VALIDAÇÃO DE MÉTODO ALTERNATIVO PARA PESQUISA DE COLIFORMES TOTAIS E Escherichia coli NA ÁGUA
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- Zaira Lameira Botelho
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1 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ALTERNATIVO PARA PESQUISA DE COLIFORMES TOTAIS E Escherichia coli NA ÁGUA Karina TEIXEIRA PONTELO Marta M Gontijo de AGUIAR RESUMO: :A utilização de kits no controle microbiológico da água é uma alternativa prática, pois elimina etapas de preparação e esterilização de meios de cultura no laboratório de microbiologia. Entretanto, antes de sua implantação na rotina, deve-se analisar a adequabilidade dos testes presentes no mercado. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o kit COLItest para detecção de coliformes totais e E.coli na água. Para tanto foram avaliados os parâmetros de validação de métodos qualitativos: repetibilidade, precisão intermediária, robustez, limite de detecção e especificidade. O Kit COLItest atendeu a todos os requisitos avaliados. Portanto, o método pode ser considerado validado. PALAVRAS-CHAVE: Análise microbiológica da água. Coliformes totais. Escherichia coli. Validação de métodos microbiológicos alternativos. INTRODUÇÃO A água é uma matéria-prima amplamente utilizada na fabricação de produtos farmacêuticos, de biotecnologia, correlatos e cosméticos, sendo de grande relevância para indústria farmacêutica. A qualidade da água necessária para as diferentes etapas de produção vai depender do uso pretendido, levando-se em consideração a natureza, a utilização do produto final e a etapa em que ela será utilizada (PINTO et al., 2010). Assim, a água pode ser classificada em diferentes tipos que devem atender a padrões e limites de qualidade. A água potável é utilizada para o abastecimento dos sistemas de tratamento de água, a partir dela são obtidos os outros diferentes tipos de água como: a água purificada e a água para injetáveis (Figura 1). Quadro 1 lista os principais tipos de água utilizados na indústria farmacêutica, suas características, parâmetros e exemplos de utilização (PIN- TO et al., 2010; SEBRAI, 2010; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). A água potável geralmente é fornecida por abastecimento público em condições apropriadas para o consumo humano. No Brasil, a qualidade da água potável é regulamentada pela Portaria nº 2914 de 2011, que estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano, seu padrão de potabilidade, e dá outras providências (ALVES, 2002; BRASIL, 2011). As fontes e os reservatórios de água potável estão sujeitos a contaminações físicas, químicas e microbiológicas. Assim, para assegurar a baixa contaminação microbiana, uma das medidas tomadas é a adição de um agente antimicrobiano à água potável, sendo o mais utilizado o cloro. Entretanto, falhas nas tubulações ou falta de limpeza nos reservatórios podem fazer com que a concentração do cloro adicionada não seja efetiva. Portanto, a indústria farmacêutica deve realizar testes periódicos para confirmar se a água potável atende aos parâmetros exigidos (BRASIL, 2010; PINTO et al., 2010; THE UNI- TED STATES PHARMACOPEIA, 2011). 246 PÓS EM REVISTA
2 Deve-se reconhecer que não há um método único que seja capaz de detectar todos os contaminantes microbianos potenciais de um sistema de água, sendo praticamente impossível investigar a presença de cada microrganismo patogênico que possa ser transmitido pela água. Adicionalmente, muitos microrganismos estão presentes em pequena quantidade e de forma descontínua. Desta forma, o usual é escolher microrganismos que indiquem a contaminação da água. Esses indicadores estão presentes em quantidade superior à dos microrganismos patogênicos e indicam o grau de contaminação da água (AGUIAR, 2006; CARMO et al., 2008; THE UNITED STATES PHARMACO- PEIA, 2011). Neste contexto, a Portaria 2914 de 2011 determina a pesquisa dos seguintes microrganismos indicadores: coliformes totais, Escherichia coli (Quadro 2). Os coliformes totais englobam um grupo de microrganismos bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, oxidase negativos, capazes de desenvolverem em presença de sais biliares ou tensoativos, além de fermentarem a lactose, com produção de ácido. Esse grupo é constituído, principalmente, pelos gêneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobac- PÓS EM REVISTA l 247
