TP1- Introdução de plasmídeos em bactérias por conjugação triparental e electrotransformação

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1 INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO TP1- Introdução de plasmídeos em bactérias por conjugação triparental e electrotransformação Relatório de Engenharia Genética Ana Raquel Aguiar nº72727, Marta Ferreira nº72767, Nuno Matias nº73614 Professora Leonilde M. Moreira Novembro de 2013

2 Introdução Neste trabalho laboratorial procedeu-se à introdução de genes, associados a vectores recombinantes, em duas espécies de bactérias Gramnegativas: Sphingomonas elodea e Pseudomonas aeruginosa, recorrendo a duas introdução de introdução de DNA em microorganismos, nomeadamente às técnicas de conjugação triparental e electrotransformação. Como primeiro objectivo estudaram-se os processos de complementação homóloga e heteróloga numa espécie mutante de P. aeruginosa, donde foi retirado o gene algc (ΔalgC). Este gene codifica para a actividade de uma fosfoglucomutase/fosfomanomutase e intervém na síntese de alginato, um polissacárido que confere um fenótipo mucoso à bactéria portadora do gene. Após a experimentação verificou-se a reposição do fenótipo em ambos os casos de complementação do genótipo em estudo sendo que na complementação heteróloga se verificou uma menor produção de muco. Segundamente estudou-se a manipulação genética numa espécie de S.elodea mutante, ΔgelE, ou seja sem o gene gele, que codifica para proteínas intervenientes nos passos finais da polimerização e excreção de gelano, também um polissacárido responsável pelo carácter mucoso. Analisaram-se os processos de complementação homóloga e a complementação do genótipo da bactéria com o gene gele mutado num aminoácido. Após experimentação verificou-se a total reposição do fenótipo no primeiro caso, enquanto que no segundo, constataram-se alterações a nível de qualidade e quantidade do gelano produzido. 1

3 Resultados Os resultados obtidos traduziram-se na contagem de unidades formadoras de colónias, e na captação de imagens que permitiram observar as diferenças no fenótipo em estudo. Apresentam-se em seguida as amostras dos resultados obtidos nas duas experimentações onde foram utilizadas as técnicas de conjugação triparental e electrotransformação visando a incorporação de um gene específico no DNA na bactéria em causa. Conjugação Triparental Recorrendo-se à Pseudomonas aeruginosa ΔalgC como bactéria receptora de genes, analisaram-se três situações, nomeadamente: I) Introdução de um vector de clonagem vazio na bactéria; II) Complementação com o gene algc homólogo, i.e., originário da mesma estirpe; III) Complementação heteróloga com o gene pgmg proveniente da estirpe S. elodea e com funções semelhantes ao gene algc. No primeiro caso, o vector vazio pmmb66(he), foi usado como controlo, para assegurar a ausência de fenótipo mucoso na bactéria ΔalgC. O resultado pode ser visualizado na Fig.1.I, onde se verifica a ausência de brilho, que caracteriza em parte o fenótipo mucoso. Na Fig.1.II podem observar-se as colónias originadas pela P.aeruginosa receptora do gene algc homólogo, transportado no plasmídeo pnz49. Por último, está representado na Fig.1.III o produto da complementação heteróloga, cujo gene pgmg foi transferido no plasmídeo plc100 para a célula receptora. Tanto do caso II como no caso III, pode constatar-se a existência de fenótipo mucoso, sendo que a complementação homóloga apresenta uma maior produção de alginato. Nas imagens essa diferença seria mais evidente caso se tivesse dado mais alguns dias de crescimento às culturas e, consequentemente, mais tempo para produzirem o polissacárido. 2

