Método multirresíduo de agrotóxicos organofosforados

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1 Método multirresíduo de agrotóxicos organofosforados O uso de agrotóxicos é uma das principais fontes de contaminação do sistema hidrológico. Devido aos riscos pelo consumo de água contaminada, realizou-se esta pesquisa com o objetivo de avaliar método multirresíduo de agrotóxicos organofosforados por CG/FPD e extração em fase sólida em disco (SPE - em disco C18).

2 Por Nakano V.E., Rocha S.B., Lemes V.R.R., Kimura I.A., Kussumi T.A., Oliveira M.C.C., Ribeiro R.A., Torre P.P., Faria A.L.R., Waldhelm K.C. e Nascimento S. O Brasil, país detentor de um grande potencial agrícola, está entre os maiores consumidores mundiais de agrotóxicos, com média anual duas vezes superior à do resto do mundo [1-2]. O uso de agrotóxicos é uma das principais fontes de contaminação do sistema hidrológico. Podem atingir as águas superficiais diretamente pela deriva das pulverizações aéreas, por meio das águas da chuva e da irrigação, através da erosão dos solos, pelo descarte e lavagem inadequados de tanques e embalagens ou as águas subterrâneas pela drenagem e percolação no solo [3-7]. Os organofosforados constituem uma classe importante de agrotóxicos e seu uso como inseticida é o mais empregado no Brasil tanto na agricultura como em campanhas de saúde pública [8]. São ésteres fosfóricos derivados do ácido fosfórico e inibidores da enzima acetilcolinesterase. Efeitos adversos à saúde em populações humanas e em espécies animais devido ao intenso uso de agrotóxicos na agricultura estão descritos na literatura, como: neurotoxicidade, imunotoxicidade, carcinogenicidade, desregulação endócrina e alterações no desenvolvimento [9-10]. Embora esses se degradem rapidamente em água, existe a possibilidade de permanecerem resíduos e subprodutos em níveis relativamente tóxicos para a saúde [11]. Apresentam possibilidade de contaminação aguda [3], pela proximidade do ponto de aplicação ou disposição. A presença de seus resíduos e produtos de transformação nos mananciais pode trazer dificuldades no tratamento da água em virtude da necessidade de tecnologias mais complexas do que as usadas para a potabilização [4, 12]. No Estado de São Paulo, a qualidade da água para consumo humano tem sido monitorada pelo Programa de Vigilância Estadual (PROÁGUA). Além da Portaria do Ministério da Saúde nº 2.914, de 12 de dezembro de 2012 [13] que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, os parâmetros de resíduos de agrotóxicos encontramse na resolução RDC nº 274 de 22 de setembro de 2005, regulamento técnico para águas envasadas e gelo [14], e na Resolução do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) nº 357/053, de 17 de março de 2005, que trata dos recursos hídricos por classe [15]. Neste estudo foi desenvolvido e avaliado método para determinação multirresíduo de agrotóxicos organofosforados em água por cromatografia a gás com detector fotométrico de chama e extração em fase sólida em disco (SPE em disco C18). MÉTODOS E MATERIAIS Foram utilizados padrões com alto teor de pureza de agrotóxicos, adquiridos de Dr. Ehrenstorfer GmbH (Alemanha) ou Riedel de Häen - Sigma Aldrich Co.Ltd (Reino Unido), com certificados de análise. Sistema de extração em fase sólida em disco, Spec Disk Agilent composto por manifold de seis posições com frascos de capacidade para 1L de amostra e tubos coletores. Disco de extração em fase sólida monolítico de resistência ácida, C18EC, 47mm de diâmetro, poros de 70Ǻ. Solventes orgânicos (grau resíduo) e reagentes usados: 2,2,4-trimetilpentano (isooctano) (Tedia, Estados Unidos), acetona (Merck, Alemanha), diclorometano (Mallinckrodt Chemicals, Estados Unidos), acetato de etila (Tedia, Estados Unidos), metanol (Sigma Aldrich, Canadá), ácido sulfúrico P.A. (Merck, Alemanha), sulfato de sódio anidro P.A. (Merck, Alemanha) e água ultrapura (sistema de purificação MilliQ). O método utilizado foi baseado no descrito pela Environmental Protection Agency (USEPA.) [16] com adaptações. Preparo de padrões/curvas analíticas Soluções padrão estoque (solução-mãe) foram preparadas na concentração 0,01% m/v em isooctano e estocadas em freezer a 4ºC, sob proteção da luz. A partir da solução mãe, foram preparadas soluções intermediárias em isooctano:tolueno (9:1) e, posteriormente, soluções de trabalho deu

