Isolamento e Identificação de Legionella spp.

Transcrição

1 Isolamento e Identificação de Legionella spp. Milton Costa Departamento de Ciências da Vida, Universidade de Coimbra e Biocant Associação de Transferência de Tecnologia, Cantanhede

2 The Story of Legionella The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia. American Legion Convention July of 1976 Time magazine 182 ill 29 died 39 ill 5 died en.wikipedia.org 2 10 day incubation period - cases were dispersed across Pennsylvania lack of a centralized record of attendance of the convention Symptoms high fever, chills and cough muscle aches and headaches. known methods for culture, serology, tissue staining, and toxicology gave negative results

3 The Story of Legionella The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia. American Legion Convention July of 1976 Time magazine 182 ill 29 died en.wikipedia.org 39 ill 5 died Symptoms high fever, chills and cough muscle aches and headaches. Fraser DW. Lancet Infect Dis. 2005

4 The Story of Legionella Third, a susceptible animal was needed to demonstrate that L. pneumophila could produce disease, particularly a respiratory disease similar to Legionnaires disease in humans. The guinea pig was that animal. L. pneumophila was recovered from infected guinea pigs fulfilling Koch s fourth postulate. The Genesis of Germs (Gillen 2007) First, if the etiological agent were biological, then the agent had to be found to be regularly associated with the disease. Tissues from lung biopsies and sputum samples were examined for a recurring microorganism. A Gramnegative rod with a tendency to form long, looping filaments was consistently detected in specimens. Second, the newly discovered bacterium was isolated in pure culture in the laboratory. This necessitated investigating L. pneumophila s nutritional requirements and designing special growth media that would meet these narrow requirements for bacterial growth.

5 Legionela-busters Legionella pneumophila strains distribution

6 Nascentes termais Primeiros isolamentos de Legionella spp. em tabuleiros de água morna na unidade de prematuros no Hospital Pediátrico de Coimbra. Veríssimo, A., G. Vesey, M. G. Rocha, G. Marrão, J. Colbourne, P. J. Dennis & M. S. da Costa. (1990) A hot water supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. Journal of Hospital Infections, 15: O António Verissimo e eu relacionámos as temperaturas de isolamento de Legionella com temperatura de nascentes termais e decidimos saber se colonizavam nascentes termais.

7 As espécies do género Legionella L. adelaidensis L. anisa L. belardiensis L. birminghamensis L. bozemanii L. brunensis L. busanensis L. cherrii L. cincinnatiensis L. drancurtii L. dresdenensis L. drozanskii L. dumoffii L. erythra L. fairfieldensis L. fallonii L. feeleii L. geestiana L. gormanii L. gratiana L. gresilensis L. hackeliae L. impletisoli L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. lansingensis L. londiniensis L. longbeachae L. lytica L. maceachernii L. massiliensis L. micdadei L. moravica L. nagasakiensis L. nautarum L. oakridgensis L. parisiensis L. pneumophila L. quateirensis L. quinlivanii L. rowbathamii L. rubrilucens L. sainthelensi L. santicrucis L. shakespearei L. spiritensis L. steigerwaltii L. tauriensis L. tucsonensis L. tunisiensis L. wadsworthii L. waltersii L. worsleiensis L. yabuuchiae Cerca de 22 espécies associadas a doença

8 Imunofluorescência indirecta Anticorpos Policlonais Anticorpos Monoclonais para L. pneumophila L. pneumophila sg 1 L. micdadei L. pneumophila sg 2 L. santicrucis L. pneumophila sg 3 L. spiritensis L. pneumophila sg 4 L. steigerwaltii L. pneumophila sg 5 L. wadsworthi L. pneumophila sg 6 L. dumofii L. pneumophila sg 7 L. gormanii L. pneumophila sg 8 L. oakridgensis L. pneumophila sg 9 L. londiniensis L. pneumophila sg 10 L. moravica L. pneumophila sg 11 L. nautorum L. pneumophila sg 12 L. pneumophila sg 13 L. pneumophila sg 14 L. pneumophila sg 15 L. bozemanii sg1 L. bozemanii sg2 L. erythra L. feelei sg1 L. feelei sg2 L. israelensis L. jamestowniensis L. jordanis L. longbeachae sg1 L. longbeachae sg2 L. rubrilucensis MAB 1 MAB 2 MAB 3 W32 33G2 32A12 144C2 W29 P4C3 P9C3 P W36 W W39 JR5 K1 G6 Um flagelante

