Subprojeto Identificação: Título do subprojeto: 2. Dados do coordenador do subprojeto 3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto

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1 Subprojeto Identificação: Título do subprojeto: Tratamento de diabetes mellitus tipo 1 com infusão de células-tronco mesenquimais País: Brasil Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq Área: Medicina Código: Dados do coordenador do subprojeto Nome completo: Júlio César Voltarelli Data de nascimento: 17/12/1948 Sexo: Masculino Feminino Nacionalidade: brasileira Endereço eletrônico: jcvoltar@fmrp.usp.br 3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Universidade de São Paulo Sigla: USP Órgão (instituto, faculdade, etc): Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Unidade (departamento, laboratório, etc): Departamento de Clínica Médica, Divisão de Imunologia Clínica Cargo/função: Professor Titular 4. Resumo do subprojeto (Caracterização do problema e Justificativa) Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto. O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença auto-imune (DAIs) inflamatória, mediada por células T auto-reativas e caracterizadas pela destruição seletiva de células β pancreáticas produtoras de insulina. A suscetibilidade ao DM-1 é determinada por fatores genéticos e ambientais. A doença clínica manifestase somente após destruição de aproximadamente 80-90% das células β. 1 O processo destrutivo das células β leva à falta do hormônio insulina, que resulta num estado de hiperglicemia e suas complicações agudas e crônicas. Se não tratados, os distúrbios metabólicos levam progressivamente à depressão do sistema nervoso central, coma e morte. Assim, pacientes necessitam de tratamento permanente com insulina exógena para sobrevivência. Entre as complicações crônicas graves estão os problemas vasculares que levam à insuficiência renal, cegueira, doença cardíaca e úlceras crônicas. O DM-1 é tratado pela terapia convencional com insulina ou terapia intensiva com insulina. Ensaios clínicos com imunossupressores, anticorpo monoclonal anti-cd3 e o transplante de ilhotas pancreáticas vêm sendo realizados com resultados significativos, mas insuficientes para aplicação clínica rotineira. 1 Esse cenário estimula novas pesquisas acerca de alternativas terapêuticas, tais como a diferenciação in vitro de células-tronco humanas em células β pancreáticas para transplante e tratamento do DM-1 com células-tronco adultas. Nesse contexto, as células-tronco mesenquimais (CTMs) representam uma fonte de células-tronco adultas ideal para terapia celular em virtude de seu fácil isolamento, expansão in vitro e capacidade imunossupressora, imunoreguladora e regenerativa. 2 Trabalhos recentes demonstraram um efeito terapêutico satisfatório após infusões de CTMs em de diabetes auto-imune 3,4 e em pacientes portadores de doença do enxerto-versushospedeiro 5, doença cujos mecanismos imunológicos assemelham-se aos das doenças auto-imunes. Com base nesses estudos publicados, nossa hipótese é que a agressão auto-imune no pâncreas possa ser controlada através das CTMs, pois após a infusão nos pacientes diabéticos elas migram preferencialmente para o tecido pancreático inflamado, promovem imunossupressão local e estimulam os mecanismos de regeneração locais através de efeitos parácrinos, que envolvem a produção de moléculas antiinflamatórias e imunoreguladoras e de fatores de crescimento e angiogênicos. Desse modo, nosso objetivo nesse projeto é avaliar a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão CTMs alogênicas no tratamento de DM-1 recém-diagnosticado em humanos e. Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, células T de memória, células NKT e células T CD4 + e CD8 + reguladoras; dosagem de citocinas no soro; repertório de células T; freqüência de células T auto-reativas anti-células β pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs. Paralelamente aos estudos em humanos, propomos avaliar nesse projeto os mecanismos imunológicos detalhados e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica de dois modelos de diabetes auto-imune experimental (um modelo geneticamente determinado e o outro quimicamente induzido) à infusão de CTMs humanas. Avaliaremos nestes modelos a modulação da resposta auto-imune patogênica pelas CTMs, bem como o papel das CTMs na regeneração do tecido pancreático lesado pela agressão auto-imune, na fase inicial da doença. Os resultados obtidos neste projeto demonstrarão o efeito terapêutico da infusão de CTMs no tratamento do diabetes auto-imune em humanos, bem como elucidarão os mecanismos de ação

