Legionella pneumophila em ambientes aquáticos

Transcrição

1 Legionella pneumophila em ambientes aquáticos Joana Costa CEF U. Coimbra UBI 11 abril 2018 Workshop "Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água"

2 Legionella spp. Bactérias Gram-negativas Ubíquas em ambientes aquáticos não salinos Mais de 60 espécies (~ 70 serogroups) A espécie Legionella pneumophila é responsável por 95 % dos casos de doença reportados Os humanos são considerados hospedeiros acidentais (e becos sem saída) uma vez que a legionela se replica em macrófagos alveolares, mas sem capacidade de transmissão Manifestações clinicas: Legionelose ou Doença dos Legionários Febre de Pontiac

3 História da doença The Bellevue Stratford hotel, Philadelphia. American Legion Convention Julho de adoeceram 29 morreram en.wikipedia.org 39 adoeceram 5 morreram sintomas febre alta, calafrios e tosse dores musculares e dores de cabeça. Período de incubação de 2 a 10 dias - os casos foram dispersos pela Pensilvânia Falta de registro de presenças na convenção Falta de métodos conhecidos para cultura, sorologia, coloração de tecidos e toxicologia deram resultados negativos

4 História da doença Third, a susceptible animal was needed to demonstrate that L. pneumophila could produce disease, particularly a respiratory disease similar to Legionnaires disease in humans. The guinea pig was that animal. L. pneumophila was recovered from infected guinea pigs fulfilling Koch s fourth postulate. The Genesis of Germs (Gillen 2007) First, if the etiological agent were biological, then the agent had to be found to be regularly associated with the disease. Tissues from lung biopsies and sputum samples were examined for a recurring microorganism. A Gramnegative rod with a tendency to form long, looping filaments was consistently detected in specimens. Second, the newly discovered bacterium was isolated in pure culture in the laboratory. This necessitated investigating L. pneumophila s nutritional requirements and designing special growth media that would meet these narrow requirements for bacterial growth.

5 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984)

6 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais

7 Ambientes aquáticos naturais Rios Lagos Água de profundidade/ aquíferos Biofilmes Nascentes

8 Ambientes aquáticos naturais Fleirmans e colegas em 1981 analisaram centenas de amostras de inúmeros lagos e rios dos Estados Unidos, detetando legionela na maioria das amostras. Verificaram ainda um efeito sazonal na detecção de legionelas, aumentando a sua concentração nos meses de verão. Tison e colegas em 1983 realizaram um estudo nos lagos e rios do Monte de St. Helena e detetaram elevadas concentrações de legionelas nas águas termais aquecidas. Em 2017, Zhang e colegas detetaram legionelas em 25% das amostras emnascentes termais na China. Estudos realizados em Portugal Continental e nos Açores em 1991 por Veríssimo e colegas identificaram múltiplas espécies de legionelas em águas com temperaturas entre os 22ºC e os 67.5 C. A mesma equipa determinou que os biofilmes constituem o maior reservatório de Legionella spp. em zonas hidrotermais, desempenhando um papel fundamental na sua dispersão (Marrão et al., 1993). Apesar das legionelas serem facilmente recuperadas em águas superficiais, só em 2005 Costa e colegas conseguiram isolá-las de águas de profundidade. Em 2017, Peabody e colegas analisaram 3 bacias hidrográficas no Canadá tendo detetado uma elevadíssima diversidade de Legionella spp., correspondendo em alguns casos a 2% da população total bacteriana.

9 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais Ambientes intervenção humana

10 Ambientes aquáticos artificiais ou de intervenção humana Sistemas de distribuição Torres de arrefecimento Fontes Chuveiros Piscinas Solo jardinagem

11 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais Ambientes intervenção humana Factores de amplificação

12 Fatores que favorecem o aumento da sua concentração temperaturas entre 6ºC e 63ºC óptimo 37ºC valores de ph entre 5.5 e 8.1 oxigénio dissolvido entre 0.3 e 9.6 mg/ml presença de outros organismos zonas de reduzida circulação de água presença de sedimentos

13 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Concentração bacteriana como factor determinante para a ocorrência de doença Os ambientes naturais são raramente associados a casos de legionelose. As legionelas multiplicam-se muito lentamente a baixas temperaturas, o que resulta num equilíbrio natural entre a concentração das bactérias e dos seus hospedeiros. Concentração esta abaixo do limite mínimo necessário para causar infecção em humanos. A maioria dos casos de doença está associada a ambientes sujeitos a intervenção humana onde temperatura da água é superior, alterando a concentração quer das bactérias quer dos seus hospedeiros naturais. Assim, variações nos parâmetros abióticos da água podem alterar o equilíbrio entre as legionelas e protozoários, resultando numaumento rápido da concentração das bactérias, podendo causar doença. Ambientes naturais Ambientes intervenção humana 10 2 a 10 6 CFU/L <1% população > 10 6 CFU/L 50% população