9 Processar amostras Amostra de água Filtração Norma ISO Concentrado Directo Tratamento calor Tratamento ácido Espalhamento em GVPC Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias BCYE BCYE INC Incubação a 37ºC, 3 a 10 dias

10 Identificação presumptiva Visualização das colónias suspeitas Norma ISO Identificação presumptiva de Legionella spp. BCYE BCYE sem cisteína Purificação Preservação Identificação Latex Ser1, Ser2-14, Ser2-15 Ácidos gordos ou 16s rrna

11 Identificação de Legionella a partir dos perfís proteicos

12 Identificação de Legionella pelos ácidos gordos 6790 amostras examinadas entre 1997 e 2013 para legionelas. Cerca de 1600 estirpes de Legionella identificadas pela análise dos ácidos gordos. Este banco de dados, foi adoptado pela MIDI e estamos agora acreditados dentro da Norma ISO e prnp4422. Em casos de dúvida podemos pesquisar o gene dota for PCR para confirmar L. pneumophila. Mais vulgarmente usamos sequenciação do gene 16S rrna- Temos conservadas um número muito grande de estirpes de espécies de Legionella. As não-pneumophila mais isoladas pertencem a L. oakridgensis, L. londiniensis, L. parisiensis, L. steigerwaltii

13 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Santos, P., I. Pinhal, F. A. Rainey, N. Empadinhas, J. Costa, B. Fields, R. Benson, A. Veríssimo & M. S. da Costa (2003). The Gamma-Proteobacteria, Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov. and Aquicella siphonis, sp. nov., infect protozoa and require activated charcoal for growth in laboratory media. Applied and Environmental Microbiology, 69:

14 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Parentes mais próximos são Rickettsiella (doença em insectos). Rickettsiella spp., parasitas intracelulares, nunca foram cultivadas. Legionella spp. e Aquicella spp. são cultiváveis. Aquicella spp. Crescem só em meios com carvão, extracto de levedura e a-cetoglutarato ou piruvato. Crescimento aeróbio ou microaeróbio. Não cresce em anaerobiose.

15 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Este processo permitiu-nos examinar várias condições de crescimento de Legionella e Aquicella que não seria possível com meios sólidos contendo carvão. Gama de temperatura de crescimento, Gama de ph de crescimento, Substratos assimilados, Meio de cutura líquido Espaçamento de agar Carvão Activado

16 Aquicella lusitana e Aquicella siphonis Algumas coisas não são aquilo que parecem Aquicella spp. infectam Hartmanella vermiformis Hartmannella vermiformis Infecção crónica (10 3 /cell), não é aguda ( /cell) como Legionella spp. Aquicella lusitana Aquicella siphonis Células humans infectadas com Legionella Aquicella spp. não infectam macrófagos humanos

17 AS PESSOAS E AS ORGANIZAÇÔES FINANCIADORAS António Verissímo Fernanda Nobre Joana Costa Graça Rocha Gina Marrão Alexandra Diogo Filipa d Avó Paula Morais Richard Bowker Barry Fields Fundação para a Ciência e a Tecnologia Sociedade das Águas de Luso, SA Cinágua

18 Legionella pneumophila em ambientes aquáticos Joana Costa Instituto Superior de Engenharia do Porto 24 outubro 2013 Workshop "Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água"

19 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Transmissão de Legionella (Fraser, 1984) Ambientes naturais Ambientes intervenção humana Factores de amplificação LEGIONELOSE Inoculação Exposição por uma população susceptível Disseminação

20 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Ambientes aquáticos naturais Ambientes aquáticos artificiais ou de intervenção humana Nascentes quentes Biofilmes Sistemas de distribuição Torres de arrefecimento Lagos Água de profundidade Chuveiros Piscinas Natural spring Rios Nascentes Solo jardinagem Fontes

21 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Fleirmans e colegas em 1981 analisaram centenas de amostras de inúmeros lagos e rios dos Estados Unidos. O estudo detectou legionelas na maioria das amostras, mas apenas 15% provocaram doença em porquinhos da índia. Verificaram ainda um efeito sazonal na detecção de legionelas, aumentando a sua concentração nos meses de verão. Tison e colegas em 1983 realizaram um estudo nos lagos e rios do Monte de St. Helena e detectaram elevadas concentrações de legionelas nas águas termais aquecidas. Estudos realizados em Portugal Continental e no Açores por Veríssimo e colegas também identificaram múltiplas espécies de legionelas em águas com temperaturas entre os 22ºC e os 67.5 C. Apesar das legionelas serem facilmente recuperadas em águas superficiais, só recentemente Costa e colegas conseguiram isolá-las de águas de profundidade, onde se pensa que existam em muito baixas concentrações. L. longbeach representa uma notável excepção, uma vez que é predominantemente isolada de solo. Esta espécie é responsável pela maioria dos casos de Legionelose na Austrália, que ocorrem entre jardineiros.

