Acta Scientiae Veterinariae ISSN: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brasil

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1 Acta Scientiae Veterinariae ISSN: Universidade Federal do Rio Grande do Sul Brasil Stragliotto, Andréia; Inácio Vincenzi da Silva, Mayara; Gonçalves de Campos, Camila; Dias Gonçalves, Geovanny Bruno; Molina Pires, Marco Aurélio; Lopes de Souza, Roberto; Moleta Colodel, Edson; Argenta Pescador, Caroline Expressão do fator de crescimento endotelial vascular em tumores mamários de cadelas Acta Scientiae Veterinariae, vol. 41, núm. 1, enero-diciembre, 2013, pp. 1-6 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre, Brasil Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 Acta Scientiae Veterinariae, : RESEARCH ARTICLE Pub ISSN Expressão do fator de crescimento endotelial vascular em tumores mamários de cadelas Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Bitch s Mammary Tumors Andréia Stragliotto 1, Mayara Inácio Vincenzi da Silva 1, Camila Gonçalves de Campos 1, Geovanny Bruno Dias Gonçalves 1, Marco Aurélio Molina Pires 2, Roberto Lopes de Souza 1, Edson Moleta Colodel 1 & Caroline Argenta Pescador 1 ABSTRACT Background: Breast cancer is the most common cause of cancer-related death in canine female. Vascular endothelial growth factor is a major inducer of angiogenesis and has marked expression in mammary tumoral cells. The role of vascular endothelial growth factor that assumed to be most potent angiogenesis factor is ambiguous in breast cancer. Studies suggest that VEGF expression is higher in malignant than in benign tumors, and its correlation with invasion and growth of canine mammary tumors and unfavorable outcomes. The aim of this study was to determine and compare the immunohistochemical expression of VEGF in malignant and benign mammary tumors in bitches. Materials, Methods & Results: Fifty five malignant tumors were analyzed and sixteen benign tumors of dogs using a polyclonal antibody to determine the expression of VEGF by a semi-quantitative method (based on the sum of the ratio and intensity of color of the tumor cells) and a quantitative (performed by means of a computerized image capture and analysis). The marker VEGF positivity was determined by the presence of at least one tumor cell with brown cytoplasmic staining clear and unambiguous. The VEGF expression was compared between each histopathological group by Microsoft Office Excel 2007 and PHStat2 statistical software, version 2.0. We used the chi-squared test (χ 2 ), to detect differences in the expression score in methods between the variable histopathology type and Student s t-test for comparisons between the optical density means. The confidence interval was set at 95% and P values < 0.05 were considered significant. Strong immunostaining was found in 33 (58.9%) malignant tumors and in 11 (78.6%) benign and weak immunostaining in 23 (41.1%) malignant and three (21.4%) benign. The optical density of malignant mammary tumors was (± 30.9) and benign was 117 (± 31.9). Discussion: In all tumors examined VEGF immunostaining was present diffusely in the cytoplasm of tumor cells and the vascular endothelium, were also observed in the neoplasic cells located closed to necrotic centers, suggesting that VEGF expression is highest in significant tumor necrosis. Strong immunostaining was observed in most malignant tumors, similarly to what was found in other studies, in which malignant mammary tumors were highly positive for VEGF marking, linking them to unfavorable outcomes. However, high VEGF expression found in benign tumors is divergent, and may have been affected by methodological factors or physiological changes that allow the occurrence of angiogenesis during the development of benign neoplasias. Among the malignant tumors was not observed statistical difference between strong and weak immunostaining, as well as between the optical densities, demonstrating that the pathological types studied exhibited the same behavior, differently from what was found by another study in which the pathological types were heterogeneous. Statistical analysis failed to correlate the immunohistochemical expression of VEGF between malignant and benign tumors in bitches and among the different types in relation to malignant histopathological score and the optical density; therefore, it is not possible to establish a criterion of malignancy for these tumors according to immunohistochemical expression of VEGF. Keywords: dog, bitch, mammary tumour, VEGF, immunohistochemistry. Descritores: cão, cadela, tumor de mama, VEGF, imuno-histoquímica. Received: 14 April 2012 Accepted: 12 September 2012 Published: 3 January Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia (FAMEV), Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá, MT, Brazil. 2 Departamento de Cirurgia e Anestesiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Cuiabá (UNIC), Cuiabá, MT, Brazil. CORRESPONDENCE: C.A. Pescador [capescador@ufmt.br - Fone: +55 (65) ]. FAMEV - UFMT. Av. Fernando Corrêa da Costa n. 2367, Boa Esperança. CEP Cuiabá, MT, Brazil. 1

