Transplante de células-tronco
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- Denílson Back Marroquim
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1 Transplante de células-tronco no diabetes mellitus Estamos vivendo um período de descobertas na medicina como um todo. O transplante de células-tronco e a terapia celular têm deixado de ser vistos como tema de ficção científica e estão passando a fazer parte do noticiário da mídia leiga e das revistas científicas de primeira linha. Como a maioria dos médicos não frequentou disciplinas formais de terapia celular na sua formação, uma grande lacuna ainda existe neste campo de conhecimento. Com isso, o objetivo deste capítulo será fazer uma atualização geral sobre células-tronco e mostrar o que há de estudos clínicos até o momento relacionados com o diabetes mellitus. Divisão simétrica Divisão assimétrica Figura 1 Processo de divisão simétrica (autorrenovação) e assimétrica (diferenciação em células mais maduras) das células-tronco. ENTENDENDO MELHOR AS CÉLULAS-TRONCO Células-tronco são um tipo especial de células, relativamente pouco frequentes em adultos e que têm duas características básicas e principais (Figura 1): Auto-renovação, ou seja, ser capaz de se dividir e se autoperpetuar (divisão simétrica). Formação de células mais maduras ou mais diferenciadas (divisão assimétrica). 1 DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS-TRONCO Cada tipo de célula-tronco tem potencial diferente de promover o fenômeno de diferenciação celular, ou seja, transformar-se em uma célula mais madura. Sem dúvida, a célula com maior capacidade de diferenciação é a célulatronco totipotente. Esta célula é o resultado das primeiras divisões celulares ocorridas a partir do zigoto. Ela tem capacidade de se diferenciar em todos os tecidos do embrião e também nos anexos embrionários, como placenta. Essa célula não tem sido utilizada como potencial ferramenta terapêutica em doenças humanas. Após vários ciclos de divisão celular a partir do zigoto, as células-tronco perdem a capacidade de formar tecidos placentários, mas mantêm a capacidade de formar todos os tecidos das três principais camadas do embrião (endoderma, mesoderma e ectoderma). A essa célula damos o nome de célulatronco embrionária, que é considerada uma célula-tronco pluripotente. 1 As células-tronco embrionárias (CTE) se localizam na massa interna do blastocisto em torno do 15 o dia de fertilização. A cultura de CTE de animais ocorreu na década de 1960, porém somente em 1998 James Thomson cultivou a primeira linhagem humana de CTE. Em 2008, o Brasil desenvolveu sua primeira linhagem de CTE humanas para pesquisas. Em cultivo de laboratório, as CTE apresentam uma capacidade muito característica que as distinguem de outras células-tronco: a capacidade de gerar teratomas. Por isso é que no seu uso terapêutico as CTE nunca 370
2 Diretrizes SBD podem ser injetadas diretamente em um paciente, pois gerariam teratomas. Classicamente, a forma de se driblar este inconveniente é diferenciando esta CTE in vitro em células mais especializadas de interesse e, em seguida, infundi -las no paciente em questão. Esta diferenciação in vitro é feita cultivando as CTE juntamente com fatores de crescimento e diferenciação já conhecidos e numa sequência predeterminada, Em 2010, a empresa privada americana Geron Corporation obteve a primeira aprovação pelo FDA para dar início ao uso de pesquisa em humanos com CTE. Foram incluídos quatro pacientes com lesão total em medula espinhal e foram infundidos oligodentrócitos derivados de CTE nestes pacientes. O estudo ainda não foi publicado e, infelizmente, por motivos financeiros as pesquisas com CTE deste grupo foram paralisadas no final de Em janeiro de 2012, porém, foi publicado o primeiro estudo que avaliou o efeito da infusão de células da retina diferenciadas a partir de CTE. Dois pacientes com amaurose devido à degeneração macular foram incluídos e os resultados iniciais parecem promissores. 