Análises laboratoriais de Legionella em sistemas de água-métodos disponíveis, vantagens e inconvenientes

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1 Análises laboratoriais de Legionella em sistemas de água-métodos disponíveis, vantagens e inconvenientes Workshop: Prevenção e Controlo de Legionella nos Sistemas de Água IPQ, Caparica, 21 de novembro de 2018 Cristina Pizarro cristina.pizarro@insa.min-saude.pt

2 AGENDA Amostragem Análise Laboratorial Método cultural PCR em Tempo Real Legiolert Legipid Algumas Considerações 2

3 Amostragem Escolha dos pontos com maior probabilidade de contaminação: Rede predial de água quente e fria (troços de rede pouco utilizados, juntas cegas, extremidade da rede e retorno da água quente, chuveiros, etc.) Depósitos de água Spas, jacuzzis e piscinas Humidificadores Sistemas de rega por aspersão 3

4 Amostragem Escolha dos pontos com maior probabilidade de contaminação (cont.): Torres de arrefecimento e condensadores evaporativos Fontes ornamentais Sistemas de água contra incêndio Equipamentos dos Estabelecimentos Termais Equipamentos de terapia respiratória Lavagem automática de carros 4

5 Colher logo após a abertura da torneira, sem desinfetar Colher 1 Litro (sempre que possível) para frasco esterilizado e com tiossulfato de sódio Evitar a produção de aerossóis Usar equipamento de proteção adequado (bata, luvas e máscara de proteção) Efetuar a medição da temperatura, do desinfetante residual e do ph Amostragem Transporte da amostra a 5 C ± 3 C ou à temperatura ambiente, protegida do calor e da luz solar direta FFP3 5

6 Amostragem Sempre que se efetue(m) no(s) laboratório(s) mais do que uma metodologia ex: PCR em tempo real, Método cultural, Legiolert, Legipid, Partir sempre de uma amostra composta. Colher o volume necessário para o mesmo frasco e homogeneizar. Dividir em alíquotas para processamento. 6

7 Amostragem Ensaio T (h) T ( C) Legionella spp. < 24 5 ± 3 ou temperatura ambiente >24 e <48 5 ± 3 ISO 19458:2006 7

8 Amostragem Amostras de água que sofreram tratamento por biocida só devem ser submetidas a este tipo de análise 72 horas após a realização do mesmo. 8

9 Implementação/Validação de métodos Norma ISO 13843:2017 Water Quality requirements for establishing performance characteristics of quantitative microbiological methods Validação total Estabelecimento das características de desempenho de um método novo ou modificado - Método Interno Verificação (validação secundária) - Quando o laboratório procede à implementação de um método normalizado ou método alternativo validado 9

10 Método Cultural Norma ISO 11731:2017 Water Quality - Enumeration of Legionella Sementeira direta da amostra Filtração com colocação da membrana diretamente no MC Filtração seguida de eluição Centrifugação 10

11 Método Cultural Sementeira direta em amostras suspeitas elevada concentração de Legionela (>10 4 ) e uma baixa concentração de microrganismos interferentes, e em Inquéritos Epidemiológicos Semear 0,1 ml a 0,5 ml da amostra 11

12 Método Cultural Filtração com colocação da membrana diretamente no meio de cultura Sem tratamento Tratamento da amostra Ácido BCYE/ BCYE+AB/GVPC Incubação 10 dias, a 36ºC ± 2 C Leitura Confirmação das colónias suspeitas BCYE Com Cisteína BCYE Sem Cisteína Enumeração de Legionella spp. 12

13 Filtração seguida de eluição Método Cultural Filtrar amostra Membrana 0,2 µm Eluição da membrana com 5 ml soluto Ringer ou a própria amostra Agitar no vortex Tratamento térmico e ácido Sementeira da amostra Incubação a 36 C ± 2 C em atmosfera húmida 13

14 Método Cultural Centrifugação Centrifugação da amostra Sementeira da amostra Incubação a 36 C ± 2 C em atmosfera húmida 14

15 Filtração seguida de eluição Centrifugação Método Cultural Sementeira da amostra Sem tratamento Tratamento da amostra Calor Ácido BCYE/ BCYE+AB/GVPC Incubação 10 dias, a 36ºC ± 2 C Leitura Confirmação das colónias suspeitas BCYE Com Cisteína BCYE Sem Cisteína Enumeração de Legionella spp. 15

