Cristalografia 2. Laboratório de Sistemas BioMoleculares. Departamento de Física. Câmpus Rio Preto.

Transcrição

1 Cristalografia 2 Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Laboratório de Sistemas BioMoleculares. Departamento de Física. UNESP São José do Rio Preto. SP.

2 Apresentação 1) Biocristalografia 2) Coleta de dados de difração de raios X 3) Problema da fase 4) Refinamento cristalográfico 5) Análise da qualidade da estrutura 6) Caso de estudo: Estudo Cristalográfico da PNP

3 Cristalização Coleta de dados LNLS Difração de raios X Análise Resolução da estrutura cristalográfica

4 Esfera de Ewald

5 Câmara de oscilação

6 Geometria da oscilação

7 Montagem do cristal

8 Criocristalografia

9 Sistema criogênico

10 Sistema de coleta de dados de difração de raios X

11 Ânodo rotatório

12 Problema da fase

13 Espalhamento Thomson Io r 2θ I I = Io r 2 e 4 m 2 c 4 1+ cos 2 2θ ( 2 ), e: carga do elétron m: massa do elétron c: velocidade da luz 2θ: ângulo de espalhamento

14 Espalhamento por elétrons S = s - s o λ 2senθ S = λ

15 Fator de espalhamento atômico f = E E a e. f( S )= ρ ( r) exp (2πi r.s) dv vol.do atomo.

16 Espalhamento de raios X por uma molécula f1 = vol.do atomo ρ ( r)exp(2π i( r 1 + r). S)dv = onde: = f1 exp(2π r.s 1 ), f1 = vol.do atomo ρ ( r)exp(2π i r.s)dv. N (S) = f j exp(2 π i r S). j=1 G j.

17 Espalhamento de raios X por um cristal = T n= 1 F(S) G(S) exp2 π i(n -1) a.s, F(hkl) = N j=1 f j exp 2 π i(hx j + ky j + lz ) j,

18 Densidade eletrônica F(S) = N j=1 f j exp 2π i( r j.s) = V ρ ( r)exp 2π i( r.s)dv, ρ ( r) = V * F(S) exp - 2π i( r.s)dv *, ρ (xyz) = 1 V h= - k= - l= - F(hkl)exp iα (hkl) exp - 2π i(hx + ky + lz).

19 Problema da fase Iα F (hkl) 2 F ( hkl) = F( hkl) exp( iα) F ( hkl) f exp2πi( hx = N j= 1 j j + ky j + lz j ) 1 ρ( xyz) = F( hkl) exp( iα)exp 2πi ( hx + ky + lz) V h k l

20 Resolução do problema da fase 1 ρ( xyz) = F( hkl) exp( iα)exp 2πi ( hx + ky + lz) V h k l

21 Métodos de resolução do problema da fase 1) Substituição isomórfica múltipla (MIR) 2) Substituição molecular 3) Dispersão anômala múltipla 4)Métodos diretos

22 Refinamento cristalográfico

23 Refinamento cristalográfico E ref = w 2 [ F ( hkl) F ( hkl)] + V A hkl calc obs Iα F (hkl) 2 F( hkl) f exp 2πi( hx = N j= 1 j j + ky j + lz j ) V A = K ( b bo ) + Kθ ( θ θ o) + Kφ[1+ cos( nφ δ )] + [ 12 2 ligações 2 ângulos 2 torção r 1 C q1q 2 b + 6 r Dr ]

24 Arquivo PDB (Protein Data Bank) REMARK Sun Feb 25 14:05: CRYST ORIGX ORIGX ORIGX SCALE SCALE SCALE ATOM 1 CB MET ATOM 2 CG MET ATOM 3 SD MET ATOM 4 CE MET ATOM 5 C MET ATOM 6 O MET ATOM 7 HT1 MET ATOM 8 HT2 MET ATOM 9 N MET ATOM 10 HT3 MET ATOM 11 CA MET ATOM 12 N GLU ATOM 13 H GLU ATOM 14 CA GLU ATOM 15 CB GLU ATOM 16 CG GLU ATOM 17 CD GLU ATOM 18 OE1 GLU ATOM 19 OE2 GLU ATOM 20 C GLU ATOM 21 O GLU ATOM 2807 CD1 LEU ATOM 2808 CD2 LEU ATOM 2809 C LEU ATOM 2810 O LEU Unidades Å=10-10 m

25 Refinamento cristalográfico F( hkl) f exp 2πi( hx = N j= 1 j j + ky j + lz j ) REMARK Written by O version REMARK Sun Feb 25 14:05: REMARK Walter F. de Azevedo Jr. CRYST ORIGX ORIGX ORIGX SCALE SCALE SCALE ATOM 1 CB MET ATOM 2 CG MET ATOM 3 SD MET ATOM 4 CE MET ATOM 5 C MET ATOM 6 O MET ATOM 7 HT1 MET ATOM 8 HT2 MET ATOM 9 N MET ATOM 10 HT3 MET ATOM 11 CA MET ATOM 12 N GLU ATOM 13 H GLU ATOM 14 CA GLU ATOM 15 CB GLU ATOM 16 CG GLU

26 Campo de força empírico V ligações = 1 2 K ligações b ( b b o 2 ) 1 V ângulos = K 2 ângulos θ ( θ θ o 2 )

27 Campo de força empírico V torção = 1 2 torção K φ [1 + cos( nφ δ 2 )]

28 Campo de força empírico V LJ = C [ 12 6 átomos r A r ] V eletrostático = q q Dr [ 1 2 c argas ]

29 Função energia potencial de sistemas biomoleculares V A = K ( b bo ) + Kθ ( θ θ o) + Kφ[1+ cos( nφ δ )] + [ 12 2 ligações 2 ângulos 2 torção r 1 C q1q 2 b + 6 r Dr ] onde: K b =constante de ligação; K θ = constante para ângulos; K φ = constante para ângulos de torsão; b é a distância de ligação entre dois átomos; b o é a distância ideal; θ é o ângulo da ligação química; θ o é o ângulo ideal; A e C: constantes para o potencial de Lennard-Jones q 1 e q 2 : carga de átomos não ligados r é a distância entre átomos não ligados.