2 Um dos grandes obstáculos ao uso de CTE é o fato de o material genético delas ser diferente do receptor destas células, sendo obrigatório o uso concomitante de imunomoduladores para evitar a rejeição destas células. Na tentativa de driblar o entrave da rejeição na terapia com CTE, em 2007, o grupo japonês Shinya Yamanaka desenvolvou as chamadas ips - induced plutipotent stem cells. A partir de células adultas, como por exemplo fibroblastos da pele do paciente, pesquisadores introduzem um vírus que carreia genes capazes de induzir esta célula madura a retornar ao estágio de CTE. Com isso, se consegue driblar dois pontos cruciais da terapia com CTE: a rejeição e questões religiosas concernentes ao QUADRO 1 Lei de biossegurança sobre o uso de células-tronco embrionárias em pesquisas Lei de Biossegurança (Lei n de 24/03/2005) Art. 5: É permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utilização de células-tronco embrionárias obtidas de embriões humanos produzidos por fertilização in vitro e não utilizados no respectivo procedimento, atendidas as seguintes condições: Sejam embriões inviáves Congelados há 3 anos ou mais Consentimento dos genitores Pesquisas que utilizam essas células deverão submeter seus projetos a comissões de ética em pesquisa uso de embriões. Até o momento, não há pesquisas em humanos com as ips. 1 No Quadro 1 encontra-se a íntegra da lei de biossegurança que regulamenta as pesquisas com CTE no Brasil. As células-tronco multipotentes são células com capacidade de se diferenciar em um grupo menor de células, como, por exemplo, a célula-tronco hematopoética presente na medula óssea ou também as células-tronco de sangue de cordão umbilical, que são capazes de se diferenciar em grupos limitados de células, como as células sanguíneas e do sistema imunológico. 1 Muitas vezes se acha que as células-tronco de sangue de cordão umbilical sejam embrionárias, mas na realidade são consideradas células-tronco adultas, maduras. Classicamente, as célulastronco de sangue de cordão também são capazes de promover hematopoese. Outro exemplo importante de células-tronco multipotentes são as células-tronco mesenquimais. Elas estão presentes em quases todos os tecidos adultos (inclusive tecido adiposo) e têm a função de reparo tissular na maioria deles. Está presente também na camada média dos vasos sanguíneos. Classicamente, estas células se caracterizam por se diferenciar in vitro em condrócitos, osteócitos e adipócitos. Muitos estudos porém têm demonstrado sua capacidade de se diferenciar em outras células das 3 camadas, como, por exemplo, células beta pancreáticas, miócitos, oligodentrócitos etc. 1 Uma grande vantagem do uso terapêutico dessas células é que elas não expressam moléculas de HLA classe II, ou seja, podem ser coletadas de um indivíduo e infundidas em outro sem haver rejeição. Um bom exemplo de células-tronco unipotentes é a célula-tronco endotelial. Esta célula tem a capacidade de se diferenciar apenas em células endoteliais e vasculogênese. 1 Em suma, como pôde ser visto, as células-troco têm potencialidades variadas de acordo com o tipo de célula e podemos ver que as células-tronco não são exclusividade dos embriões. DIABETES TIPO 1: USANDO TERAPIA CELULAR PARA DRIBLAR A AUTOIMUNIDADE E PRESERVAR A MASSA DE CÉLULAS BETA RESIDUAL De maneira geral, o diabetes tipo 1 (DM1) é considerado uma doença mediada por células T. O linfócito T 371
3 tem papel fundamental na gênese do DM1, pois quando este linfócito é ativado por meio de seu receptor ele pode orquestrar tanto imunidade contra infecções quanto gerar fenômeno de autoimunidade, dependendo do alvo. Células T secretam grande quantidade de citocinas em resposta à ativação desencadeada por cada tipo de antígeno que lhe é apresentado. Baseado no perfil de secreção de citocinas, os linfócitos T são designados T H 1, T H 2 e T H 17 frente à exposição a diferentes antígenos em diferentes situações. 3 Para a ativação dos linfócitos T são necessários três passos. No início do processo fisiopatológico do diabetes tipo 1 ocorre um enlace entre a célula apresentadora de antígenos (CAA) e o linfócito T. O primeiro passo é a ligação mediada pelo HLA classe II expresso pela CAA e o receptor do linfócito T. Para o processo de ativação dos linfócitos T continuar é necessário um segundo passo, que pode ser medido pela expansão clonal dos linfócitos. Este segundo passo, ou coestimulador, é feito, por exemplo, pela ligação da molécula CD28 do linfócito T com a CD80 da CAA. Estes dois passos são necessários para se tentar evitar respostas imunes inespecíficas ou autoimunes. A CAA é que determina a progressão ou não para o terceiro passo, que é a migração do linfócito T para os tecidos linfóides, e regulam sobremaneira o desenvolvimento do perfil de secreção de citocinas que, em última análise, favoreceram o surgimento da autoimunidade celular. 3 Os linfócitos Th1 com sua produção de interferon-γ parecem ser um dos mais importantes mediadores do processo de autoimunidade no DM1. Isto pode ser avaliado em camundongos diabéticos não-obesos (NOD), pois quando se infunde fator indutor de interferon-γ e interleucina-12 (potentes indutores de interferon-γ), o processo de insulite aumenta em paralelo. 