22 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Concentração bacteriana como factor determinante para a ocorrência de doença Ambientes naturais Ambientes intervenção humana 10 3 a 10 6 leg/l <1% população > 10 6 leg/l 50% população Os ambientes naturais são raramente associados a casos de legionelose. As legionelas multiplicam-se muito lentamente a baixas temperaturas, o que resulta num equilíbrio natural entre a concentração das bactérias e dos seus hospedeiros. Concentração esta abaixo do limite mínimo necessário para causar infecção em humanos. A maioria dos casos de doença está associada a ambientes sujeitos a intervenção humana onde temperatura da água é superior, alterando a concentração quer das bactérias quer dos seus hospedeiros naturais. Assim, variações na temperatura da água podem alterar o equilíbrio entre as legionelas e os protozoários, resultando num aumento rápido da concentração das bactérias, podendo causar doença.

23 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Carácter ubíquo em ambientes aquáticos não salinos temperaturas entre 6ºC e 63ºC óptimo 37ºC valores de ph entre 5.5 e 8.1 oxigénio dissolvido entre 0.3 e 9.6 mg/ml Factores que favorecem o aumento da sua concentração presença de outros organismos zonas de reduzida circulação de água presença de sedimentos

24 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental A presença de protozoários é um factor determinante para a sobrevivência e aumento de concentração de legionelas As legionelas não são bactérias de vida livre, multiplicam-se intracelularmente em vários tipos de protozoa sendo esta relação crucial para a ecologia do organismo. Legionellae multiplica-se no ambiente em: 14 espécies de amoebae 2 espécies de ciliados 1 espécie de Myxomycota Os protozoários são ubíquos em diversos ambientes naturais, como água doce e salgada, água salobra, solos húmidos e em areias secas.

25 Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência Amoeba aprisionando L. pneumophila Acanthamoeba spp. produz vesículas respiráveis contendo legionelas Ciliados expelem vesículas contendo legionelas ciriscience.org Macrófago preenchido com ~100 Legionella Berk et al., 1998 Appl. Environ. Microbiol. Berk et al., 2008 Appl. Environ. Microbiol. C. elegans é um hospedeiro metazoário de legionelas Hilbi et al., 2010 Mol. Microbiol. Brassinga et al., 2010 Mol. Microbiol. A infecção de Humanos por legionelas é um desvio ao seu ciclo de vida natural em amoebae

26 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental O relacionamento entre as legionelas e amebas propicia de facto uma forma de protecção capaz de potenciar a capacidade de sobrevivência destas bactérias a ambientes hostis. biocidas antibióticos stress térmico e osmótico. Provavelmente esta protecção será a explicação mais plausível para o facto das legionelas conseguiram transitar de ambientes naturais para ambientes de intervenção humana, suportando os vários tratamentos a que a água é sujeita.

27 Biofilmes A maior parte da actividade bacteriana na natureza ocorre, não com as células individualizadas, mas com as bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme. Esses biofilmes são constituídos por uma comunidade estruturada de células aderentes a uma superfície inerte (abiótica) ou viva (biótica), embebidas numa matriz de exopolissacárido. A associação dos organismos em biofilmes constitui uma forma de protecção ao seu desenvolvimento, fomentando relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis. Em ecossistemas aquáticos, mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilmes associadas a uma grande variedade de superfícies. Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogéneos, compostos por duas ou mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o crescimento das outras e a adesão de uma dada espécie fornecer ligandos que promovem a ligação de outras. Inversamente, a competição pelos nutrientes e a acumulação de metabolitos tóxicos produzidos pelas espécies colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num biofilme.