14 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais v v Ambientes intervenção humana Fatores de amplificação v v aerossóis Disseminação

15 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais Ambientes intervenção humana Factores de amplificação Homens com idades >50 anos com doença pulmonar ou imunodeprimidos Exposição por uma população suscetível Disseminação

16 Cadeias de eventos para que ocorra doença (Fraser, 1984) Ambientes naturais Ambientes intervenção humana Factores de amplificação LEGIONELOSE Estirpe patogénica Exposição por uma população suscetível Disseminação

17 A infecção humana é um beco sem saída para a replicação de legionela uma vez que a transmissão de pessoa para pessoa nunca foi relatada. A evolução das características de virulência resultou em grande parte da necessidade do organismo de se replicar num nicho intracelular e também evitar a predação por protozoários ambientais. A capacidade inata das legionelas conseguirem replicar-se em diferentes protozoa equipou estas bactérias com a capacidade de se replicarem em macrófagos alveolares humanos.

18 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental A infecção humana é um beco sem saída para a replicação de legionela uma vez que a transmissão de pessoa para pessoa nunca foi relatada. A evolução das características de virulência resultou em grande parte da necessidade do organismo de se replicar num nicho intracelular e também evitar a predação por protozoários ambientais. A capacidade inata das legionelas conseguirem replicar-se em diferentes protozoa equipou estas bactérias com a capacidade de se replicarem em macrófagos alveolares humanos.

19 Legionela de organismo ambiental a agente patogénico acidental As legionelas não são bactérias de vida livre, multiplicam-se intracelularmente em vários tipos de protozoa sendo esta relação crucial para a ecologia do organismo. Os protozoários são ubíquos em ambientes naturais, como água doce e salgada, água salobra, solos húmidos e em areias secas. A presença de protozoários é um factor determinante para a sobrevivência e aumento de concentração de legionelas

20 Replicação de legionelas em células eucariotas: estratégia essencial de virulência Amoeba aprisionando L. pneumophila Ciliados expelem vesículas contendo legionelas Acanthamoeba spp. produz vesículas respiráveis contendo legionelas ciriscience.org Macrófago preenchido com ~100 Legionella Berk et al., 2008 Appl. Environ. Microbiol. Berk et al., 1998 Appl. Environ. Microbiol. C. elegans é um hospedeiro metazoário de legionelas Hilbi et al., 2010 Mol. Microbiol. Brassinga et al., 2010 Mol. Microbiol. A infecção em humanos é um desvio ao ciclo de vida natural em protozoa

21 Biofilmes A maior parte da actividade bacteriana na natureza ocorre, não com as células individualizadas, mas com as bactérias organizadas em comunidades sob a forma de um biofilme. Esses biofilmes são constituídos por uma comunidade estruturada de células aderentes a uma superfície inerte (abiótica) ou viva (biótica), embebidas numa matriz de exopolissacárido. A associação dos organismos em biofilmes constitui uma forma de protecção ao seu desenvolvimento, fomentando relações simbióticas e permitindo a sobrevivência em ambientes hostis. Em ecossistemas aquáticos, mais de 99,9% das bactérias crescem em biofilmes associadas a uma grande variedade de superfícies. Os biofilmes mais comuns na natureza são heterogéneos, compostos por duas ou mais espécies, podendo os produtos do metabolismo de uma espécie auxiliar o crescimento das outras e a adesão de uma dada espécie fornecer ligandos que promovem a ligação de outras. Inversamente, a competição pelos nutrientes e a acumulação de metabolitos tóxicos produzidos pelas espécies colonizadoras poderão limitar a diversidade de espécies num biofilme.

22 Biofilmes Protecção contra: Radiações UV Fagocitose Desidratação Predadores Antimicrobianos Os principais componentes estruturais de biofilmes são: Microrganismos Matriz de exopolímeros Componentes de origem não-biológica

23 Biofilmes A associação entre as legionelas, protozoa e biofilmes propicia uma forma de proteção capaz de potenciar a capacidade de sobrevivência destas bactérias a ambientes hostis. biocidas antibióticos stress térmico e osmótico. Esta proteção será a explicação mais plausível para o facto das legionelas conseguiram passar de ambientes naturais para ambientes de intervenção humana, e permanecerem viáveis, suportando os vários tratamentos a que a água é sujeita.