3 ter. A presença destes microrganismos é utilizada para avaliar a eficiência do tratamento e a integridade do sistema de distribuição de água (BRASIL, 2004; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005; PINTO et al., 2010). Os coliformes termotolerantes são um subgrupo das bactérias do grupo coliforme totais que fermentam a lactose também a 44,5 ± 0,2 C em 24 horas. A principal representante desse subgrupo é a Escherichia coli, uma bactéria de origem exclusivamente fecal. Também pertencem a esta classe de bactérias algumas espécies de Klebsiella, Enterobacter, e Citrobacter (BRASIL, 2004; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005). A pesquisa de coliformes pode ser realizada por diferentes técnicas convencionais, sendo o Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater a literatura oficial para análise microbiológica da água potável no Brasil (PINTO et al., 2010; BRASIL, 2011). Dentre as técnicas convencionais pode-se citar: filtração por membrana e fermentação em tubos múltiplos, sendo esta última a mais utilizada. A técnica de tubos múltiplos, para esta análise, é realizada em três fases: fase presuntiva, fase de confirmação e fase completa (STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005). A primeira fase (presuntiva) utiliza como meio de cultura o caldo lauriltriptose e, baseia-se nas características deste grupo de bactérias em produzir ácido e gás a partir da fermentação da lactose. Nesta fase, presumi-se que os micro-organismos que cresceram em presença do tensoativo e que produzem gás a partir da lactose sejam coliformes. Entretanto, como não há outras informações, é necessária a fase de confirmação termotolerantes (KONEMAN et al. 2001; STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005). A fase de confirmação, para coliformes totais, é realizada inoculando uma alíquota de cada tubo positivo da fase presuntiva em caldo bile verde brilhante. Neste meio, os sais biliares têm a função de inibir o crescimento de bactérias não entéricas e o verde brilhante de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas, sendo novamente observada a fermentação da lactose com produção de gás (KONEMAN et al. 2001; STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005). Para confirmação da presença de coliformes termotolerantes é utilizado o caldo EC, que também contém como agente restritivo os sais biliares, sendo esta fase realizada pela inoculação de cada tubo positivo da fase presuntiva, os tubos são incubados a 44,5º C por 24 h (KONEMAN et al. 2001; STAN- DARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005). Na fase completa, a presença de Escherichia coli na água pode ser investigada utilizando o meio de cultura EC-MUG, a partir dos tubos positivos de EC. A Escherichia coli produz a enzima β-glucoronidase, capaz de hidrolisar o substrato MUG (4-methylumbelipheril-b-D-glucuronide) presente no EC-MUG, liberando 4-metilubeliferona. Esta substância, quando exposta a radiação ultravioleta (365 nm), exibe fluorescência azulada (BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL, 2002; STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WAS- TEWATER, 2005). A maior desvantagem das técnicas convencionais é o tempo exigido, sendo desejável reduzir o tempo da análise da água potável. Portanto, durante os últimos anos diferentes técnicas têm sido desenvolvidas (PINTO et al.; 2010). Dentre os métodos alternativos desenvolvidos para pesquisa de coliformes na água tem-se o COLItest, que é composto por um substrato cromogênico e fluorogênico para detecção simultânea de coliformes totais e Escherichia coli, possuindo em sua formulação substâncias, nutrientes e MUG que, devidamente balanceados, inibem o crescimento de bactérias Gram- -positivas, favorecendo o crescimento de bactérias do grupo coliforme e facilitando a