2 imunológicos e regenerativos envolvidos nessa resposta terapêutica através dos estudos em modelos animais de diabetes auto-imune. Se demonstrada uma boa eficácia terapêutica, a infusão de CTMs pode se tornar uma alternativa terapêutica para o tratamento do DM-1, que constitui uma doença auto-imune associada à baixa qualidade de vida em longo prazo e necessidade de tratamento crônico. 5. Objetivos Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto. Este projeto tem como objetivo geral avaliar a segurança, o efeito terapêutico e os mecanismos de ação da infusão de células-tronco mesenquimais (CTMs) humanas no tratamento de diabetes mellitus tipo 1 recém-diagnosticado. Para isso estabelecemos os seguintes objetivos específicos: Avaliar a segurança (efeitos tóxicos, complicações infecciosas e neoplásicas, mortalidade) da infusão endovenosa de CTMs alogênicas de doador relacionado em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1 recém-diagnosticado; Avaliar o efeito terapêutico das CTMs sobre a lesão auto-imune no pâncreas endócrino em humanos (níveis de glicemia de jejum, de peptídeo-c e de hemoglobina glicosilada antes e após a infusão das CTMs; necessidades de insulina exógena antes e após a infusão das CTMs); Avaliaremos a resposta imunológica (freqüência de subpopulações de células T naive, células T de memória, células NKT e células T CD4 + e CD8 + reguladoras; dosagem de citocinas no soro; repertório de células T; freqüência de células T auto-reativas anti-células β pancreáticas) nos pacientes em diversos períodos após a infusão das CTMs; Avaliar os mecanismos imunológicos envolvidos na resposta terapêutica (modulação da resposta imune patogênica pelas CTMs no pâncreas e baço dos animais; papel de células T reguladoras) de camundongos diabéticos NOD (modelo de diabetes geneticamente determinado; fase inicial da doença) e C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes induzido quimicamente; fase inicial da doença) à infusão de CTMs humanas; Avaliar os mecanismos regenerativos envolvidos na resposta terapêutica (papel das CTMs humanas infundidas na regeneração do tecido pancreático pela análise da fusão das CTMs humanas com células β pancreáticas murinas) de camundongos diabéticos NOD (modelo de diabetes geneticamente determinado) e C57BL/6 tratados com estreptozotocina (modelo de diabetes induzido quimicamente) à infusão de CTMs humanas. 6. Plano de trabalho Descrever as etapas de execução do subprojeto. Isolamento, expansão e infusão de CTMs em 14 pacientes com diabetes mellitus tipo 1 (1º e 2º ano); Avaliação da resposta clínica e laboratorial dos pacientes após a infusão das CTMs(1º, 2º e 3º ano); Avaliação da resposta imunológica dos pacientes após a infusão das CTMs (1º,2º e 3º ano); Padronização e caracterização dos modelos de diabetes auto-imune espontâneo em camundongos NOD e induzido por estreptozotocina em camundongos C57BL/6 (2º ano); Infusão de CTMs humanos nos camundongos diabéticos (2º ano); Avaliação dos mecanismos de ação imunológicos e regenerativos envolvidos na resposta terapêutica dos animais diabéticos à infusão de CTMs humanas (2º ano). 