30 Simulações de dinâmica molecular H = K + V K ρ f i = 1 2 i N i= 1 ρ = m a i ρ m i v = m 2 i i d 2 ri 2 dt ρ T = 2 N k gl B K

31 H = K + V

32 H = K + V

33 Refinamento cristalográfico Geração de informações moleculares Refinamento de corpo-rígido Refinamento posicional Refinamento de SA Refinamento de fator de vibração térmica Análise da estrutura

34 Análise da qualidade da estrutura

35 R-fator e R-livre R factor = hkl F obs ( hkl) F hkl F obs calc ( hkl) ( hkl) F( hkl) f exp 2πi( hx = N j= 1 j j + ky j + lz j ) E ref = w 2 [ F ( hkl) F ( hkl)] + V A hkl calc obs

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37 Diagrama de Ramachandran

38 Caso de estudo: Estudo Cristalográfico da PNP

39 Human PNP Purine nucleoside phosphorylase (PNP, EC ) catalyzes the reversible phosphorolysis of the ribonucleosides and 2 -deoxyribonucleosides of guanine, hypoxanthine, and a number of related nucleosides.

40 Crystallization of human PNP We crystallized human PNP in the conditions described earlier (Cook et al., 1981). In brief, a PNP solution was concentrated to 12 mg/ml against 10mM potassium phosphate buffer (ph 7.1). Hanging drops were equilibrated by vapor diffusion at 25 o C against reservoir containing 19% saturated ammonium sulfate solution in 20 mm citrate buffer (ph 5.3). Rhombohedral-shaped crystals with dimensions up to 0.5 mm were obtained overnight. Cook, W. J., Ealick, S. E., Bugg, C. E., Stoeckler, J. D. & Parks, R. E., Jr. (1981) J. Biol. Chem., 256,

41 Table 1. Data collection and refinement statistics. a, b, c (Å), α, β, γ ( o ) , , , 90.0, 90.0, Space group R32 Number of Measurements with I>2 σ(i) Number of Independent Reflections Completeness in the range from to 2.30Å (%) R * sym (%) 8.7 Highest Resolution Shell (Å) Completeness in the highest Resolution Shell (%) 87.6 R * sym in the Highest Resolution Shell (%) 19.7 Resolution range used in the refinement(å) * R factor (%) 20.5 ** R free (%) 22.2 B values + (Å 2 ) Main chain Side chains Waters Sulfate groups Observed r.m.s.d from ideal geometry Bond lengths (Å) Bond angles (degrees) 1.48 Dihedrals (degrees) No. of water molecules 68 No. of sulfate groups 3 *R sym = 100 Σ I(h) - <I(h)> / Σ I(h) with I(h), observed intensity and <I(h)>, mean intensity of reflection h over all measurement of I(h). * R factor = 100 x Σ F obs - F calc /Σ(F obs ), the sums being taken over all reflections with F/σ(F)>2 cutoff.

42 Electron density map of human PNP

43 Electron density map (2F obs - F calc, 1σ cutoff) for the Lys244 region of human PNP solved to 2.3 Å resolution.

44 Ramachandran plots of human PNP structures Analysis for 2 previously solved crystallographic PNP structures present 73.9 % of residues in the most favorable, 23.1% in the additional allowed regions, 1.6% in the generously allowed regions, and 1.4 % in the disallowed region. In the present structure 87.7% of the residues are found to occur in the most favored regions, 11.9% in the additional allowed regions and only one residue in the disallowed region of the plot.

45 Secondary structure of human PNP The structure contains an eight-stranded mixed β-sheet and a five-stranded mixed β-sheet, which join to form a distorted β- barrel. The residues making up the eightstranded sheet are 27-32, 43-50, 67-74, 76-83, , , , and The five-stranded sheet consists of residues , , , , and Seven α-helices surround the β-sheet structure. The α- helices are comprised of residues 7-19, 36-42, , , , , and

46 Trimer of human PNP

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48 Conclusions (1) The use of cryocrystallography techniques allowed an improvement in the resolution of 0,5 Å against the PNP structures solved using unfrozen crystals. (2) The water structure of the active site suggests binding partners for potential ligands. (3) The present structure strongly indicates that previous molecular modeling studies of PNP need to be revised, since they predicted participation of the ε-amino group of Lys244 in substrate binding, such interaction is not observed in the high-resolution structure of bovine PNP in complex with immucilin-h, which presents the side-chain of Lys244 in a conformation close to the observed in the present structure. (4) The analysis of the complex of PNP:immucillin-H explains the structural basis for potency of this strong PNP inhibitor. The procedure adopted to analyse the interaction between PNP and immucillin-h can be used for other inhibitors.

49 Referências Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-Verlag. De Azevedo, W. F. et al. (2003). Crystal structure of human purine nucleoside phosphorylase at 2.3 A resolution. Biochem. Biophys. Res. Commun. 308(3),

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