APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DA ANEMIA FALCIFORME

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1 1 APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DA ANEMIA FALCIFORME Amanda Matias Ferreira 1 Ananda da Silva Nunes 2 Bianca Rodrigues Vilela 3 Márcia Cristina Silva Reis 4 Prof. Dr. Benedito Rodrigues da Silva Neto 5 RESUMO: A anemia falciforme é um dos distúrbios de um único gene mais comuns no mundo, que afeta aproximadamente nascidos vivos por ano em todo o mundo e caracteriza-se por uma alteração geneticamente determinada na produção da hemoglobina formando a hemoglobina S. O diagnóstico laboratorial da doença falciforme baseia-se na detecção da HbS. A aplicação das técnicas de biologia molecular na identificação de anemia falciforme promoveu excepcional desenvolvimento no diagnóstico laboratorial dessa patologia e esta por sua vez se torna a cada dia instrumento laboratorial de grande definição no diagnóstico e na prevenção dessa patologia. Este estudo tem a finalidade de mostrar o quanto é importante o estudo de novas técnicas de biologia molecular para o diagnóstico de anemia falciforme, proporcionando assim um tratamento adequado e consequentemente uma melhoria na qualidade de vida desses portadores. Palavras-chave: Anemia Falciforme. Doenças Hematológicas. Hemoglobinopatias. Diagnóstico molecular. ABSTRACT: Sickle cell anemia is a single gene disorders, the most common in the world, affecting approximately 280,000 live births per year worldwide and is characterized by an alteration in the production of genetically determined hemoglobin hemoglobin S (HbS). Laboratory diagnosis of sickle cell disease is based on the 1 Biomédica graduada pela Faculdade Padrão. 2 Biomédica graduada pela Faculdade Padrão 3 Biomédica graduada pela Faculdade Padrão. 4 Biomédica graduada pela Faculdade Padrão. 5 Doutor em Medicina Tropical e Saúde Pública pelo Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás e Professor dos cursos de Biomedicina, Enfermagem e Fisioterapia da Faculdade Padrão de Goiânia - Brasil. bio.neto@gmail.com

2 2 detection of HbS. The application of molecular biology techniques in the identification of sickle cell anemia promoted exceptional development in the laboratory diagnosis of this disease and this in turn becomes every day laboratory instrument for highdefinition in the diagnosis and prevention of this pathology. This study aims to show how important it is to study new molecular biology techniques for the diagnosis of sickle cell anemia, thus providing adequate treatment and consequently an improved quality of life of these patients. Keywords: Sickle Cell Anemia. Blood Disorders. Hemoglobinopathies. Molecular Diagnostics. 1 INTRODUÇÃO Anemia é uma situação patológica decorrente da diminuição da hemoglobina circulante (CANÇADO, 2007). A hemoglobina é uma estrutura globular composta por quatro cadeias polipeptídicas cuja principal função é o transporte de oxigênio para os tecidos (ALMEIDA et al., 2011). As causas que provocam anemia são muito diversas, entretanto as principais se observam como consequência de vários tipos de doenças (NAOUM, 1997). A anemia Falciforme é um dos distúrbios de um único gene mais comuns no mundo, que afeta aproximadamente nascidos vivos por ano em todo o mundo (HANKINS, 2010), sendo comumente aceita como uma doença hereditária autossômica recessiva causada por uma alteração hemoglobínica na substituição do ácido glutâmico pela valina na posição 6 da cadeia β, transformandoa em uma hemoglobina instável, chamada hemoglobina S (HbS) (HOLBASH et al., 2010). Tal mudança acarreta em uma menor afinidade com a molécula de oxigênio e a formação de longas cadeias de hemoglobinas que acabam por formar feixes intracelulares concentrados nas extremidades da hemácia e fazem com que ela adquira a forma de foice em situações de hipóxia (CAVALCANTE E MAIO, 2011). Esse fenômeno ocorre em todo o organismo, provocando hemólise e consequentemente anemia hemolítica crônica e com o passar dos anos, lesões isquêmicas em todos os órgãos que compõem o leque de manifestações clínicas observadas nessas pessoas (HOLBASH et al., 2010). As manifestações clínicas são