3 INTRODUÇÃO O Fator de Crescimento Endotelial Vascular (Vascular Endothelial Growth Factor - VEGF) é o principal indutor da angiogênese tumoral, processo complexo, dinâmico e essencial para o crescimento de tumores [3,7,17] que estimula a proliferação celular endotelial, migração e formação do tubo capilar, sendo um dos fatores mais estudados na oncologia humana [16]. O VEGF é um potente e seletivo fator mitogênico para o endotélio, produz uma rápida e completa resposta angiogênica e um aumento da permeabilidade capilar. Produzido e secretado por uma série de células normais, este fator tem expressão marcada em células tumorais, incluindo neoplasias de mama. Pertencente à família das glicoproteínas, sendo o VEGF-A o principal mediador da angiogênese tumoral e usualmente é referido como VEGF [1,9]. A expressão do VEGF tem sido mensurada em diversos tumores, e uma alta expressão tem sido correlacionada com prognósticos desfavoráveis [1,5,6,11,22]. Também tem sido estudado VEGF circulante [10] e em tecido mamário canino [12,13,18-20], sugerindo que o nível de expressão do VEGF é significativamente maior em tumores malignos do que em amostras de tumores benignos e em tecido mamário normal, o que indica que VEGF está envolvido na invasão e no crescimento de tumores mamários desta espécie. O objetivo deste trabalho foi determinar a expressão do VEGF em tumores mamários malignos e benignos de cadelas, através de técnica imuno-histoquímica, e comparar essa expressão em relação ao comportamento biológico de diferentes tipos tumorais em caninos. MATERIAIS E MÉTODOS Foram analisadas 70 amostras de exame histopatológico de tumores mamários de cadelas, de diferentes raças e idades, encaminhadas ao Laboratório de Patologia Veterinária (LPV-UFMT), incluindo 54 tumores malignos e 16 tumores benignos. Dentre os tumores malignos, 26 eram carcinomas simples de mama, 22 carcinomas complexos, 4 tumores mistos malignos e 1 carcinoma de células escamosas, carcinossarcoma, fibrossarcoma e osteossarcoma cada. Os tumores benignos foram representados por 7 adenomas simples, 4 adenomas complexos, 2 tumores mistos benignos e 1 fibroadenoma. A análise imuno-histoquímica foi realizada utilizando o anticorpo policlonal anti-vegf 1. Cortes de 4 µm foram desparafinados em xilol e reidratados em álcool. A peroxidase endógena foi bloqueada incubando as lâminas em solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 20 min e a recuperação antigênica foi realizada mediante o uso de forno microondas, colocando as lâminas submergidas em tampão citrato ph 6,0 atingindo 90 C, esfriando em temperatura ambiente. Em seguida, foram bloqueadas as reações inespecíficas incubando as lâminas em solução de leite desnatado 2 por 20 min, depois, as lâminas foram cobertas com o anticorpo primário na diluição 1:200, deixando em câmara úmida durante a noite, na geladeira. As lâminas foram lavadas com água destilada e foi adicionado o Kit LSAB 3 (biotina-streptavidina), por 20 min. A reação foi revelada com diaminobenzidina 4 por 10 min e contra-corada com hematoxilina por 30 a 60 s. A positividade para o marcador VEGF foi determinada pela presença de pelo menos uma célula tumoral com coloração citoplasmática marrom nítida e inequívoca, sendo a expressão de VEGF determinada por dois métodos, um semi-quantitativo e um quantitativo. O método semi-quantitativo foi baseado na soma da proporção e da intensidade da cor das células tumorais positivas sendo realizado por dois observadores em microscópio óptico. O número de células positivas de cada corte foi estipulado em escores, sendo: 1 = menos de 10% de células positivas; 2 = 11-50% de células positivas; e 3 = mais de 50% de células positivas, e a intensidade da marcação foi classificada como: 1 = fraca ou 2 = forte. Por fim, a somatória dos escores que resultou 2-3, foi considerada como imunomarcação fraca, e 4-5, imunomarcação forte [9,20,23]. O método quantitativo foi realizado por meio de um sistema computadorizado de captura e análise de imagens 5 com o qual se obteve a densidade óptica. A seleção do campo para a fotomicrografia foi baseada na visualização de células neoplásicas e na marcação imuno-histoquímica representativa do escore da imunomarcação anteriormente classificada. Os valores de cada lâmina de tecido analisada foram transportados para o programa Microsoft Excell 2007 e identificouse a média e desvio padrão da densidade óptica de cada corte. Foi realizada análise estatística descritiva do estudo imuno-histoquímico dos tumores mamários. 2