identificação de Escherichia coli através da fluorescência e do teste de indol após incubação a 37ºC por horas (, 2011). A utilização de métodos alternativos pela indústria farmacêutica é permitida, desde que, estes tenham sua eficiência comprovada. Adicionalmente, vários critérios devem ser avaliados na escolha de um método, para monitoramento de microrganismos em um sistema de água farmacêutica, incluindo a sensibilidade do método, período de incubação, custo e complexidade metodológica. Após ter sido adequadamente selecionado, deve-se validar o novo método alternativo de modo a garantir que tenha sensibilidade e correlação com o teste oficial (BRASIL, 2003; THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011). Para a validação de um método é inicialmente necessária a identificação do tipo de análise a ser realizada: quantitativa ou qualitativa. No caso da análise de pesquisa de coliformes totais e termotolerantes na água, esta é classificada como uma análise qualitativa, visto que o resultado deverá ser expresso como presença ou ausência. Para que um método analítico qualitativo, não descrito em farmacopéias ou formulários oficiais, seja considerado validado é necessário que sejam avaliados os parâmetros relacionados no Quadro 3. Em caso de grande mudança, como variação de fornecedores e alterações na composição das amostras ou meios de cultura, a revalidação pode ser necessária para adequação do método (BRASIL, 2010). QUADRO 3: Parâmetros para validação de métodos microbiológicos a serem avaliados em ensaios qualitativos. 248 PÓS EM REVISTA
4 A especificidade de um ensaio microbiológico avalia a sua capacidade em detectar a espécie microbiana de referência. Esse estudo se baseia na promoção de crescimento, para demonstrar a presença ou ausência de microrganismos e deve assegurar que a presença de corpos estranhos no sistema de ensaio, não interfira no resultado final do teste (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011). A precisão representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises individuais, quando o procedimento é aplicado múltiplas vezes numa mesma amostra homogênea, em condições idênticas de ensaio. Engloba também a precisão intermediária, definida como a resistência intrínseca às influências exercidas pelas variáveis operacionais e ambientais sobre os resultados do ensaio (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011). O limite de detecção é o menor número de micro-organismos que se pode detectar a partir do método, dentro de uma determinada condição experimental, mas não necessariamente quantificado (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011). Já a robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Os critérios de aceitação devem ser adaptados ao tipo de técnica (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011). Assim, este trabalho teve como objetivo a validação do método analítico alternativo COLItest para determinação da presença de coliformes totais e E. coli na água. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 MATERIAIS Microrganismos: Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027). Meios de cultura: Caldo EC (Difco); Caldo Lauril Sulfato de Sódio (Oxoid) Reagentes: COLItest (LKP diagnósticos); reagente de kovac (Merck); água purificada estéril; solução salina pura estéril. Equipamentos: Espectrofotômetro UV-visível (Shimadzu), estufa de cultura (Jouan), agitador de tubos (Fanem), autoclave (Phonix), lâmpada ultra-violeta 365 nm (Handheld Blacklight Requires 4X AA Batteries). 2.2MÉTODOS: AMOSTRA UTILIZADA PARA VALIDAÇÃO DO MÉTODO: Para validação do método foram utilizadas amostras de água purificada estéril PREPARAÇÃO DOS INÓCULOS A preparação do inóculo foi realizada partir da cultura de PÓS EM REVISTA l 249