3 3 observadas apenas nos indivíduos homozigotos para a HbS (Hb SS), resultando na anemia falciforme. Os heterozigotos (Hb AS) são classificados como portadores de traço falciforme e são geralmente assintomáticos, apresentando sintomas apenas em casos onde há diminuição da pressão parcial de oxigênio (SOMMER et al., 2006). Os recentes avanços científicos e tecnológicos direcionados à identificação de diversas doenças promoveram excepcional desenvolvimento no diagnóstico laboratorial de diversas doenças hematológicas. Somam-se a esse fato as aplicações das técnicas de biologia molecular que se tornam cada vez mais instrumentos laboratoriais de grande definição no diagnóstico e na prevenção de doenças hematológicas, notadamente aquelas de origem hereditária (NAOUM, 2001). No passado, o teste de falcização era o principal método de diagnóstico da presença de hemoglobina S (HbS), porém, atualmente, foi completamente substituído pela eletroforese de hemoglobina, que é um método barato, simples e de fácil interpretação (MURAO E FERRAZ, 2007). A eletroforese alcalina em acetato de celulose é o método básico para a detecção da hemoglobina S, e continua sendo o método mais utilizado para este fim. Porém, a existência de outras hemoglobinas variantes que possuem as mesmas características eletroforéticas da HbS obriga a realização de um teste confirmatório, sendo os mais comuns o teste de solubilidade e a eletroforese ácida em ágar (BANDEIRA et al., 2003). O diagnóstico da anemia falciforme também pode ser feito através de outros exames como a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) convencional, PCR em tempo real (qrt-pcr) e a Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC). A PCR é um exame qualitativo que detecta o gene S e oferece a vantagem de ser altamente específico. PCR em tempo real é um método quantitativo e é uma técnica desenvolvida através do refinamento da PCR convencional, também é uma técnica altamente específica, porém devido a seu alto custo ambos ainda não se popularizaram no diagnóstico da doença (ALMEIDA, 2009). O HPLC tem a grande vantagem de ser um exame quantitativo e com isso permite o cálculo não só da

4 4 dosagem de HbS, como também de hemoglobina fetal (HbF), podendo assim verificar a gravidade com que a doença se manifesta (ANVISA, 2002). Este estudo teve como principal objetivo descrever e caracterizar as diferentes técnicas de biologia molecular utilizadas no diagnóstico da anemia falciforme, analisar dados bibliográficos disponíveis em bancos de dados científicos, relacionar as técnicas de biologia molecular convencionais com as atuais e levantar dados sobre o conhecimento dos acadêmicos de biomedicina em relação às técnicas de biologia molecular. A precocidade do diagnóstico favorece a tomada de medidas preventivas que interferem de forma positiva no tratamento. Tendo em vista que a biologia molecular a cada dia proporciona o surgimento de novas técnicas com maior especificidade e sensibilidade para o diagnóstico da anemia falciforme, tornase relevante um estudo mais aprofundado das técnicas moleculares em relação a esta patologia. 2 METODOLOGIA O presente estudo consistiu em uma pesquisa bibliográfica realizada pela revisão de artigos encontrados na literatura, por meio de bases de dados (Pub Med, Lilacs, Bireme, Medline, Scielo), utilizando como palavras-chave os termos: Anemia Falciforme, Doenças hematológicas, Hemoglobinopatias, Diagnóstico molecular. Estas foram baseadas no DeCS (Descritores em Ciência da Saúde) publicado pela Bireme, disponível no endereço eletrônico A pesquisa bibliográfica foi realizada no período de fevereiro de 2013 a julho de 2013, foram avaliados e selecionados artigos publicados em revistas de alto índice de impacto. Foi realizado um levantamento de dados através de questionários para avaliar o conhecimento em relação às técnicas de biologia molecular e à anemia falciforme na comunidade acadêmica. Os questionários foram aplicados aos alunos da Faculdade Padrão de Goiânia-GO matriculados do 1 ao 6 período do curso de Biomedicina. Os dados provenientes dos questionários foram avaliados e analisados