7. Metodologia Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida. Serão tratados 14 pacientes com DM-1 recém-diagnosticados (há menos de quatro semanas; anticorpo anti-gad65 positivo) pela infusão de CTMs alogênicas na Unidade de Transplante de Medula Óssea do Hospital das Clínicas da FMRP-USP. Este projeto de pesquisa e respectivo termo de consentimento livre e esclarecido foram aprovados pelo Comitê de Ética em pesquisa local e nacional. O doador de medula óssea (MO) será um familiar saudável do paciente diabético, selecionado conforme a tipagem de HLA. Será optado preferencialmente pelo doador que não apresente HLA diabetogênico (DRB1*03 e/ou *04 e DQB1*0201 e/ou *0302). O doador de MO será submetido à coleta de aproximadamente 100 ml de medula óssea (MO) através de punções de crista ilíaca posterior direita. As amostras de MO dos doadores serão processadas no Laboratório de Terapia Celular do Centro de Terapia Celular (CEPID-FAPESP) do Centro Regional de Hemoterapia do HC-FMRP-USP. As CTMs serão cultivadas nesse laboratório em ambiente estéril e com reagentes estéreis, dentro de padrões estritos de controle de qualidade para a produção de componentes celulares para infusão em humanos (padrão GMP, good manufacturing practice). Serão colhidas amostras MO de outros indivíduos saudáveis (doadores voluntários de medula) para isolamento de CTMs para infusão nos de diabetes. As células mononucleares da MO dos pacientes serão isoladas por centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll Hypaque TM, d=1,077). Para o isolamento e cultura de CTMs, 4x10 7 células mononucleares da MO serão suspensas em meio de cultura α-mem com 15% de soro bovino fetal (SBF), plaqueadas em garrafa de 175 cm 2, e cultivadas em incubadora a 37 C com 5% de CO2. Após 3 dias, as células não-aderentes

3 serão removidas e serão adicionados 50 ml de meio de cultura. O meio de cultura será trocado a cada 3-4 dias e quando as células estiverem semi-confluentes, estas serão tripsinizadas e repicadas (primeira passagem). As CTMs serão submetidas a sucessivas passagens (3-5) até que se adquira número de células suficiente para o procedimento (1-2 x10 6 /kg do paciente em cada infusão). Três dias antes da infusão das CTMs no paciente, o SBF do meio de cultura será substituído por soro autólogo (a 5-10%). Serão feitas duas infusões de CTMs, com o mesmo número de células (1-2 x10 6 /kg), separadas por um período de 30 dias. Amostras das CMTs serão separadas antes da infusão para: 1, caracterização imunofenotípica e morfológica ; 2, caracterização citogenética; 3, diferenciação em adipócitos e osteócitos; 4, avaliação da capacidade imunossupressora in vitro. Após a infusão das CTMs, o paciente será monitorado semanalmente até D+60 pós-infusão e depois a cada três meses. O monitoramento será realizado por exames clínicos e laboratoriais (que incluem dosagem dos níveis de glicemia de jejum, níveis de peptídeo-c, níveis de hemoglobina glicosilada). Será colhido sangue periférico dos pacientes para o estudo da resposta imunológica nos dias +1,+2, +7, +14, +30, +60, +180, +270, +360 e em seguida semestralmente, após a infusão das CTMs. Com o objetivo de estudarmos os mecanismos imunológicos e regenerativos de ação da infusão de CTMs humanas (isoladas de medula óssea) no tratamento do diabetes auto-imune experimental, utilizaremos um modelo de diabetes geneticamente determinado (camundongos NOD, Non-Obese diabetic mouse) e um modelo de diabete auto-imune quimicamente induzido pela administração de estreptozotocina (STZ) em camundongos C57BL/6. Os camundongos C57BL/6 (machos, 8 semanas de idade) serão submetidos à administração de 5 doses diárias e consecutivas de STZ. Cinco dias após a última dose de STZ (fase inicial da doença) os camundongos C57BL/6 receberão, por via endovenosa, a infusão de CTMs humanas. Os camundongos NOD fêmeas com 12 semanas de idade (fase inicial da doença) serão infundias com CTMs humanas. Após a infusão das CTMs, os camundongos serão monitorizados 2 vezes por semana em relação à glicemia e ao peso. Após 10, 17, 24, 32 e 60 dias da infusão das CTMs, os animais serão sacrificados e serão coletados o pâncreas, o baço e o soro desses animais para ensaios imunológicos (citometria de fluxo, ELISA, imunohistoquímica, imunofluorescência). Avaliaremos a ocorrência de fusão entre CTM humanas e células β pancreáticas murinas pela técnica de FISH usando marcação concomitante com sondas anti-cromossomo X murino e anti-cromossomo X ou Y humano. Para avaliar se as CTM humanas são capazes de diferenciarem-se em células β pancreáticas produtoras de insulina, será realizada imunohistoquímica usando anticorpos anti-insulina humana. Em alguns experimentos, as CTMs serão infectadas com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ estudos de migração e permanência das CTMs no tecido lesado. 