5 trabalho, recém-preparada de cada micro-organismo a ser avaliado. Através de uma alça de repique os micro-organimos foram transferidos para solução salina estéril para obtenção de uma suspensão de micro-organismos na concentração de 1 x 108 UFC/mL. Após a padronização do inóculo foram realizadas diluições seriadas, cujo fator de diluição foi 10 e realizada a contagem em placas, para determinar a densidade microbiana obtida em cada diluição. Obteve-se um padrão da concentração utilizada para contaminar as amostras de água a serem analisadas ANÁLISE DE PRESENÇA DE COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES DE ACORDO COM O MÉTODO OFICIAL Foram transferidos 10 ml de água para 10 tubos contendo 10 ml de caldo lauril sulfato de sódio. Bactérias do grupo dos coliformes causam turvação no meio e ou formação de gás, detectado em tubos de Duhran, após horas de incubação a 35º C. Após o período de incubação foram transferidos dos tubos positivos amostras, através da alça de repique, para tubos contendo 10 ml de caldo EC. Estes foram incubados a 44,5ºC, durante 24 horas, a presença de coliformes termotolerantes leva a turvação do caldo EC com formação de gás, detectado em tubos de Duhran (STANDARD METHODS FOR THE EXAMINA- TION OF WATER AND WASTEWATER, 2005) PRESENÇA DE COLIFORMES TOTAIS E E. COLI DE ACORDO COM O MÉTODO ALTERNATIVO Transferir para o frasco do COLItest 100 ml da amostra de água. Adicionar o meio de cultura COLItest e homogeneizar até sua dissolução completa. Incubar o frasco em estufa bacteriológica por horas a 37 C. A partir de 18 horas pode-se interpretar os resultados dos frascos positivos, devendo-se aguardar até 48h de incubação para os frascos negativos. O teste será negativo (ausência de coliformes) quando não houver alteração na coloração (mantêm-se púrpura) após o período de incubação e positivo se houver a mudança da coloração púrpura para a amarela. No caso de resultado positivo deve-se verificar a presença de E. coli através da transferência de 5 ml, do frasco positivo, para um tubo de ensaio. O tubo de ensaio deve ser exposto a luz ultra-violeta (365 nm), o ensaio será considerado positivo para E. coli se houver formação de fluorescência azul. Após a leitura da fluorescência, adicionar no mesmo tubo 0,2 ml do revelador de Indol. O teste será considerado positivo (presença de E.coli) se houver formação de anel vermelho VALIDAÇÃO DO MÉTODO ALTERNATIVO Para validação do método foram avaliados os parâmetros de repetibilidade, precisão intermediária, robustez, limite de detecção e especificidade, conforme diretrizes da The United States Pharmacopeia (2011). A repetibilidade do teste foi avaliada através da análise de três amostras de água purificada estéril, contaminadas com E. coli, em concentrações baixa, média e alta (5, 50 e 500) UFC por 100mL de amostra. O teste foi realizado em triplicata. A precisão intermediária foi analisada através da repetição dos procedimentos descritos para repetibilidade em dias diferentes com analistas diferentes. A robustez do método foi avaliada através da variação de três parâmetros, para isso foram realizados três ensaios: no primeiro houve a variação do volume da amostra (± 5 ml), no segundo houve a variação da temperatura de incubação (± 2 C) e no terceiro houve a variação do tempo de incubação (± 2 h). Estes ensaios foram utilizados para avaliar a resistência do teste as pequenas e deliberadas variações na rotina laboratorial. O limite de detecção do método foi avaliado através da contaminação de amostras de água purificada estéril com concentrações baixas de E. coli (0,05; 0,5 e 5 UFC/100 ml), em triplicata. Para avaliação do limite de detecção do método alternativo foi realizado em paralelo o mesmo ensaio com o método oficial, afim de comparar os resultados obtidos. Para que o método alternativo seja considerado adequado este deve ser equivalente ao oficial, dentro do limite de confiança de 95%, utilizando para esta análise a Tabela de Número mais Provável (NMP). A especificidade do método alternativo foi avaliada através da capacidade do mesmo para diferenciar um micro-organismo que pertence ao grupo dos coliformes e um que não pertence a este grupo. Duas amostras de água purificada estéril foram contaminadas uma com E. coli e a outra com P.aeruginosa, respectivamente, na concentração de 100UFC/100mL. Como controle negativo para este teste foi utilizada uma amostra de água purificada estéril, sem contaminação. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os métodos alternativos qualitativos são uma importante ferramenta para detecção de microrganismos patogênicos e podem facilitar a prática na rotina laboratorial, entretanto os mesmos devem ser validados. Para validação do método alternativo COLItest para análise de coliformes totais e termotolerantes na água foi utilizado como referência os parâmetros estabelecidos pela Farmacopéia Americana em seu método geral <1223> (THE UNITED SATATES PHARMACOPEIA, 2011), já que a Brasil (2003) e a Farmacopéia Brasileira (2010) não contemplam a validação de métodos alternativos microbiológicos. Para avaliação da precisão do método foram avaliados os parâmetros de repetibilidade e precisão intermediária, o método 250 PÓS EM REVISTA
6 alternativo mostrou-se capaz de detectar tanto a presença de coliformes totais quanto E. coli nas três concentrações avaliadas (baixa, média e alta). Nos dois dias diferentes nos quais o ensaio foi realizado, todos os tubos avaliados apresentaram mudança de coloração (lilás para o amarelo), confirmando a presença de coliformes totais. Os tubos apresentaram também a presença de fluorescência, quando expostos à luz ultravioleta, assim como a formação de anel vermelho para o teste de indol, confirmando a presença de E. coli. Assim, o método apresentou repetibilidade e precisão intermediária nestas condições, indicando a precisão dos resultados em todo intervalo do ensaio avaliado. Quando avaliada a robustez do método os resultados demonstram a resistência do teste em todas as variações testadas, assim o método mostrou-se capaz de detectar a presença de coliformes totais e E. coli, mesmo quando o volume ou a temperatura ou o tempo de incubação sofreram pequenas variações. Para avaliação do limite de detecção as amostras de água purificada estéril foram contaminadas com baixas concentrações de E coli (0,05; 0,5 e 5 UFC/100 ml). Os resultados mostraram que o COLItest apresentou alteração da cor púrpura para amarelo, em três tubos na concentração de 5UFC/100mL, dois tubos da concentração 0,5UFC/100mL e não apresentou alteração na concentração de 0,05UFC/100mL. Este ensaio foi realizado em paralelo com o método oficial, para comparação dos resultados. Para o método oficial, obteve-se turvação com formação de gás em apenas dois tubos da concentração de 5UFC/100mL. Embora os número de tubos positivos sejam diferentes nos os dois métodos, os resultados encontram-se dentro do limite máximo e mínino do número mais provável (NMP) (Tabela 1 e Tabela 2), representando a equivalência do método oficial e do COLItest para detecção de coliformes totais e E. coli na água. Tabela 1: Resultados das análises do limite de detecção do método alternativo (COLItest ) Tabela 2: Resultados das análises do limite de detecção do método oficial A especificidade do teste foi demonstrada através da capacidade do mesmo em diferenciar um microrganismo pertencente à classe dos coliformes (E. coli) na água de outro micro- -organismo, que possa estar presente e que não pertença a este grupo (P. aeruginosa). Os tubos contaminados com P. aeruginosa, permaneceram com a cor púrpura e não apresentaram fluorescência, o que era desejado já que este microrganismo não pertence ao grupo dos coliformes totais. Este mesmo comportamento foi observado também para o grupo controle (água purificada estéril sem contaminação). O grupo contaminado com E. coli apresentou coloração amarela e fluorescência, visto que este microrganismo pertence ao grupo dos coliformes totais e é capaz de produzir β-glucoronidase, enzima que hidrolisa o MUG presente no COLItest, resultando em 4-metilubeliferona, substância que, quando em exposta à luz ultravioleta, produz fluorescência (BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL, 2002; STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER, 2005). PÓS EM REVISTA l 251