28 Biofilmes Cooperação metabólica e disponibilidade de nutrientes Protecção contra: Radiações UV Fagocitose Desidratação Predadores Antimicrobianos Os principais componentes estruturais de biofilmes são: Microrganismos Matriz de exopolímeros Componentes de origem não-biológica as legionelas atingem sistemas de distribuição de água potável, e através deles, mesmo após tratamento da água, permanecem viáveis até ao fim da linha de distribuição de água de hotéis, hospitais e outros edifícios, incluindo torres de arrefecimento de sistemas de ar condicionado, cilindros de aquecimento, torneiras e chuveiros

29 Biofilmes

30 O paradigma de Legionella pneumophila Um estudo de genómica comparada demonstrou que bactérias e vida livre possuem, em regra, genomas maiores do que bactérias intracelulares. Contudo este paradigma não se aplica a bactérias que reside em amibas.

31 O paradigma de Legionella pneumophila Moliner et al., 2009 FEMS Microbiol Rev

32 Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência A capacidade inata das legionelas conseguirem replicar-se em diferentes protozoa equipou estas bactérias com a capacidade de se replicarem em macrófagos alveolares humanos. guinea pig alveolar macrophages infected in vitro with L. pneumophila

33 Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência Bactérias que foram internalizadas por células eucarióticas necessitam de evitar a fusão com o lisossoma ou desenvolver estratégias para sobreviver neste organelo. Bactérias que reside em vacúolos que mantêm as características de endossomas Interagem com a via secretora Reside nos lisossomas Bactérias alteram a via endocítica e estabelecem vacúolos com características únicas Residem na via endocítica Interagem com a via secretora Interagem com a via secretora Residem na via endocítica

34 Ciclo de vida bifásico Adesão e entrada Estabelecimento Replicação Protozoa Saída Macrófago Nucleus Maturação Transmissão a humanos através de aerossóis contaminados Diferenciação Forma Virulenta Intermediário Forma Replicativa Vesícula Fase replicativa Fase transmissiva Adaptado de Garduno, RA In: Legionella pneumophila: pathogenesis and immunity and Molmeret et al., 2004 Microbes Infect.

35 Legionella - Ciclo de vida bifásico Forma replicativa Transição rigorosamente regulada Forma virulenta Expressão de factores relacionados com a virulência Bruggemannet al., 2006 Cell Microbiol Jules and Buchrieser 2007 FEBS Letters

36 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental 53 espécies de Legionella, todas capazes de infectar protozoários 24 espécies foram associadas a casos de doença Yang et al., 2008 IJSEM

37 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental 90% dos casos de Legionelose L. pneumophila sg. 1 Yang et al., 2008 IJSEM

38 Prevalência de Legionella sp. doença vs ambiente Há um bias entre a prevalência de L. pneumophila como principal responsável por casos de doença e a sua distribuição ambiental Total nonpneumophila legionellae; 24,4% L. pneumophila sg 1; 29,1% L. pneumophila sg 2-14; 46,5% Distribuição ambiental L. pneumophila sg. 2-14; 6% Legionella bozemanae, L. micdadei, and L. longbeachae; 7% Other Legionella sp.; 3% L. pneumophila sg.1; 84% L. pneumophila sg.1 corresponde a 30% dos isolados ambientais e a 84% dos isolados clínicos Distribuição clínica

39 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Ambientes artificiais Estirpes clínicas Estirpes clínicas são menos diversas que estirpes de ambientes artificiais L. pneumophila sg1 associada a doença pode não ser devido à sua prevalência no ambiente, mas sim a uma maior capacidade infecciosa. Assim, isolados de ambientes artificiais e clínicos podem constituir um sub-grupo de todos os genótipos existentes especialmente adaptados.

40 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Apesar do seu carácter ubíquo em ambientes aquáticos, a maioria dos estudos em legionelas focam estirpes isoladas de ambientes sujeitos a intervenção humana na tentativa de estabelecer a ligação epidemiológica entre o ambiente e casos clínicos. Ambientes Natural Ambientes artificiais Estirpes clínicas Como as infecções têm origem ambiental e não ocorre transmissão entre pessoas, o estudo da diversidade genética subjacente a variações na capacidade infecciosa de estirpes isoladas de ambientes naturais, bem como de ambientes artificiais e clinicas, é fundamental na determinação de quais os mecanismos críticos no processo infeccioso.