13 Outros linfócitos, porém, parecem ter um importante papel na fisiopatologia do DM1: são os Th17, produtores de interleucina-17, e também os Th2, produtores de interleucina-4, 5, 10 e 13. Anteriormente, avaliavase que os linfócitos T H 2 tivessem um papel protetor no DM1, atualmente se observa que também podem apresentar propriedades indutoras do processo autoimune e de insulite no DM1. 3 Desde a década de 1970, quando se demonstrou o papel crucial da autoimunidade na destruição da massa de células beta, diversos aspectos foram especulados como sendo os passos iniciais ou gatilhos para o início de todo o processo. Independente dos gatilhos, ao contrário do que se pensava anteriormente, o processo de autoimunidade se inicia meses a anos antes do diagnóstico clínico de DM1, quando o paciente apresenta sinais e sintomas agudos de hiperglicemia. Diversos estudos foram realizados em pacientes com diagnóstico recente de DM1 utilizando terapias imunossupresoras ou imunomoduladoras, como por exemplo prednisona, azatioprina, ciclosporina, proteína de choque térmico, rituximab, abatacept, vitamina D etc. Entretanto, a maioria dos pacientes permaneceu em uso de insulina em quantidade semelhante ao grupo controle e os níveis de peptídio-c permaneceram em queda ou estáveis ao longo de um seguimento máximo de 1 ano. 3 Com base na ideia de preservação da massa de células beta residual, em 2003 de forma pioneira mundialmente, nosso grupo de pesquisadores do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto - USP iniciou os estudos com terapia celular na tentativa de bloqueio da autoimunidade. A imunossupressão intensa seguida por transplante autólogo de célulastronco hematopoéticas tem o intuito de realizar um reset imunológico, ou seja, desligar o sistema imunológico quase totalmente e religá-lo com células-tronco hematopoéticas autólogas. Vale à pena ressaltar que o objetivo do uso das células-tronco hematopoéticas é regenerar um novo sistema imunológico, não havendo evidências de sua diferenciação em células beta. Com isto o resultado final é preservar a massa residual de células beta ainda não destruída. Diferentemente dos outros estudos prévios que utilizaram outras terapias imunomoduladoras, esta pesquisa conseguiu promover elevação estatisticamente significante dos níveis de peptídio-c por mais de 3 anos em pacientes com DM1 e a maioria dos pacientes conseguiu ficar livre da insulinoterapia exógena por períodos que variaram de 6 meses a 9 anos. Estudos independentes realizados na tentativa de replicar este protocolo mostraram resultados semelhantes na Polônia e na China. Outra técnica de terapia celular utilizada pioneiramente nos anos 2000 pelo grupo da Universidade de Gainesville Flórida, foi a imunomodulação induzida por transplante autólogo de células de sangue de cordão umbilical. O objetivo do estudo foi avaliar o potencial destas células-tronco isoladamente, sem esquema imunossupressor adjuvante em modificar a história natural da doença. Neste estudo foram incluídos pacientes DM1 há menos de 1 ano e com idade média de 5 anos que tinham estocado sangue do próprio cordão umbilical coletados quando no seu nascimento em clínicas privadas. Todavia, não houve diferença na manutenção dos níveis de peptídio-c ao longo de 1 372
4 Diretrizes SBD ano de estudo nenhum paciente se viu livre de insulina exógena. 6 Em 2008, o grupo de Transplante de células-tronco do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto USP deu início ao uso de transplante alogênico de células-tronco mesenquimais em pacientes adultos e pediátricos com DM1 recém-diagnosticado e os resultados estão sendo aguardados. Os estudos anteriormente citados devem ser realizados em pacientes recém-diagnosticados pois ainda apresenta reserva funcional de células beta. Na nossa opinião, protocolos de pesquisa em pacientes com DM1 de longa duração devem incluir não somente a terapia imunomoduladora, mas também uma fonte ativa de células beta. 7 DIABETES TIPO 2: TERAPIA CELULAR COM O INTUITO DE RECONSTITUIR A MASSA DE CÉLULAS BETA E DIMINUIR O PROCESSO INFLAMATÓRIO Atualmente, sabemos que a fisiopatologia do DM2 não se restringe somente ao binômio resistência insulínica e disfunção de células beta, por isso inúmeros defeitos paralelos ocorrem simultaneamente. Um deles é o processo inflamatório subclínico subjacente que permeia esta intrigante doença e pode ser alvo de diversas terapias. Recentemente, um importante estudo em humanos avaliou o papel de um medicamento anti-inflamatório bloqueador do receptor da IL-1, e o resultado foi uma redução da A1C e elevação dos níveis de peptídio-c no período de 14 semanas. 