24 O género Legionella > 60 espécies de Legionella A maioria é capaz de infectar protozoários 24 espécies foram associadas a casos de doença Yang et al., 2008 IJSEM

25 Legionelose 90% dos casos de Legionelose L. pneumophila Yu et al., 2002; Harrison et al., 2009; Beauté et al., 2013, 2017

26 Prevalência de Legionella sp. doença vs ambiente Há um viés entre a prevalência de L. pneumophila como principal responsável por casos de doença e a sua distribuição ambiental Total nonpneumophila legionellae; 24,4% L. pneumophila sg 1; 29,1% L. pneumophila sg 2-14; 46,5% Distribuição ambiental L. pneumophila sg. 2-14; 6% Legionella bozemanae, L. micdadei, and L. longbeachae; 7% Other Legionella sp.; 3% L. pneumophila sg.1; 84% L. pneumophila sg.1 corresponde a 30% dos isolados ambientais e a 84% dos isolados clínicos Distribuição clínica Harrison et al., 2017; Kozak et al., 2009; David et al., 2016)

27 Diversidade de L. pneumophila doença vs ambiente Com base na diversidade genética estabeleceu-se que estirpes clinicas de L. pneumophila eram distintas das ambientais Ambientes naturais Ambientes de intervenção humana Clínicas Paradigma - apenas um subgrupo das estirpes ambientais teriam a capacidade para produzir doença Costa et al., 2005, 2010, 2012, 2014; Harrison et al., 2007, 2009; Coscolla and Candelas, 2012)

28 Virulência de L. pneumophila clinicas vs ambientais

29 Virulência de L. pneumophila clinicas vs ambientais Modelo animal com correlação com a virulência em humanos. Possui sistema imune inato, semelhante aos macrófagos humanos

30 Virulência de L. pneumophila clinicas vs ambientais A patogenicidade varia com a estirpe e concentração A partir de 10 5 CFU/ml todas as estirpes causam doença Não foi possível estabelecer qualquer ligação entre a virulência, a origem das estirpes e o sequence-type Novo Paradigma a infeção por legionela está relacionada com a capacidade de algumas estirpes sobreviverem e se replicarem em ambientes de intervenção humana, e não com a virulência Environmental Filtering and Competition

31 Legionela busters Milton S. da Costa António Veríssimo Sousa, PS., Silva, IN, Moreira, LM., Veríssimo, A., Costa, J. (2018). Differences in virulence between Legionella pneumophila isolates from human and nonhuman sources determined in Galleria mellonella infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 8, 97. Costa, J., Teixeira, P. G., D Avó, A. F., Júnior, C. S., and Veríssimo, A. (2014). Intragenic recombination has a critical role on the evolution of Legionella pneumophila virulence-related effector SidJ. PLoS One 9, e Costa, J., d Avó, A. F., da Costa, M. S., and Veríssimo, A. (2012). Molecular evolution of key genes for type II secretion in Legionella pneumophila. Environ. Microbiol. 14, Costa, J., Tiago, I., da Costa, M. S., and Veríssimo, A. (2010). Molecular evolution of Legionella pneumophila dota gene, the contribution of natural environmental strains. Environ. Microbiol. 12, Costa J, da Costa MS, Veríssimo A. (2010). Colonization of a therapeutic spa with Legionella spp: a public health issue. Res Microbiol. 161(1): Costa, J., Tiago, I., Da Costa, M. S., and Veríssimo, A. (2005). Presence and persistence of Legionella spp. in groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 71, Santos P, Pinhal I, Rainey FA, Empadinhas N, Costa J, Fields B, Benson R, Veríssimo A, Da Costa MS. (2003). Gamma-proteobacteria Aquicella lusitana gen. nov., sp. nov., and Aquicella siphonis sp. nov. infect protozoa and require activated charcoal for growth in laboratory media. Appl Environ Microbiol. 69(11): Diogo A, Veríssimo A, Nobre MF, da Costa MS. (1999). Usefulness of fatty acid composition for differentiation of Legionella species. J Clin Microbiol. 37(7): Veríssimo A, Morais PV, Diogo A, Gomes C, da Costa MS. (1996). Characterization of Legionella species by numerical analysis of whole-cell protein electrophoresis. Int J Syst Bacteriol. 46(1):41-9. Rocha G, Veríssimo A, Bowker R, Bornstein N, Da Costa MS. (1995). Relationship between Legionella spp. and antibody titres at a therapeutic thermal spa in Portugal. Epidemiol Infect. 115(1): Veríssimo A, Marrão G, da Silva FG, da Costa MS. (1991). Distribution of Legionella spp. in hydrothermal areas in continental Portugal and the island of São Miguel, Azores. Appl Environ Microbiol. 57(10): Veríssimo A, Vesey G, Rocha GM, Marrão G, Colbourne J, Dennis PJ, da Costa MS. (1990). A hot water supply as the source of Legionella pneumophila in incubators of a neonatology unit. J Hosp Infect. 15(3):