4 I) II) III) Fig.1 Colónias formadas após manipulação com: I) vector vazio; II) gene algc homólogo; III) gene algc heterólogo. Note-se que a existência de marcações vermelhas na caixa de Petri destinam-se puramente à facilitação de contagem de colónias. O plaqueamento das diluições da solução contendo os transconjugantes, células dadoras e ajudantes foi efectuado em dois meios distintos: As diluições de -2,-3 e -4 foram plaqueadas no meio PIA com carbenicilina. O meio PIA é seletivo para a bactéria receptora, assegurando que as bactérias dadora ajudante (ambas da espécie E.coli) não formariam colónias. A marca de seleção eleita foi a resistência à carbenicilina pelo facto da bactéria receptora ser naturalmente resistente à ampicilina, frequentemente utilizada como marca de seleção. Nestas placas obtiveram-se UFC s originárias de Pseudomonas aeruginosa que adquiriram o plasmídeo. As diluições de -5,-6,-7 foram plaqueadas em meio PIA, ficando assegurado que se obtiveram bactérias Pseudomonas aeruginosa mas, visto não ser um meio selectivo, as colónias formadas tanto podem ser originárias de bactérias que tenham adquirido plasmídeo como de bactérias que não o tenham feito. A quantidade de UFC s em meios não seletivos permitem deduzir qual a população de pseudomonas que se teria inicialmente, enquanto que a quantidade das mesmas em meios com carbenicilina permite contabilizar a quantidade de bactérias que adquire plasmídeo quando se recorre a esta técnica. A comparação entre estes dois valores permite aferir acerca da eficiência da técnica recorrendo a estas bactérias. 3

5 De seguida apresentam-se as tabelas com os resultados relativos à experiência da conjugação triparental. Estes baseiam-se na contagem das colónias por placa e no cálculo do valor médio de UFC s por meio. Para o cálculo da frequência de conjugação recorreu-se à seguinte fórmula: Tabela 1: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A pmmb66 HE Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Pia Pia c/ carbenicilina TABELA 2: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA DA CONJUGAÇÃO TRIPARENTAL PARA pmmb66 HE Fenótipo Não Mucoso Nº de transconjugantes Nº de células viáveis Frequência de Conjugação 4

6 Tabela 3: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A plc100 Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Pia Pia c/ carbenicilina Tabela 1: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA DA CONJUGAÇÃO TRIPARENTAL PARA plc100 Fenótipo Nº de transconjugantes Nº de células viáveis Frequência de Conjugação Mucoso (menos intensidade) Tabela 5: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A pnz49 Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Pia Pia c/ carbenicilina

7 Tabela 6: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA DA CONJUGAÇÃO TRIPARENTAL PARA pnz49 Fenótipo Mucoso Nº de transconjugantes Nº de células viáveis Frequência de Conjugação Electrotransformação Utilizou-se a estirpe S.elodea mutante (ΔgelE), como receptora de plasmídeos contendo o gene, cujo efeito na produção de gelano se pretendia analisar. Foram realizadas três tipos de manipulações genéticas: I) Introdução de um vector de clonagem vazio na bactéria; II) Complementação homóloga com o gene gele; III) Complementação do genótipo com uma variante do gene gele, i.e., contendo uma mutação de substituição de um resíduo de tirosina por um de fenilalanina. Tal como na técnica anteriormente estudada, o vector vazio foi introduzido na bactéria como controlo, tendo originado colónias de bactérias ΔgelE, cuja aparência se assemelha à da Fig.1.I. No segundo caso de estudo, o gene gele foi inserido no plasmídeo pha010-3, tendo-se obtido o fenótipo representado na Fig 2.II, que como se pode observar, tem uma aparência muito mucosa. Finalmente na Fig.2.III, revela-se o resultado da complementação do genótipo com o gene mutado, transferido no plasmídeo pha010-3 Y198F, e que também origina um fenótipo mucoso, embora menos mucoso que o caso anterior. 6