6 Outros medicamentos atualmente estão em estudo, como o anticorpo específico contra o receptor da IL-1β e IKKβ-NF-κB, e os resultados parecem promissores. 8 QUADRO 2 Ações potencialmente benéficas das células-tronco mesenquimais em pacientes com DM2 ALGUNS DEFEITOS DO DM2 RELACIONADOS À INFLAMAÇÃO Obesidade Resistência insulínica Aterosclerose Colonização por agentes infecciosos Insulite e disfunção de células-beta Neste sentido, as células-tronco também podem ser úteis para reduzir o processo inflamatório do DM2, especialmente as células-tronco mesenquimais. No Quadro 2 estão as características que tornam as células-tronco mesenquimais uma excelente e promissora arma contra o DM2. Pequenos estudos foram realizados em humanos por grupos diferentes que avaliaram o papel da terapia celular no DM2. O primeiro foi realizado pelo grupo argentino de Estrada et al. que testaram o efeito da infusão intrapancreática via cateterismo arterial de células autólogas de medula óssea do próprio paciente associado a sessões de oxigênio hiperbárico. O material coletado da medula óssea contém basicamente linfócitos adultos e sangue, mas também contém células-tronco mesenquimais, hematopoéticas e endoteliais. Já o oxigênio hiperbárico está recentemente associado a uma possível maior mobilização de células-tronco endoteliais capazes de reparar os vasos sanguíneos. Neste estudo não controlado de 25 pacientes em insulinoterapia observou-se redução da A1C e da proteína C-reativa e elevação do peptídio-c em 1 ano. A dose média BENEFÍCIOS DO USO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Quimiotaxia para tecidos inflamados Possível diferenciação em células-beta Efeito anti-inflamatório via: proliferação células NK ativação de linfócitos citotóxicos linfócitos reguladores proliferação de linfócitos-beta de insulina se reduziu de 34 para 2,5 unidades ao dia. 9 Estudo semelhante foi realizado pelo grupo indiano de Bhansali et al., sem entretanto usar oxigênio hiperbárico. Após seguimento de seis meses, sete dos dez pacientes incluídos apresentaram redução de até 75% na dose diária de insulina. 10 Em 2011, um estudo chinês incluiu dez pacientes diabéticos de longa duração tipo 2 seguidos por seis meses. A diferença é que neste protocolo foi usado especificamente células-tronco mesenquimais de placenta humana infundidas pela veia periférica três vezes, com intervalo mensal. Neste protocolo houve grande redução dos parâmetros de inflamação, e metade dos pacientes teve redução de mais de 50% na dose diária de insulina. 11 O maior estudo com células-tronco em pacientes com diabetes tipo 2 foi publicado em 2012 por Hu e colaboradores 12. Trata-se de um estudo prospectivo, randomizado, aberto envolvendo 118 pacientes em insulinoterapia e seguidos por 3 anos. Os pacientes receberam material da medula óssea via cateterismo até a artéria pancreática e ao final 32% dos pacientes suspenderam o uso de insulina e 33% tiveram a dose reduzida em mais de 50%. 373
5 REFERÊNCIAS 1. Zago MA, Covas DT. Células-tronco: A nova fronteira da medicina. São Paulo. Atheneu Schwartz SD et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet Jan [Epub ahead of print]. 3. Couri CEB. Patogênese do diabetes tipo 1. In: Sociedade Brasileira de Endocrinologia (Org.). Proendocrino módulo 3 do ciclo 1. São Paulo, Artmed Voltarelli JC, Couri CEB, Stracieri ABPL et al. Autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation in newly dia gnosed type 1 diabetes mellitus. JAMA 2007;297: Couri CE, Oliveira MC, Stracieri AB et al. C-peptide levels and insulin independence following autologous nonmyeloablative hematopoietic stem cell transplantation in newly diagnosed type 1 diabetes mellitus. JAMA. 2009;301: Haller MJ, Wasserfall CH, McGrail KM et al. Autologous umbilical cord blood transfusion in very young children with type 1 diabetes. Diabetes Care. 2009;32: Fiorina P, Voltarelli J, Zavazava N. Immunological applications of stem cells in type 1 diabetes. Endocr Rev. 2011;32: Donath MY, Shoelson SE. Type 2 diabetes as an inflammatory disease. Nat Rev Immunol. 2011;11: Estrada EJ et al. Combined treatment of intrapancreatic autologous bone marrow stem cells and hyperbaric oxygen in type 2 diabetes mellitus. Cell Transplant. 2008; 17: Bhansali A et al. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells Dev. 2009;18: Jiang R et al. Transplantation of placenta-derived mesenchymal stem cells in type 2 diabetes: a pilot study. Front Med. 2011;5: Hu J, Li C, Wang L, et al. Long term effects of the implantation of autologous bone marrow mononuclear cells for type 2 diabetes mellitus. Endocr J. 2012;59(11):
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