5 5 estatisticamente com base no programa Excel e correlacionados com os da literatura mundial. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Considerações Gerais sobre Anemia De acordo com Lorenzi (2003), a anemia significa redução da taxa de hemoglobina abaixo de um valor entre 13-15g/dl para um indivíduo que está ao nível do mar e tem um volume sanguíneo total normal. As anemias são sempre secundárias, pois existe uma doença básica que as produz e não se justifica tratar a anemia, mas sim a sua causa. A produção deficiente, a destruição excessiva e a perda sanguínea são os três mecanismos básicos responsáveis pelo aparecimento das anemias (CARVALHO, 1999). A hemoglobina é uma proteína conjugada, com um peso molecular próximo a 68 kilodáltons (kda). Sua molécula é formada por dois componentes quimicamente distintos: uma metaloporfirina denominada heme (grupo prostético) e uma proteína denominada globina (CINGOLANI E HOUSSAY, 2004). Existem quatro grupos heme em cada molécula de hemoglobina, cada um dos quais contém um átomo de ferro, ligado por uniões covalentes aos átomos de nitrogênio de uma estrutura heterocíclica denominada protoporfirina IX. O núcleo heme responsável pela cor vermelha é característica da hemoglobina (CINGOLANI E HOUSSAY, 2004). O valor médio da hemoglobina varia de acordo com o sexo, sendo menor na mulher, especialmente em gestantes. A diminuição do número de eritrócitos não serve, por si só, para definir o estado anêmico, embora com frequência esteja presente em quase toda a anemia (LORENZI, 2003). 3.2 Anemia Falciforme A anemia falciforme é uma hemoglobinopatia de caráter genético, hereditário, autossômico recessivo, de alta morbidade e mortalidade (SOUZA et al.,

6 6 2011). Essa doença originou-se na Ásia Menor e foi trazida às Américas pelo tráfico massivo de escravos ocorrido entre o século XV e a metade do século XIX (PANTE et al.,1998). Atualmente, a anemia falciforme é uma das hemoglobinopatias mais frequentes da humanidade e representa a mais comum no Brasil, distribuindo-se de modo heterogêneo entre as diferentes regiões do país, sendo mais frequente onde a proporção de antepassados negros da população é maior, como é o caso do Nordeste do Brasil (RIBEIRO et al., 2008).Tal alteração fisiológica trata-se de uma mutação no cromossomo 11, o que ocasionará o surgimento de uma hemoglobina patológica (NUZZO E FONSECA, 2004). Essa enfermidade caracteriza-se por uma alteração geneticamente determinada na produção da hemoglobina e é ocasionada pela substituição do ácido glutâmico pela valina (MENDONÇA et al., 2009). A simples substituição pontual de uma base nitrogenada, timina por adenina, no sexto códon do éxon1 no DNA do cromossomo 11, ocasiona o surgimento de uma hemoglobina patológica. A troca de bases nitrogenadas no DNA, ao invés de codificar a produção do aminoácido ácido glutâmico, irá, a partir daí, determinar a produção do aminoácido valina, que entrará na posição 6 da sequência de aminoácidos que compõem a cadeia da hemoglobina β, formando a HbS (NETO E PITOMBEIRA, 2003). A HbS sofre polimerização em situações de estresse oxidativo, alterando a capacidade de deformabilidade e a plasticidade da hemácia, que assume o formato de foice (BACKES et al., 2005). Com isto, há um maior risco de ocorrer fenômenos vaso-oclusivos, sendo os principais responsáveis pela sintomatologia apresentada pelos homozigotos (NETO E PITOMBEIRA, 2003). As manifestações clínicas envolvem crises dolorosas, síndrome torácica aguda, acidente vascular cerebral (AVC), alterações esplênicas, crise aplásica, úlceras de perna, manifestações osteoarticulares, hepatobiliares e oculares, síndrome renal, complicações cardiovasculares e infecções (MENDONÇA et al., 2009). Os portadores de anemia falciforme são assintomáticos nos primeiros seis meses de vida, devido à presença de hemoglobina fetal (HbF) que quando presente em altas concentrações diminui o processo de polimerização das hemácias. A HbF é composta de duas α-globina e duas cadeias de polipeptídeos da

