gel, de brometo de etídio, que se intercala com os pares de bases e fluoresce sob luz ultra-violeta

19 Clonagem Clonagem Para estudar genes ou fragmentos de DNA é necessário obter muitas cópias desse gene ou fragmento. Este fragmento de DNA é ligado a um vector (molécula de DNA capaz de se replicar quando introduzida numa células hospedeira). Clone origina-se quando, da multiplicação da célula hospedeira, resultam muitas cópias do fragmento de DNA que foi inserido no vector. Sendo este o processo básico de clonagem. Vectores de clonagem: Bacteriófagos lambda vírus com DNA pequeno que realizam uma multiplicação lítica do vector, juntamente, com o fragmento inserido; Plasmídios ocorrem naturalmente nas células de algumas bactérias, sendo vectores de DNA circular que não codificam informação importante para a célula. Realizam uma multiplicação, juntamente, com a célula hospedeira; Cosmídios são vectores híbridos, artificiais, derivados de fagos e plasmídios, que permitem clonar fragmentos de DNA maiores. Características comuns aos vectores: Origem de replicação permite a sua multiplicação no hospedeiro; Local de clonagem múltipla locais onde as enzimas de restrição cortam o DNA e onde é possível introduzir o fragmento de DNA a clonar; Marcador de selecção do gene que codifica. Plasmídio Plasmídios pequenas moléculas de DNA circular, de cadeia dupla, com a capacidade de replicação independente do genoma da bactéria e que são distribuídos pelas células-filhas. Ocorrem naturalmente nas bactérias, leveduras e alguns eucariontes, podendo, cada célula, apresentar mais que um plasmídio. A molécula possui uma origem de replicação, um gene resistente ao antibiótico, e uma região em que o DNA pode ser inserido, esta região apresenta várias zonas de restrição de modo a facilitar o corte no DNA. A Escherichia coli é um dos organismos, preferencialmente, utilizados em clonagem, pois, após a inserção do fragmento de DNA a clonar, no plasmídeo, este organismo recolhe-os, naturalmente, e estes entram na célula, replicando-se facilmente, no entanto para este processo ser mais eficiente são utilizadas técnicas para tornar a sua entrada mais rápida. Corta-se o plasmídio e o DNA a clonar, com a mesma enzima de restrição; Juntam-se as extremidades coesivas e o DNA insere-se no plasmídio; O plasmídio é misturado com as células das bactérias e um choque térmico aumenta a permeabilidade da membrana da bactéria, facilitando a entrada do plasmídio; A bactéria entra em contacto com o antibiótico; Sobrevivem as que têm o plasmídio e as outras morrem; Induz-se o crescimento e replicação, obtendo-se muitas células bacterianas resistentes e com vários clones de DNA; Destrói-se as bactérias e extrai-se o plasmídio, cortando-se com a enzima de restrição o DNA clonado, e separa-se esse DNA do plasmídio, por electroforese. A partir de 5 kb, a clonagem torna-se mais complicada, apesar da capacidade máxima de clonagem ser 10 kb. pgem vector comercial, apesar de ocorrerem naturalmente na célula.