4 A expressão do VEGF foi comparada entre cada grupo histopatológico através do programa Microsoft Office Excel 2007 e do software estatístico6, versão 2.0. Utilizou-se o teste do qui-quadrado (χ 2 ), para verificar a diferença na expressão nos métodos do escore entre a variável, tipo histopatológico, e o teste T-Student para comparações entre as médias da densidade óptica. O intervalo de confiança foi fixado em 95% e os valores de P < 0,05 foram considerados significativos. RESULTADOS Imunomarcação do VEGF esteve presente difusamente no citoplasma e endotélio vascular de todos os tumores mamários avaliados. Imunomarcação forte foi encontrada em 33 (58,9%) tumores malignos (Figura 1) e em 11 (78,6%) tumores benignos (Figura 2), e imunomarcação fraca em 23 (41,1%) malignos e 3 (21,4%) benignos, não sendo significativamente diferentes com relação ao escore (P = 0,17). A média final da densidade óptica dos tumores mamários malignos ficou em 113,5 (± 30,9) e dos tumores benignos em 117 (± 31,9), não apresentando diferença estatisticamente significativa entre elas (P = 0,71) (Tabela I). A expressão quantitativa do VEGF, para os tipos histopatológicos malignos estudados apresentou expressão similar, não se notando diferença estatística na proporção da imunomarcação forte e fraca (P = 0,54). Figura 1. Canino, mama. Carcinoma Simples. (A) Células epiteliais neoplásicas apresentando núcleo oval basofílico e moderado citoplasma eosinofílico com padrão de distribuição sólido e escasso estroma [HE, x20]. (B) Imunomarcação forte em marrom no citoplasma de células epiteliais neoplásicas. Imuno-histoquímica, anti-vegf, biotinastreptavidina-peroxidase [x40]. Figura 2. Canino, mama, Tumor misto benigno. (A). Células epiteliais e mioepiteliais entremeadas por escasso tecido conjuntivo [HE, x20]. (B). Formação de cartilagem e área de ossificação [HE, x10]. (C). Imunomarcação forte em marrom de células endoteliais vasculares. Imuno-histoquímica, anti-vegf, biotina-streptavidina-peroxidase [x40]. (D) Imunomarcação fraca em marrom de células endoteliais vasculares e mioepiteliais próximas a cartilagem (*). Imuno-histoquímica, anti-vegf, biotina-streptavidina-peroxidase [x20]. 3

5 Tabela 1. Expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) através de imunomarcação e densidade óptica de tumores mamários malignos e benignos de cadelas. Tipos Histológicos N Imunomarcação a Densidade Óptica c Fraca Forte Média Desvio CV Malignos 56 23(41,1%) 33(58,9%) 113,5 30,9 27,2% Carcinoma Simples b 26 9(34,6%) 17(65,4%) 115,8 32,6 28,1% Carcinoma Complexo 22 11(50%) 11(50%) 112,2 28,8 25,6% Outros 8 3(37,5%) 5(62,5%) 109,9 35,0 31,8% Benignos 14 3(21,4%) 11(78,6%) 117,0 31,9 27,2% a X 2 entre malignos e benignos (P = 0,17); b X 2 entre tipos malignos (P = 0,54); c Teste t student entre malignos e benignos (P = 0,71). DISCUSSÃO Em todos os tumores avaliados a imunomarcação do VEGF esteve presente. A marcação foi observada difusamente no citoplasma das células neoplásicas e no endotélio vascular, sendo também observada nas células neoplásicas localizadas próximas a centros necróticos, sugerindo que a expressão do VEGF é mais alta em tumores com necrose significativa [13,20]. Imunomarcação forte foi observada na maior parte dos tumores malignos e dos benignos, não sendo significativamente diferentes com relação ao escore nem com relação à densidade óptica. Os resultados foram similares aos de outros autores [12,13,18,20,21], em que os tumores malignos apresentaram alta positividade para marcação do VEGF, estando relacionados a prognósticos desfavoráveis. A alta taxa de positividade na expressão do VEGF nos tumores benignos é divergente [18], no entanto, este resultado pode ter sido afetado por fatores metodológicos, incluindo variabilidade entre os observadores, seleção das áreas com neovascularização mais intensa, heterogeneidade da distribuição vascular nos tecidos neoplásicos - o que requer um grande número de campos a serem avaliados, ou ainda a heterogeneidade dos pacientes. Além disso, é possível que a malignidade do tumor esteja relacionada com a expressão fenotípica das células tumorais, mas isso não se traduz em aumento da neoangiogênese [20]. Qualquer mudança na homeostase tecidual, seja fisiológica ou patológica, pode perturbar este equilíbrio e resultar na expressão de fatores angiogênicos [8], a qual ocorre também durante o desenvolvimento de neoplasias benignas. De acordo com Misdorp [14,15], os carcinomas complexos apresentam melhor prognóstico, seguidos dos carcinomas simples, pelos tipos especiais (CCE) e carcinossarcomas. Dentre os tumores malignos não foi observado diferença estatística entre imunomarcação forte e fraca, assim como entre as densidades ópticas, demonstrando que a intensidade de marcação da expressão de VEGF não pode ser usada como critério prognóstico nesse trabalho, diferentemente dos resultados encontrados por outro estudo [2], em que os tipos histopatológicos foram heterogêneos. CONCLUSÃO A expressão do VEGF não foi diferente entre tumores mamários malignos e benignos de cadelas, no entanto, o exame imuno-histoquímico vem acrescentando muitas informações sobre a biologia tumoral do câncer de mama e seus resultados podem ser incorporados à prática clínica. Novas pesquisas com este reagente devem ser realizadas para que seus resultados possam contribuir para um diagnóstico mais efetivo nos animais afetados. NOTAS INFORMATIVAS 1 A-20, Santa Cruz Biotecnology, Inc., CA, USA. 2 Molico, Nestlé Brasil Ltda., São Paulo, SP, Brasil. 3 Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA. 4 DAB, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA. 5 Axiovision 4.8.1, Carl Zeiss, São Paulo, SP, Brasil. 6 Software PHStat2, Microsoft excel, Pearson education, Inc., NJ, USA. Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper. 4

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