7 7 cadeia γ-globina, e nos primeiros seis meses de vida está presente em concentrações superiores às encontradas nos adultos, que é de 1%-2% (AKINSHEYE et al., 2011). Após este período, a síntese das cadeias γ, formadoras da HbF, é substituída pela das cadeias β, ocorrendo a estabilização na produção de globinas. Com isso, a HbS passa a ser produzida em maior quantidade e o indivíduo perde a propriedade protetora da HbF (DAUDT et al., 2002). Pacientes com baixa taxa de HbF podem apresentar, ainda, um quadro de esplenomegalia caracterizado pela congestão na polpa vermelha, pelo sequestro de eritrócitos falcizados nos cordões esplênicos e sinusóides, evoluindo com a formação de trombose e infartos, culminando com a atrofia e fibrose do órgão. Esse fenômeno ocorre geralmente até os cinco anos de idade. A asplenia causa maior susceptibilidade a infecções por organismos que contenham cápsulas, principalmente o Haemophilus influenzae tipo B e o pneumococo (CARDOSO, 2005). Crianças com anemia falciforme menores de cinco anos apresentam risco de infecção por pneumococo de, aproximadamente, trinta a cem vezes maior do que crianças saudáveis. Essas infecções, acompanhadas de acidose, hipóxia e desidratação, podem desencadear e/ou intensificar as crises de falcização, já que favorecem a produção de citocinas inflamatórias, aumentando, assim, a expressão das moléculas de adesão endoteliais e a adesão das células falciformes e dos polimorfonucleares no endotélio vascular (TAKAHASHI, 2005). A anemia falciforme acomete 0,1 a 0,3% da população negróide no Brasil, com tendência a atingir parcela cada vez mais significativa da população, devido ao alto grau de miscigenação em nosso país. De fato estudos populacionais têm demonstrado a crescente presença da HbS em indivíduos caucasóides, a porcentagem de mortalidade entre crianças menores de 5 anos com anemia falciforme é de cerca 25 a 30% (NUZZO E FONSECA, 2004). Estima-se a existência de 25 mil a 30 mil pessoas com anemia falciforme no Brasil e, a cada ano, o nascimento de crianças com a doença (CANÇADO E JESUS, 2007). Um em cada mil recém-nascidos vivos apresenta anemia falciforme, destes estima-se que até 25% não atingem os 5 anos de vida, sendo elevada a mortalidade perinatal, variando entre 20 a 50% (FILHO et al.,

8 8 2012). Isso evidencia a necessidade de maiores investimentos e progressos no tratamento desses pacientes (HOKAMA et al., 2002). 3.3 Diagnóstico O diagnóstico laboratorial da doença falciforme baseia-se na detecção da HbS e pode iniciar-se com base em um eritrograma, que revela a anemia grave, acompanhado de análise da morfologia eritrocitária na extensão sanguínea corada, geralmente com presença de drepanócitos (MURÃO E FERRAZ, 2007). A contagem de reticulócitos (eritrócitos jovens) elevada é uma característica comum nos processos hemolíticos, juntamente com a elevação da bilirrubina indireta (OLIVEIRA E NETO, 2004). Leucocitose com neutrofilia moderada, não necessariamente relacionada à infecção e trombocitose completa o quadro hematológico durante as crises vaso-oclusivas. A plaquetopenia pode ocorrer em caso de sequestro esplênico, que consiste no afoiçamento das hemácias do baço, levando a retenção do sangue, diminuindo os níveis de hemoglobina e consequentemente causando palidez e dor (VERRASTRO, 1996). Em 2001, o Ministério da Saúde instituiu o Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN). A triagem para a HbS foi incluída neste programa, além fenilcetonúria e do hipotiroidismo, devido às doenças falciformes serem doenças que não apresentam características clínicas precoces. Assim a triagem neonatal para a HbS, também conhecido como "teste do pezinho", tem o objetivo de diagnosticar precocemente as doenças falciformes, que habitualmente não apresentam no período neonatal e assim intervir no seu curso natural (ALMEIDA et al., 2006). Para o teste do pezinho, o ideal é que a amostra de sangue seja colhida entre 48 horas e sete dias após o nascimento, sendo aceitavél até o 30 dia, A inclusão das hemoglobinopatias encontra a justificativa em sua alta frequência na população brasileira (MENDONÇA et al., 2009). No passado o teste de falcização era o principal método de diagnóstico da presença de HbS, porém, atualmente, foi completamente substituído pela eletroforese de hemoglobina, que é um método barato, simples e de fácil interpretação (MURAO E FERRAZ, 2007).