8 II) III) Fig.2 Colónias formadas após manipulação com: II) gene gele homólogo; III) variante do gene gele, no qual foi substituído um resíduo de tirosina por fenilalanina. O plaqueamento das diluições da solução contendo os transformantes e as células que não adquiriram plasmídeos foi efectuado em dois meios distintos: As diluições de -1,-2,-3 foram plaqueadas no meio S+. Este meio é selectivo para as bactérias que adquiriram plasmídeos pois contém a marca de selecção, o antibiótico cloranfenicol, sendo as colónias contabilizadas originárias de bactérias com plasmídeo. As diluições de -4,-5,-6 foram plaqueadas em meio S, meio esse que permite o crescimento tanto das células que permitiram adquiriram plasmídeos como das que não adquiriram. Para a electrotransformação, procedeu-se também à contagem das colónias e ao cálculo do valor médio de UFC s por meio. Para o cálculo da frequência da electrotransformação e da eficiência utilizaram-se as seguintes fórmulas: 7

9 Para a determinação da quantidade de DNA ( ao seguintes dados: de DNA) recorreu-se pha010-3 pha010-3 Y198F pbbr1mcs Concentração de DNA em Solução Volume extraido 3.5 µl 1.5 µl 2 µl Quantidade de DNA Tabela 7: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A pbbr1mcs Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Meio S Meio S Tabela 8: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA E EFICIÊNCIA DA ELECTROTRANSFORMAÇÃO PARA pbbr1mcs Fenótipo Não Mucoso Nº de transformantes Nº de células viáveis Frequência da Electrotransformação Eficiência

10 Tabela 9: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A pha010-3y198f Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Meio S Meio S Tabela 10: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA E EFICIÊNCIA DA ELECTROTRANSFORMAÇÃO PARA pha010-3y198f Fenótipo Mucoso (menos intensidade) Nº de transformantes Nº de células viáveis Frequência da Electrotransformação Eficiência Tabela 11: VALORES DE COLÓNIAS E DE UFC'S POR DILUIÇÃO E DE VALORES MÉDIOS EM DIFERENTES MEIOS, RELATIVOS A pha010-3 Meio de Cultura Diluição Nº de colónias por placa UFC's por ml na suspensão diluída UFC's por ml na cultura Valor médio Meio S Meio S

11 Tabela 12: FENÓTIPO APRESENTADO E CÁLCULO DA FREQUÊNCIA E EFICIÊNCIA DA ELECTROTRANSFORMAÇÃO PARA pha010-3 Fenótipo Nº de Nº de células Frequência da Eficiência transformantes viáveis Electrotransformação Mucoso

12 Discussão A utilização de técnicas como a electrotransformação e conjugação triparental, revelam-se técnicas relativamente eficazes na introdução de vectores recombinantes numa bactéria, permitindo em seguida estipular conclusões com base, por exemplo na observação do fenótipo obtido e a contagem de células que adquiriram a nova porção de DNA recombinante. As figuras exibidas na secção dos resultados permitem concluir de forma evidente, que as bactérias são susceptíveis a processos de conjugação (pelo uso da técnica de conjugação triparental) nos quais há transferência de plasmídeos levando à alteração genómica verificada, neste caso, pela observável variação de fenótipo. Particularizando, constatou-se que a ausência no plasmídeo do gene que se pretende clonar na bactéria desprovida desse, não induz qualquer alteração no fenótipo. Tanto a bactéria ΔalgC, como a ΔgelE, continuam a não sintetizar, respectivamente, alginato e gelano após a experimentação. Como o gene de clonagem está ausente, este não é transmitido às gerações seguintes, gerando-se colónias de bactérias não modificadas geneticamente (Fig.1.I). Os resultados referentes aos processos de complementação homóloga com os genes algc e gele indicam a reposição do fenótipo mucoso, que as mutantes não exibem naturalmente. No caso da complementação homóloga do genótipo de ΔgelE com o gene gele (Fig.2.II), verifica-se facilmente que a reposição do fenótipo é bastante intensa, o que pode ser explicado pela elevada compatibilidade com os mecanismos de transcrição e tradução da S.elodea. No caso da bactéria ΔalgC, não é possível constatar firmemente este facto, devido a condições experimentais, que incitam algumas dúvidas, nomeadamente na comparação de resultados entre a Fig.1.II e Fig1.III, como irá ver-se em seguida. Por observação da Fig1.III, certifica-se que a complementação heteróloga do genótipo com um gene (pgmg) de função idêntica àquele que foi retirado (algc), origina a reposição do fenótipo mucoso, não sendo, no entanto tão eficiente quanto o gene homólogo. Mas tal como se referiu há pouco, os resultados experimentais suscitam algumas dúvidas pois, comparando os fenótipos presentes nas Fig.1.II e Fig1.III, 11