41 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Wild-type L. pneumophila dota Roy and Isberg, 1997 Infect. Immun. Defective for all icm/dotmediated virulence activities Effector protein Invasion and trafficking pore L. pneumophila Lysossm e maior ilha de patogeneicidade, o complexo intracellular multiplication (icm)/defective organelle trafficking (dot) é absolutamente necessário para a multiplicação em amibas e macrófagos

42 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental 80 estirpes naturais 74 estirpes de ambientes de intervenção humana 21 estirpes de referências e tipo (Bumgbaugh et al., 2002; Ko et al., 2002; Costa et al., 2005) 119 estirpes de ambientes de intervenção humana e clínicas não relacionadas (Ko et al., 2006) Estirpes Paris, Lens and Corby (Cazalet et al., 2004; Glöckner et al., 2007)

43 Estrutura da população inferida pelo gene dota IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Alf1 Felg14 JLP1009 IS27 ATCC33153 IZ7 K0135 K0140 SGT50 SG3 ma29 SGT274 K0125 Alf30 K0139 SGT295 Aco13 Felg15 ATCC33154 IS12 ATCC33155 IZ19 JLP1059 JLP1062 Alf31 ACO28 ATCC43283 K0138 Alf9 JLP1012 JLP1016 JLP1018 K0161 IZ4 NCTC11404 K0134 Felg20 SGT284 K0142 IZ75 K0137 K0124 K0131 K0141 JLP1013 K0132 K0133 K0129 K0130 K0136 strainsf9 JLP1038 EDT-3 JLP1060 ED13 ED7 NCTC1191 ATCC33823 JLP1003 Can40 K0151 ACO9 HUC2 HUC4 MUR1 JLP1004 MUR4 MUR7 ATCC43736 SG13 JLP1030 Paris K0143 K0171 K0145 K0167 JLP1061 JLP1005 K0168 K0154 ARN24 JLP1024 K0169 Por19 JLP1055 ATCC35289 JLP1045 JLP1042 JLP1039 JLP1046 JLP1027 ATCC43110 JLP1029 JLP1056 K0159 ATCC43113 K0148 strainolda K0146 K0170 K0172 JLP1040 JLP1010 ARN23 JLP1043 JLP1031 JLP1044 ATCC43107 por9 ATCC33152 K0153 JLP1022 K0163 JLP1053 FELG84 JLP1034 JLP1021 JLP1058 JLP1033 ED10 FELG75 JLP1015 JLP1032 ATCC35096 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAN43 ATCC43106 ATCC43801 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1 Can10 Can5 JLP1002 JLP1011 Can26 JLP1001 JLP1020 ATCC43130 AGN2 K0164 GER8 AGN8 GER81 GER3 Corby JLP1063 K0149 JLP1025 Por3 JLP1023 FELG172 SGT150 AGN3 FELG183 AGN9 Alf22 ALF18 JLP1028 JLP1026 NM1 NM6 NM44 IMC9 Le52 IMC17 IMC23 IMC12 Le73 IMC2 IMC5 IMC15 IMC1 Le66 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT-10 EDT-1 ma34 AGN4 AGN7 FELG215 FELG244 SGT54 SG150 Ger12 SGT ED8 SGT51 SGT327 Le78 SGT53 SGT256 GER10 SG1 SGT129 SGT79 SG82 SGT280 Aco60 ACO5 SG64 SGT302 ACO33 ACO15 ACO41 SGT67 SG69 Le171 JLP1066 Aco29 ATCC43703 SGT286 JLP1068 JLP1054 JLP1070 JLP1069 JLP1064 ma31 Aco22 ATCC43290 ma18 ACO48 Faco3 Aco8 JLP1041 Aco 20 JLP1007 K0162 K0152 JLP1057 FRO6 ALF15 IS1 JLP1071 ma28 ma32 ma1 FRO5 JLP1049 JLP1052 JLP1067 K0126 K0147 ATCC33215 K0127 JLP1006 JLP1037 Faco1 Faco5 Lens ATCC43112 JLP1008 ma16 JLP1036 K0128 JLP1035 ACO12 Aco67 JLP1047 JLP1065 JLP1051 NM18 NM49 NM22 NM53 Le58 Le49 K0157 K0156 K0165 ATCC33216 K0166 K0158 ATCC33735 ATCC33736 ATCC33737 ATCC33156 JLP1017 JLP1014 ATCC35251 JLP dota-a dota-b dota-c dota-d dota-e IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Alf1 Felg14 JLP1009 IS27 ATCC33153 IZ7 K0135 K0140 SGT50 SG3 ma29 SGT274 K0125 Alf30 K0139 SGT295 Aco13 Felg15 ATCC33154 IS12 ATCC33155 IZ19 JLP1059 JLP1062 Alf31 ACO28 ATCC43283 K0138 Alf9 JLP1012 JLP1016 JLP1018 K0161 IZ4 NCTC11404 K0134 Felg20 SGT284 