9 9 A eletroforese em ph alcalino 8,4 a 8,8 é o principal método para a diferenciação dos vários tipos de hemoglobina. Os meios de suporte para a realização dessa técnica podem ser o acetato de celulose, agarose ou gel de poliacrilamida. O método mais utilizado em laboratórios clínicos é a eletroforese em acetato de celulose, pois é de fácil manuseio, preparação e rápida análise. Sendo assim, esse método é muito utilizado como procedimento inicial de triagem para o gene SS, porém, a existência de outras hemoglobinas variantes que possuem as mesmas características eletroforéticas da HbS obriga a realização de um teste confirmatório, sendo os mais comuns o teste de solubilidade e a eletroforese ácida em ágar (PERIN et al., 2000; BANDEIRA et al., 2003). O diagnóstico diferencial é realizado principalmente por HPLC, e neste ensaio podem-se visualizar as alterações decorrentes da anemia falciforme. Esse método é bastante viável, pois as cadeias β globínicas são detectáveis em fase precoce de vida fetal, a partir da 10ª a 12ª semana de gestação, o que possibilitará o diagnóstico pré-natal da anemia falciforme (NUZZO E FONSECA, 2004). O diagnóstico da anemia falciforme também pode ser feito através de outros exames como o PCR convencional e qrt-pcr. A PCR é um exame qualitativo que detecta o gene S e oferece a vantagem de ser altamente específico. qrt-pcr é um método quantitativo e é uma técnica desenvolvida através do refinamento da PCR convencional, também é uma técnica altamente específica, porém devido a seu alto custo ambos ainda não se popularizaram no diagnóstico da doença (ANVISA, 2002; ALMEIDA, 2009). No decorrer dos quase cem anos de estudos relacionados à anemia falciforme, grandes progressos foram realizados no conhecimento desta doença. Como resultado de todos estes esforços, criou-se um novo campo de estudo das ciências, a biologia molecular (NETO E PITOMBEIRA, 2003). 3.4 Avanços Tecnológicos e a Biologia Molecular O estudo da biologia molecular representa hoje uma das áreas de maior potencial para a realização de pesquisas na área médica, considerando-se não apenas sua grande relevância clínica e epidemiológica, mas influindo

10 10 especialmente no diagnóstico laboratorial e nos procedimentos terapêuticos de algumas patologias com destaque para anemia falciforme (NAOUM, 2001). As aplicações da biologia molecular em hematologia poderão elucidar o conhecimento das alterações moleculares de doenças, tal como ocorre atualmente na caracterização das lesões do gene da β globina e na identificação dos haplótipos da HbS (TODRYK et al., 2000). Entre as técnicas moleculares, o desenvolvimento de métodos baseados no DNA levou ao uso da PCR, uma técnica que permite testar diminutas quantidades de DNA. Essa por sua vez, revolucionou as tendências de aplicabilidade molecular, pois o seu uso laboratorial teve grande progresso devido à simplicidade da técnica e a rapidez em se obter o resultado (PROVAN E GRIBBEN, 2000). Uma variação desse método recentemente implantado foi a qrt-pcr que permite a amplificação e a detecção simultânea (MOLINA E TOBO, 2004). A HPLC, também é uma técnica bastante viável para o diagnóstico dessa patologia, pois com ela é possível detectar hemoglobinas anormais e diminuídas. A técnica baseia-se nas diferenças de carga elétrica entre as cadeias de Hb e apresenta, em relação às outras técnicas, vantagens, incluindo conveniência, eficácia, rapidez (completamente automatizada) e alto nível de sensibilidade e especificidade. Com ela também podemos quantificar as hemoglobinas normais e anormais e assim saber com qual gravidade a doença se manifesta (PERIN et al., 2000 ; NUZZO E FONSECA, 2004). 3.5 TÉCNICAS Existem várias técnicas utilizadas para o diagnóstico da HbS, cada teste tem sua importância na informação de dados para fundamentar com segurança o diagnóstico da anemia falciforme. Entretanto para dimensionar sua importância no conjunto de informações, comentaremos cada um dos testes apresentados.

11 Teste de falcização A técnica consiste em colocar a hemácia a ser pesquisada, sob-baixa concentração de oxigênio, induzindo o seu afoiçamento através do metabissulfito de sódio a 2% que reduz a tensão de oxigênio. Adicionando o metabissulfito de sódio ao sangue total e lacrando essa mistura entre lamínula e lâmina com esmalte, induzimos a falcização devido à falta de oxigenação sendo possível ver essa alteração microscopicamente. O teste de falcização é menos indicado, devido ao baixo grau de resolução, pois quando positivo não diferencia o estado de associação genética (genótipo) da HbS (Hb SS, Hb SF, Hb SC, Hb AS, Hb SD). Além disso, há muitos casos de "falso negativo", ou seja, eritrócitos com HbS que submetidos ao teste de falcização não falcizam (ZANATTA E MANFREDINI, 2009). Por ser um teste de baixa sensibilidade é necessária a utilização de técnicas de biologia molecular, por serem métodos mais precisos e específicos Teste de solubilidade O teste baseia-se na insolubilidade da desoxihemoglobina S, onde resultados positivos são indicados com a turbidez da solução. É frequentemente utilizado como triagem em emergências ou como teste confirmatório para HbS após eletroforese em acetato de celulose devido a sua rapidez e facilidade (PERIN et al., 2000). Porém esse teste não apresenta boa sensibilidade para a detecção da HbS no período neonatal, especialmente nos recém-nascidos prematuros, sendo indispensável a interpretação cautelosa do resultado (ZANATTA E MANFREDINI, 2009). Deste modo, podemos perceber que se trata de uma técnica utilizada somente para confirmações de resultados. O diagnóstico definitivo deve ser dado através uma técnica de biologia molecular. Neste caso, a mais utilizada é a eletroforese em acetato de celulose (OLIVEIRA E NETO, 2004).