7 4 CONCLUSÃO Os resultados do presente trabalho demonstraram que o método alternativo COLItest atende aos parâmetros de validação para análises microbiológicas qualitativas especificados pela Farmacopéia Americana (THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2011): repetibilidade, precisão intermediária, robustez, limite de detecção e especificidade para detecção de coliformes totais e E. coli na água, podendo, portanto, ser utilizado em substituição ao método oficial para rotina de análise no laboratório. Association (A.W.W.A.), Water Environment Federation (W.E.F.), DOMINGUES, V.; TAVARES, G.; STÜKER, F.; MICHELOT, T.; REETZ, L.; BERTONCHELI, C. Contagem de bactérias heterotróficas na água para consumo humano:comparação entre duas metodologias.saúde- -Revista da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria,RS. vol 33, n 1: p 15-19, EPA (THE FEM MICROBIOLOGY ACTION TEAM). Method Validation of U.S. Environmental Protection Agency Microbiological Methods of Analysis. Document Number October 7, FARMACOPEIA. Farmacopeia Brasileira. 5 ed. Brasília: Anvisa, v.1, REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, Z.N.; RIBEIRO, M.C.S. Vigilância e Controle das Doenças Transmissíveis. 2. Ed., São Paulo: Martinari, 276p., ALVES, N.C.; ODORIZZI, A.C.; GOULART, F.C. Análise microbiológica de águas minerais e de água potável de abastecimento, Marília, SP. Rev. Saúde Pública, São Paulo, v. 36, n. 6, Dec BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL,. Disponível: gov/food/scienceresearch/laboratorymethods/bacteriologicalanalyticalmanualbam/ucm htm#lst-mug BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE nº899, Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. 29 de maio de BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria nº 518, de 25 de março de Dispõe sobre os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 26 de março de BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução - RDC Nº 17. Dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos. Brasília, DF, BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria nº 2914, de 14 de dezembro de Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Diário Oficial da União, Brasília, DF. 14 dez CARMO, R.F.; BEVILACQUA, P.D; BASTOS, R.K.X. Vigilância da qualidade da água para consumo humano: abordagem qualitativa da identificação de perigos. Eng. Sanit. Ambient., Rio de Janeiro, v. 13, n. 4, Dec Available from < accesso em 15 Mar CLESCERI, L. S., GREENBERG, A. E., EATON, A. D., (Eds.). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th ed. Washington: American Public Health Association (A.P.H.A.),American Water Works FENG, P.; WEAGANT, S.D.; GRANT, M.A. Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. In: NEW HAMPSHIRE: FOOD AND DRU- GS ADMINISTRATION, CENTER FOR FOOD SAFETY & APPLIED NUTRI- TION. Bacteriological Analytical Manual. FDA/CFSAN, KONEMAN, E. W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W. D.; SCHRECKENBERGER, P. C.; WINN, W. C., Jr. Diagnóstico Microbiológico. 5. Ed. Rio de Janeiro: Medsi, KUBICA, R.; IVO, D.A Instrumentação Analítica utilizada na obtenção de Água Purificada para produção de fármacos: Foco na importância da calibração. Labsoft, São Paulo. Vol PELCZAR, M. J. Jr.; CHAN, E. C. S., and KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2.Ed. v. 1 e 2. São Paulo: Makron Books, PINTO, T.; KANEKO, T.; OHARA, M. Controle Biológico de Qualidade de Produtos Farmacêuticos, Correlatos e Cosméticos. São Paulo. Atheneu Editora, 3.Ed SBARAI, C.. Águas Farmacêuticas. Revista Brasileira de Controle de Contaminação. Maio. 46Ed SILVA, A.S.; SEVERO, A.A.L.; DUTRA, R.C.C.; LIRA, R.G.P.; CLEMEN- TINO, Maria Roseane dos Anjos. Revalidação de um sistema de tratamento de água: ações estratégicas da garantia da qualidade em uma indústria farmacêutica. Revista Brasileirado Farmacêutico STANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER AND WAS- TEWATER. American Public Health Association (Alpha); American Water Works Association (Awwa); Water Environment Federation (Wef). 21st edition THE UNITED STATES PHARMACOPOEIA-USP 34 and The National Formulary-NF28.Rockville:The United States Phamacopeial Convention WHO - WORLD HEALTH ORGANIZATION; UNICEF. For water life: making it happen. Geneva PÓS EM REVISTA
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