K0142 IZ75 K0137 K0124 K0131 K0141 JLP1013 K0132 K0133 K0129 K0130 K0136 strainsf9 JLP1038 EDT-3 JLP1060 ED13 ED7 NCTC1191 ATCC33823 JLP1003 Can40 K0151 ACO9 HUC2 HUC4 MUR1 JLP1004 IZ47 IZ88 NM19 IZ41 IZ58 Alf1 Felg14 JLP1009 IS27 ATCC33153 IZ7 K0135 K0140 SGT50 SG3 ma29 SGT274 K0125 Alf30 K0139 SGT295 Aco13 Felg15 ATCC33154 IS12 ATCC33155 IZ19 JLP1059 JLP1062 Alf31 ACO28 ATCC43283 K0138 Alf9 JLP1012 JLP1016 JLP1018 K0161 IZ4 NCTC11404 K0134 Felg20 SGT284 K0142 IZ75 K0137 K0124 K0131 K0141 JLP1013 K0132 K0133 K0129 K0130 K0136 strainsf9 JLP1038 EDT-3 JLP1060 ED13 ED7 NCTC1191 ATCC33823 JLP1003 Can40 K0151 ACO9 HUC2 HUC4 MUR1 JLP1004 MUR4 MUR7 ATCC43736 SG13 JLP1030 Paris K0143 K0171 K0145 K0167 JLP1061 JLP1005 K0168 K0154 ARN24 JLP1024 K0169 Por19 JLP1055 ATCC35289 JLP1045 JLP1042 JLP1039 JLP1046 JLP1027 ATCC43110 JLP1029 JLP1056 K0159 ATCC43113 K0148 strainolda K0146 K0170 K0172 JLP1040 JLP1010 ARN23 JLP1043 JLP1031 JLP1044 ATCC43107 por9 ATCC33152 K0153 JLP1022 K0163 JLP1053 FELG84 JLP1034 JLP1021 JLP1058 JLP1033 ED10 FELG75 JLP1015 JLP1032 ATCC35096 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAN43 ATCC43106 ATCC43801 MUR4 MUR7 ATCC43736 SG13 JLP1030 Paris K0143 K0171 K0145 K0167 JLP1061 JLP1005 K0168 K0154 ARN24 JLP1024 K0169 Por19 JLP1055 ATCC35289 JLP1045 JLP1042 JLP1039 JLP1046 JLP1027 ATCC43110 JLP1029 JLP1056 K0159 ATCC43113 K0148 strainolda K0146 K0170 K0172 JLP1040 JLP1010 ARN23 JLP1043 JLP1031 JLP1044 ATCC43107 por9 ATCC33152 K0153 JLP1022 K0163 JLP1053 FELG84 JLP1034 JLP1021 JLP1058 JLP1033 ED10 FELG75 JLP1015 JLP1032 ATCC35096 FELG78 CAN45 CAN44 AQ70 CAN43 ATCC43106 ATCC43801 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1 Can10 Can5 JLP1002 JLP1011 Can26 JLP1001 JLP1020 ATCC43130 AGN2 K0164 GER8 AGN8 GER81 GER3 Corby JLP1063 K0149 JLP1025 Por3 JLP1023 FELG172 SGT150 AGN3 FELG183 AGN9 Alf22 ALF18 JLP1028 JLP1026 NM1 NM6 NM44 IMC9 Le52 IMC17 IMC23 IMC12 Le73 IMC2 IMC5 IMC15 IMC1 Le66 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT-10 EDT-1 ma34 AGN4 AGN7 HRD2 Can30 K0155 AQ71 Le61 ARN25 AQ69 HRD1 Can10 Can5 JLP1002 JLP1011 Can26 JLP1001 JLP1020 ATCC43130 AGN2 K0164 GER8 AGN8 GER81 GER3 Corby JLP1063 K0149 JLP1025 Por3 JLP1023 FELG172 SGT150 AGN3 FELG183 AGN9 Alf22 ALF18 JLP1028 JLP1026 NM1 NM6 NM44 IMC9 Le52 IMC17 IMC23 IMC12 Le73 IMC2 IMC5 IMC15 IMC1 Le66 JLP1048 SG46 IS65 IS60 IS13 ma19 JLP1050 ma36 IS30 IS22 EDT-10 EDT-1 ma34 AGN4 AGN7 FELG215 FELG244 SGT54 SG150 Ger12 SGT ED8 SGT51 SGT327 Le78 SGT53 SGT256 GER10 SG1 SGT129 SGT79 SG82 SGT280 Aco60 ACO5 SG64 SGT302 ACO33 ACO15 ACO41 SGT67 SG69 Le171 JLP1066 Aco29 ATCC43703 SGT286 JLP1068 JLP1054 JLP1070 JLP1069 JLP1064 ma31 Aco22 ATCC43290 ma18 ACO48 Faco3 Aco8 JLP1041 Aco 20 JLP1007 K0162 K0152 JLP1057 FRO6 ALF15 IS1 JLP1071 ma28 ma32 ma1 FRO5 JLP1049 JLP1052 JLP1067 K0126 K0147 ATCC33215 K0127 JLP1006 JLP1037 Faco1 Faco5 Lens ATCC43112 JLP1008 ma16 JLP1036 K0128 JLP1035 ACO12 Aco67 JLP1047 JLP1065 JLP1051 NM18 NM49 NM22 NM53 Le58 Le49 K0157 K0156 K0165 ATCC33216 K0166 K0158 ATCC33735 ATCC33736 ATCC33737 ATCC33156 JLP1017 JLP1014 ATCC35251 JLP dota-a dota-b dota-c dota-d dota-e dota-a dota-b dota-e dota-d dota-c Neighbor-joining method (MEGA4) Costa et al., 2010 Environ. Microbiol. Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental

44 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Philadelphia Paris Lansing A3105 Lansing 3 17 Alf18 Concord 3 4 Lansing 3 17 dota-a Chicago 8 Leiden 1 Lansing 3 Lansing Bloomington 2 Lansing 3 17 IN-23G1-C2 Lansing PA-H Lansing 3 17 AGN2 LE58 19 Lansing 3 17 Corby LE58 19 Bloomington PA-H 16 7 Alf18 LE58 19 Lens Influência da recombinação na evolução do gene dota dota-b IMC23 Felg244 IS30 Unknown Unknown Unknown Dallas 1E MN-H NM1 U7W Unknown Leiden 1 5 Unknown 15 Bloomington 2 Unknown Leiden MICU B Corby 13 Unknown 12 U8W Corby 13 Unknown 12 dota-c Lansing 3 Corby 13 Unknown 12 Los Angeles 1 Unknown 12 Dallas 1E Unknown 12 LE58 U8W 8 Unknown 12 Chicago Unknown 12 dota-d Togus CO-H LE58 14 LE58 14 Dallas 1E Dallas 1E Lens LE58 14 Dallas 1E 11 RDP3 (Recombination detection program) 713 AGN2 1 LE58 14 Dallas 1E 11 Costa et al., 2010 Environ. Microbiol.

45 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Substituição de aminoácidos dota-a dota-b dota-c dota-d Philadelphia 1 Paris 82A3105 Concord 3 Chicago 8 Leiden 1 Bloomington 2 IN-23-G1-C2 797-PA-H AGN2 Corby Alf18 IMC23 Felg244 IS MN-H NM1 U7W U8W MICU B Lansing 3 Los Angeles 1 Dallas 1E LE58 Chicago 2 Togus CO-H Lens 713 F 26 S 1041 HAPPLOT Costa et al., 2010 Environ. Microbiol.

46 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Estirpes de L. pneumophila isoladas de ambientes naturais (i.e. rios, lagos), possuem maior diversidade alélica e são distintas da maioria das linhagens contendo estirpes relacionadas com casos de doença. os alelos do gene dota de estirpes isoladas de ambientes artificiais e relacionadas com casos clínicos estão sob pressão selectiva purificadora, antevendo que essas estirpes pertencem a um sub-grupo de todos os clones que foi selecionado pela sua capacidade de sobreviver e proliferar em ambientes artificiais e infectar com sucessos humanos. Ambientes Natural Ambientes artificiais Estirpes clínicas A preservação da diversidade alélica do gene dota nas estirpes ambientais antevê adaptações a diversos nichos. Costa et al., 2010 Environ. Microbiol.

47 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência Bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme que constitui uma forma de protecção

48 Agradecimentos Milton da Costa Legionella busters António Veríssimo Filipa d Avó Filipa Passos Rui Figueiredo