12 Eletroforese de Hemoglobina A confirmação do diagnóstico, com distinção segura das demais síndromes falcêmicas, faz-se através de uma técnica de biologia molecular a eletroforese de hemoglobina. Esse tipo de técnica permite a identificação presuntiva do fenótipo da hemoglobina (PERIN et al., 2000), basendo-se na migração diferenciada de compostos iônicos ou ionizáveis, em um campo elétrico (TAVARES, 2006). Eletroforese em um tampão alcalino (ph 8,4 a 8,8) é o método principal para diferenciação dos diferentes tipos de hemoglobina, podendo os meios de suporte ser acetato de celulose, agarose ou gel de poliacrilamida, dentre outros. A eletroforese em acetato de celulose é o método de escolha para os laboratórios clínicos gerais devido à viabilidade comercial do equipamento, à fácil preparação e à rapidez de análise. Esse método é geralmente utilizado como procedimento inicial de triagem para o gene da HbS principalmente em pacientes acima dos 3 meses de idade. A eletroforese em ágar citrato é usada como teste confirmatório para Hb alteradas (WETHERS, 2000). A HbS, a HbG e a HbD possuem a mesma mobilidade eletroforética na eletroforese em acetato de celulose que é o método padrão para separar a HbS de outras variantes. Todavia, a HbS possui mobilidade diferente de HbD e da HbG quando se utiliza a eletroforese em ágar citrato em ph 6,2 (PERIN et al., 2000) Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) O diagnóstico da anemia falciforme teve um grande avanço nos últimos anos com a biologia molecular, a técnica de PCR. A metodologia desenvolvida a partir da tecnologia do DNA tem ajudado na elucidação da base molecular de muitas hemoglobinopatias, que são as doenças genéticas mais comuns na população humana. As alterações genéticas identificadas por esses métodos incluem: deleções que removem parte do grupamento do gene da globina β e mutações de ponto que geram códons nonsense e missense, mrna instáveis e splicing anormais,

13 13 resultando no decréscimo da síntese protéica, ausência ou anormalidade estrutural de uma das subunidades da globina (ZANATTA E MANFREDINI, 2009). A partir da utilização de primers que flanqueiam uma determinada região polimórfica do DNA, é possível que uma dada sequência de ácido nucléico seja amplificados milhares de vezes, mediante o uso de reagentes adequados, quando hibridadas com a sequência alvo através da complementaridade do pareamento de bases do DNA, são copiadas milhares de vezes com a enzima DNA polimerase extraída de bactérias termo-resistentes. Após a execução de vários ciclos de amplificação a elevadas temperaturas, o produto final obtido é a moléculaalvo amplificada milhares de vezes, permitindo sua detecção e caracterização (GOLDENBERG, 2002) PCR em Tempo Real (qrt-pcr) Os produtos obtidos pela técnica do PCR podem ser analisados por várias técnicas suplementares das quais a mais comum é o qrt-pcr que usa o DNA extraído da amostra que se deseja analisar e dele se faz cópias de DNA. O DNA copiado é posteriormente replicado. Essa técnica de biologia molecular permite que a replicação seja observada em tempo real, sendo assim uma técnica altamente especifica e de alta sensibilidade, porém ainda pouco utilizada para o diagnóstico dessa patologia devido o seu alto custo (PROVAN E GRIBBEN, 2000) Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) Essa técnica de biologia molecular utiliza suporte com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, sendo um método adequado para separação de espécies iônicas e macromoléculas. Devido à utilização de colunas com grande capacidade de separação a realização da HPLC requer a utilização de equipamentos específicos, com o uso de bombas e colunas que suportem altas pressões necessárias para eluição da fase móvel. Assim a realização da HPLC necessita da utilização de um cromatógrafo composto de bomba, coluna cromatográfica, detector e registrador (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). Na