13 surge a ideia de que a complementação heteróloga produz maior efeito no fenótipo do que a complementação homóloga. Teoricamente isto não é verdade pois o gene homólogo está perfeitamente adaptado aos mecanismos da bactéria donde é proveniente, ao contrário do gene heterólogo. Tal incoerência poderá dever-se ao facto de as imagens não terem sido recolhidas com o mesmo tempo de desenvolvimento, permitindo que as duas culturas ficassem aproximadamente com a mesma quantidade de alginato. Finalmente, observa-se na Fig.2.III, que a complementação do genótipo com um gene (gele) mutado num aminoácido, origina também o aparecimento de gelano embora, em comparação com o caso da Fig.2.II, produza em menor quantidade e possivelmente com diferente qualidade. Isto leva a concluir que o resíduo de tirosina que foi substituído por fenilalanina era relevante na síntese de gelano. Podem ser extraídas algumas conclusões acerca da eficácia das técnicas tendo por base a frequência de conjugação. Verifica-se, relativamente à conjugação triparental, que a frequência de conjugação foi inferior no plasmídeo pmmb66(he) e superior no pnz49. Estes resultados contrariam o previsto, dado que, teoricamente, quanto menor for o peso molecular do plasmídeo, maior será a frequência de conjugação. Neste caso o pmmb66(he) é o plasmídeo que tem um menor peso molecular, seguido pelo plc100 e por fim pelo pnz49. Logo a frequência de conjugação deveria ter sido superior no plasmídeo pmmb66(he) e inferior no plasmídeo que continha o gene algc mas tal não acontece. Em relação à electrotransformação, verifica-se que a frequência de transformação é ligeiramente inferior no plasmídeo pbbr1mcs quando comparado com o plasmídeo contendo o gene gele, pha Já no plasmídeo com o gene mutado, a frequência foi muito superior em relação aos outros dois. Respectivamente à eficiência da electrotransformação verifica-se, de igual modo, que foi superior largamente no plasmídeo pha010-3y198f, e que no plasmídeo com o gene foi ligeiramente superior ao que não apresentava gene de produção de muco. Teoricamente, por terem o mesmo número de bases e serem inseridos no mesmo vector, era 12

14 espectável que pha010-3 e pha010-3y198f tivessem a mesma frequência de conjugação que seria mais baixa que a de pbbr1mcs por este ser o vector vazio e, consequentemente, possuir menor número de bases, apresentando menores dimensões. O facto de a eficiência ter sido tão baixa no pha010-3 pode dever-se ao mau funcionamento detectado numa das micropipetas usadas. É de se notar o baixo número de UFC s para uma diluição -1, enquanto que para outros plasmídeos essa diluição era frequentemente incontável. A baixa eficiência determinada para o plasmídeo pha010-3 poderá residir no facto de se ter medido um volume de DNA menor do que o assumido para os cálculos. Bibliografia Guia de trabalhos laboratoriais de Engenharia Genética (2012/2013) de Leonilde M. Moreira, Cristina A. Viegas, Arsénio Fialho, Jorge H. Leitão e Isabel Sá Correia 13