16 Colónias características : Leitura das placas Colónias que crescem em meio específico (BCYE/ BCYE+AB/GVPC), nunca antes das 48 horas de incubação, podendo apresentar uma coloração branca, rosada a azulada ou esverdeada, com aspeto vidro moído. Sem tratamento Calor Ácido 16

17 Leitura das placas Leitura das placas após incubação, com o auxílio de uma lupa binocular com luz incidente num ângulo de 45º; 17

18 Método Cultural Identificação das colónias suspeitas de Legionella pneumophila Seroaglutinação com Kit comercial: o kit utilizado no laboratório inclui partículas de látex, sensibilizadas com anticorpos que aglutinam na presença de antigénios específicos da membrana celular da Legionella, formando agregados visíveis a olho nu; Permite distinguir entre: L. pneumophila (serogrupos 1, 2-15) e Legionella spp. não L. pneumophila. 18

19 Expressão dos resultados Não detetada (LD= 50 ou 100) Detetada Nº UFC/L (UFC Unidades Formadoras de Colónias) Legionella spp. Legionella pneumophila serogrupo 1 Legionella pneumophila serogrupo

20 Amostra proveniente de uma Torre de Arrefecimento Placa de GVPC - concentrado sem tratamento Placa de GVPC - concentrado com tratamento por calor Placa de GVPC - concentrado com tratamento por ácido 20

21 Amostra proveniente de uma Torre de Arrefecimento Placa de GVPC - direto sem tratamento Placa de GVPC - direto com tratamento por calor Placa de GVPC - direto com tratamento por ácido 21

22 Método Cultural Permite isolar as diferentes espécies e estirpes de Legionella; Possibilidade de descobrir o agente etiológico nos IE; Possibilidade de comparação de estirpes clínicas com estirpes ambientais; Apenas são recuperadas as bactérias viáveis e cultiváveis. Método complexo e exigente em tempo, meios de cultura, reagentes e experiência técnica. 22

23 PCR em Tempo Real Norma ISO/TS 12869:2012 Water Quality - Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qpcr) 23

24 PCR em Tempo Real Concentração da amostra através de filtração; Extração de DNA (kit comercial específico para matriz ambiental); Qualitativo: Detetada/Não Detetada; Quantitativo: Unidades de Genoma/L; 24

25 PCR em Tempo Real Apresentação de Resultados: Curvas de amplificação amostras positivas 25

26 PCR em Tempo Real Vantagens: Capacidade de resposta em poucas horas; Extremamente sensível; Deteta as bactérias viáveis não cultiváveis. 26

27 Desvantagens: Elevado custo; PCR em Tempo Real Necessidade de pessoal técnico qualificado para a correta interpretação dos resultados obtidos; Em amostras colhidas após desinfeção pode haver dificuldade na amplificação do DNA; Não existência de correlação entre UG (unidades genómicas) e UFC (Unidades formadoras de colónias) Grande entrave em Termos Legislativos. 27

28 Legiolert O teste é baseado na deteção de uma enzima da Legionella pneumophila que ao metabolizar o substrato presente no reagente do Legiolert produz um composto acastanhado. 28

29 Legiolert 29

30 Legiolert Fácil execução; Resultados em 7 dias; Só deteta Legionella pneumophila; Expressão de resultados em NMP / 100 ml. 30

31 Legipid Filtração Análise Resultado (Pre-filtro em caso de águas sujas) Filtração por membrana Frasco de eluição Captura (antigénio anticorpo) Marcação anticorpo secundário Deteção Resultado Visual Resultado por Colorímetro / Espectofotometro UFCeq 31

32 Legipid Resultados no mesmo dia; Deteta Legionella spp., mas não permite identificar a L. pneumophila; Expressão de resultados em UFCeq/L. 32

33 Algumas Considerações A colheita de amostras deve ser realizada por laboratórios que tenham a amostragem acreditada, por técnicos de saúde ambiental, engenheiros sanitaristas ou técnicos certificados para o efeito por entidade acreditada pelo IPAC. Análise deve ser realizada por laboratórios com o método acreditado pelo IPAC. A escolha do método a utilizar deve ter em conta o contexto da análise. 33

34 Equipa técnica do Laboratório de Microbiologia do Porto da UAS do DSA Sameiro Maciel Maria João Ribeiro Daniela Ferreira Aldora Pinheiro Carla Coelho Cristina Pizarro 34

35 Muito obrigada! 35