14 14 HPLC a fase móvel deve ser um solvente que dissolva a amostra sem que qualquer interação química ocorra entre ambas. A fase estacionária dever ser compatível com o detector, possuindo polaridade adequada para permitir a separação adequada dos componentes da amostra. Já a coluna cromatográfica deve ser confeccionada de material inerte e que resista a altas pressões. Por fim os detectores devem apresentar ampla faixa de aplicação, sendo que os mais utilizados são os espectrais (PERES, 2002). 3.6 Caracterizações de Dados Levantados No segundo semestre de 2013, na Faculdade Padrão, foram avaliados e analisados o conhecimento dos acadêmicos de biomedicina do 1 ao 6 período por meio de questionários aplicados a 72% do contingente total de alunos do semestre atual, com o objetivo de obter informações sobre o entendimento dos alunos em aplicações da biologia molecular no diagnóstico da anemia falciforme. O entendimento e conhecimento sobre a enfermidade é um passo importante na busca do tratamento adequado, assim no estudo foi observado que 96,35% dos acadêmicos possuíam o conhecimento sobre o que é anemia, enquanto a minoria 1,67% não sabe o que é essa patologia. Direcionando nossos dados iniciais a refletir um público que na sua grande maioria julga saber o que é anemia, porém nunca apresentaram patologicamente os sinais da anemia. De acordo com Neto e Pitombeira (2003), a anemia falciforme é uma das doenças herdadas mais comuns no mundo, atingindo expressiva parcela da população dos mais diferentes países, o que torna muito importante o conhecimento dessa patologia para que se tenha um diagnóstico precoce e assim uma melhoria na qualidade de vida dos portadores dessa enfermidade. Dentre os dados levantados foi observado o entendimento dos acadêmicos quanto à anemia falciforme podendose observar que 76,66% sabem o que é anemia falciforme e 23,34% não sabem o que é, demonstrando assim uma diminuição no conhecimento dos acadêmicos em relação à anemia falciforme quando comparada com anemia. Quando questionados sobre o fato de ter conhecimento de alguém com anemia falciforme, somente 38,33% disseram conhecer algum caso, enquanto

15 15 61,67% não conhecem nenhum. Assim podemos correlacionar este estudo com o que cita Mendonça e colaboradores (2009), que mostra o quão grande é a importância de um diagnóstico precoce, pois se trata de uma doença assintomática nos primeiros seis meses de vida devido à presença de HbF, tornando-se indispensável o diagnóstico precoce. Uma vez que o conhecimento sobre a sintomatologia dessa patologia é muito importante para que se correlacione os sintomas com a clínica e assim tenha um diagnóstico precoce, em nossos dados levantados avaliamos o conhecimento dos alunos de cada período em relação aos sintomas da anemia falciforme. Dos 60 acadêmicos avaliados no questionário sobre o conhecimento em anemia falciforme, os alunos do 1 e 2 período mostraram ter o mesmo grau de conhecimento, pois 30% dos alunos analisados de ambos os períodos julgaram saber quais são os sintomas, sendo que a partir do terceiro, nota-se um aumento no entendimento dos alunos, já no sexto período 100% julgam saber os sintomas. O aumento do conhecimento dos alunos na medida em que vai aumentando o nível de curso na graduação, devem-se as matérias específicas que são estudadas ao longo da graduação como, por exemplo: bioquímica, genética, hematologia e biologia molecular (Figura 1). Figura 1- Acadêmicos (%) que conhecem os sintomas de anemia falciforme

16 Porcentagem % 16 De acordo com Murão e Ferraz (2007), o diagnóstico laboratorial da doença falciforme baseia-se na detecção da HbS. Esse diagnóstico com precisão e segurança é possível através da utilização das técnicas de biologia molecular que apresentam alta sensibilidade e especificidade. Deste modo, o conhecimento dos acadêmicos sobre o diagnóstico torna-se relevante para um diagnóstico precoce. Assim, a partir dos dados levantados, nota-se que quanto maior o período de graduação maior é o conhecimento. Esse fato se explica pelas matérias específicas vistas durante o curso, a partir do 3 período (Figura 2). Figura 2- Nível de conhecimento da comunidade acadêmica sobre o diagnóstico de anemia falciforme Período. O diagnóstico da anemia falciforme teve um grande avanço nos últimos anos com as técnicas de biologia molecular que apresentam alta rapidez, sensibilidade e especificidade. É altamente importante o conhecimento das técnicas convencionais e atuais de biologia molecular para se ter um diagnóstico mais rápido e preciso. Com base nesses dados observamos o conhecimento dos acadêmicos em relação a algumas siglas relacionadas à biologia molecular utilizadas no diagnóstico de anemia falciforme. No presente estudo percebemos que a grande maioria do público entrevistado conhece alguma sigla encontrada nos estudos de biologia molecular. Observamos que grande parte dos alunos conhece sobre o diagnóstico, mas com base nos dados levantados podemos concluir que mesmo que grande quantidade de acadêmicos tenha o conhecimento de técnicas de diagnóstico, muitos ainda não conhecem as novas técnicas de diagnóstico como o