8. Referências 1. Atkinson MA, Eisenbarth GS. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet. 2001; 358(9277): Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Reviews Immunology. Advance online 18 August 2008; doi: /nri Anderson MS, Bluestone, JA. The NOD mouse: a model of immune dysregulation. Annu Rev Immunol. 2005;23: Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, Prockop DJ. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proc Natl Acad Sci U S A Nov 14;103(46): Le Blanc K, Frassoni F, Ball L, Locatelli F, Roelofs H, Lewis I, Lanino E, Sundberg B, Bernardo ME, Remberger M, Dini G, Egeler RM, Bacigalupo A, Fibbe W, Ringdén O. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet May 10;371(9624): Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores. Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento. Nome CPF Objetivo/Justificativa Função no Experiências Titula Júlio César Voltarelli Dimas Tadeu Covas Karen Lima Prata da atividade Coordenação do projeto; tratamento dos pacientes Análises dos resultados de caracterização fenotípica, genética e funcional das CTMs Análises de controle de qualidade do Laboratório projeto (Médico hematologista e imunologista) Responsável legal pelo Laboratório de Terapia Celular (Médica - Aluna de anteriores imunologia clínica e transplantes de medula células-tronco hemoterapia, ção

4 Maristela Delgado Orellana Carlos Eduardo Couri Maria Carolina de Oliveira Kelen Cristina R. M. de Farias Fábio Morato de Oliveira Leandra Naira Zambelli Ramalho Patrícia Vianna Bonini Palma Maria Angélica Miglino de Terapia Celular doutorado) biologia celular e criobiologia Expansão das CTMs em laboratório de terapia (Técnica biologia celular e celular (condições GMP) responsável) criobiologia Tratamento dos pacientes Tratamento dos pacientes Experimentos de análise da capacidade imunossupressora das CTMs e avaliação da resposta imune dos pacientes tratados Análises citogenéticas das CTMs por bandamento G e análises dos resultados de FISH (modelos animais) Análises histopatológicas de pâncreas Análises de citometria de fluxo Infecção das MSCs com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ (Médico) (Médica - Aluna de doutorado) Responsável por Laboratório Responsável por Laboratório endocrinologia Imunologia clínica imunologia celular e aplicada citogenética patologia citometria Mestre Mestre BSc Patrícia Cristina Baleeiro Beltrão Braga Lindolfo da Silva Meirelles Juliana Navarro Ueda Yaochite Infecção das MSCs com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ Análises dos resultados dos Realização dos experimentos dos Investigator (Aluna mestrado) e biologia molecular Experiência com Experiência com 10. Fontes de financiamento Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados) Fonte de Financiamento Título Vigência Valor Relação com a presente solicitação FINEP (Convênio Nº Transplante de células-tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes (encerrado) R$ Auxílio financeiro à linha CNPq (Processo Nº /2005-1) FAPESP (Processo Nº ) Transplante de células tronco hematopoéticas para diabete melito do tipo 1 e doenças neurodegenerativas 2005-final 2008 R$ CTC-CEPID 2001-atual R$ (por ano) BSc Auxílio financeiro à linha Auxílio financeiro à linha 11. Contrapartida das instituições participantes Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos (horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens. Não se aplica 12. Orçamento justificado e adequado com a proposta Formulário anexo 13. Bolsas

5 Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV) Modalidade Duração Quantidade DTD II 36 meses Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação: Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES Não se aplica