17 17 HPLC e o qrt- PCR, o que demonstra a necessidade dos profissionais de se atualizarem em novas técnicas de biologia molecular, para assim se obter um diagnóstico de anemia falciforme mais rápido e preciso (Figura 3). Figura 3- Conhecimento dos acadêmicos em relação a algumas siglas relacionadas à biologia molecular. 50% 3% 2% 5% 40% HbF PCR HPLC qrt-pcr Não Conhecem Com base nos estudos, percebemos que atualmente as técnicas de biologia molecular são extremamente importantes para um diagnóstico preciso da anemia falciforme. Com isso, questionamos os acadêmicos sobre a aplicação da biologia molecular na anemia falciforme. De acordo com 46,66% dos acadêmicos, com a biologia molecular é possível diagnosticar a anemia falciforme. Com base nos dados levantados podemos concluir que uma quantidade relevante de alunos sabe que a biologia molecular é utilizada no diagnóstico da anemia falciforme, porém ainda não conhecem novas técnicas de diagnóstico com alta especificidade e sensibilidade, tornando assim essencial um estudo mais aprofundado nessa nova ciência (Figura 4).

18 18 Figura 4- Conhecimento dos alunos sobre a aplicação da biologia molecular na anemia falciforme. 37% 6% 10% 47% Prevenir a anemia Falciforme Diagnosticar a Anemia Falciforme Levantar Dados sobre a Anemia Falciforme A Biologia Molecular não se Aplica a essa Patologia 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS A anemia falciforme é um distúrbio de um único gene mais comum no mundo, sendo considerado um problema de saúde pública inclusive no Brasil. Essa enfermidade caracteriza-se por uma alteração geneticamente determinada na produção da hemoglobina e é ocasionada pela substituição do ácido glutâmico pela valina. Um em cada mil recém-nascidos vivos apresenta anemia falciforme, destes estima-se que até 25% não atingem os cinco anos de vida, sendo elevada a mortalidade perinatal, variando entre 20 a 50% o que evidencia a necessidade de maiores investimentos e progressos no diagnóstico desses pacientes para uma melhor qualidade de vida desses portadores. A aplicação da biologia molecular no diagnóstico de anemia falciforme promoveu um excepcional desenvolvimento no diagnóstico laboratorial dessa enfermidade, pois a cada vez mais a biologia molecular torna-se um instrumento laboratorial de grande definição no diagnóstico e na prevenção de doenças hematológicas, notadamente aquelas de origem hereditária, como é o caso da anemia falciforme.

19 19 O conhecimento dos acadêmicos sobre o diagnóstico torna-se relevante para um diagnóstico precoce de anemia falciforme. Nos dados levantados no decorrer dos estudos demonstraram que quanto maior o período de graduação maior é o conhecimento dos alunos em relação à patologia e o diagnóstico, devido às matérias específicas vistas durante o curso. No entanto mesmo que a grande maioria julgue saber sobre o diagnóstico de anemia falciforme, somente 4,99% dos entrevistados conheciam novas técnicas de biologia molecular. Com base neste estudo percebemos o quanto é importante o estudo de novas técnicas de biologia molecular para o diagnóstico de anemia falciforme, pois com essas técnicas podemos ter um diagnóstico mais rápido, preciso e assim proporcionar um tratamento adequado e consequentemente uma melhoria na qualidade de vida desses pacientes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AKINSHEYE, I.; ALSULTAN, A.; SOLOVIEFF, N. et al. Fetal hemoglobin in sickle cell anemia; Blood, ALMEIDA, A. M.; GODINHO, T.M.; TELES,M.S. et al. Avaliação do programa de triagem neonatal na Bahia no ano de Rev. Bras. Saúde Matern. Infantil. 2006, 6 (1). ALMEIDA, K.C.RT- PCR quantitativo em tempo real para análise do receptor de EGF em complexos cumulus-oócito colhidos por laparoscopia em cabras Canindé submetidas à estimulação hormonal ovariana. Univ. Est. do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, 2009, 3(2). ALMEIDA, L.P.; WENGERKIEVICS, A.C.; VIVIANI, N.M. et al. O laboratório clínico na investigação dos distúrbios da hemoglobina; J. Bras. Patol. Med. Lab. 2011, 47(3). ANVISA. Manual de diagnóstico e tratamento de doenças falciformes. Brasília, 2002,

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