3 concentrações conhecidas em acetato de etila (AcEt) em seis níveis (triplicatas) para construção das curvas analíticas e avaliação do método. Preparo da amostra Em 1L de volume de amostra, ajustou-se o ph <2 com ácido sulfúrico 9N. Adicionaram-se 2,5mL de metanol (MeOH) e 2,5mL de acetona com agitação. Para o estudo de recuperação, adicionou-se 1mL da solução de padrão preparada em acetona, após acidificação da amostra branco (água ultrapura). Condicionamento do disco Condicionou-se o disco de extração em fase sólida C18 no sistema de extração com 10mL dos solventes: diclorometano (MeCl2), AcEt e MeOH. Adicionouse 10mL de água ultrapura acidificada (ph <2 com ácido sulfúrico 9N), deixando uma camada de água na superfície do disco para não secar. Extração da amostra Após o condicionamento, transferiu-se a amostra ao sistema de extração sob fluxo de 70mL/min. Aplicou-se vácuo máximo por 20 minutos até a completa secagem do disco. Iniciou-se a extração, adicionando-se 3mL de MeOH, três vezes 5mL de AcEt e três vezes 5mL de MeCl2, recolhendo em tubo coletor. Os eluatos combinados foram filtrados em sulfato de sódio anidro, lavando-se o tubo coletor com MeCl2. Concentrou-se o extrato em fluxo brando de gás nitrogênio comum até o volume de 0,3mL e ressuspendeu-se o extrato para 1mL com AcEt para a injeção no cromatógrafo a gás. Identificação e quantificação Foram investigados e quantificados 21 agrotóxicos da classe química dos organofosforados, incluindo produtos de transformação (Tabela 1) por cromatografia a gás (HP6890) com detector fotométrico de chama (FPD) com filtro de fósforo e coluna capilar de sílica fundida (30m, 0.25mm i.d., 0.25μm de espessura de filme) com fase estacionária CPSil 19CB (14% phenylcianopropyl 86% dimethylsiloxane), nas seguintes condições cromatográficas: Temperaturas do injetor e detector: 220ºC e 250ºC, respectivamente; programação de temperatura do forno: 80 C (0 min); 10 C/min; 150 C (30 min); 3 C/min; 210 C (0 min); 10 C/min; 260 C (10 min). Nitrogênio ultrapuro e ultraseco foi usado como gás de arraste na pressão de 80 kpa, modo de injeção: splitless, volume de injeção: 2μL. Parâmetros para avaliação do método Após otimização das condições analíticas, foram estudados os seguintes parâmetros: faixa linear de trabalho, seletividade, exatidão, precisão, limite de detecção, limite de quantificação. Seletividade A seletividade foi avaliada em seis replicatas com água ultrapura. Previamente foram efetuados os testes de efeito da matriz, adicionando-se mistura dos padrões ao extrato das amostras branco. Exatidão e precisão O método desenvolvido foi avaliado, sob condições de repetitividade em seis replicatas nos níveis do limite de quantificação (LQ) e duas vezes o LQ. A exatidão foi avaliada pelos resultados dos estudos de recuperação e a precisão foi calculada pelo desvio padrão relativo (RSD) para cada nível estudado [18]. Limites de Detecção (LD)e de Quantificação (LQ) Os limites de detecção e quantificação foram estabelecidos como a média das amostras branco mais três e dez vezes o desvio padrão dos resultados obtidos das fortificações no nível de 1LQ, sob condições de repetitividade (N=6) [17]. Critérios para avaliação do método O critério para aceitabilidade dos resultados de recuperações, sob condições de repetitividade foi de % para exatidão. A precisão foi avaliada pelos respectivos desvios-padrão relativos (RSD) os quais deverão ser menores ou iguais a 30% [18]. Resultados e discussões A necessidade de metodologias para análise de resíduos de agrotóxicos em amostras ambientais em níveis de

4 traços tem levado pesquisadores a desenvolverem técnicas capazes de atender às necessidades em relação à sensibilidade e à seletividade. O método clássico de preparo de amostras normatizado pela ASTM é baseado na extração líquido-líquido [19] e requer grandes volumes de amostra e solventes, além de ser relativamente lento e gerar um grande volume de descarte. O presente estudo utilizou a Extração em Fase Sólida (SPE), que emprega menores volumes de amostras e solventes, reduz o tempo de análise e possibilita a remoção de partículas, bem como a automação. É uma técnica de extração e préconcentração baseada nos princípios de separação da cromatografia líquida de baixa pressão, onde a amostra é percolada tradicionalmente em um cartucho contendo o adsorvente e os analitos Tabela 1 Resultados dos estudos de recuperação do método (variação, média e desvio padrão relativo), faixa linear de trabalho, limites de detecção e de quantificação Agrotóxicos organofosforados Faixa linear de LD (µg/l) trabalho (ug/l) LQ (µg/l) Recuperações Nível: 1 LQ Média RSD são retidos e extraídos com solventes orgânicos adequados. O emprego do SPE em disco para a determinação simultânea de ingredientes ativos de agrotóxicos organofosforados em água possibilita resultados mais robustos, maior rapidez nas análises, maior área superficial, minimiza problemas de obstrução e apresenta leito mais homogêneo sem formação de caminhos preferenciais em relação ao SPE em cartucho [20]. O método apresentado foi considerado aceitável para análise de 21 ingredientes ativos, conforme Tabela 1. As amostras em branco não apresentaram interferentes nos limites de quantificação do método. Comparando-se os resultados da mistura de padrões preparados em solventes com os adicionados no branco não foi observada a interferência do efeito de matriz. Recuperações Nível: 2 LQ Média Azinfós etílico 0,06-0,6 0,03 0, , ,3 Azinfós metílico 0,12-1,2 0,02 0, , ,5 Carbofenotiona 0,03-0,3 0,02 0, ,5 67 4,4 Clorpirifós etílico 0,03-0,3 0,01 0, ,3 57 2,4 Diazinona 0,03-0,3 0,02 0, ,0 56 2,8 Etiona 0,03-0,3 0,02 0, ,7 70 4,7 Etoprofós 0,03-0,3 0,01 0, ,8 70 3,4 Fenamifós 0,06-0,6 0,06 0, , ,7 Fenitrotiona 0,03-0,3 0,01 0, ,1 77 3,9 Fentoato 0,03-0,3 0,01 0, ,5 76 3,4 Forato 0,03-0,3 0,02 0, ,8 50 3,9 Fosmete 0,06-0,6 0,02 0, ,4 99 6,3 Malaoxona 0,06-0,6 0,01 0, , ,0 Malationa 0,03-0,3 0,01 0, , ,2 Metidationa 0,03-0,3 0,01 0, ,0 86 4,3 Paraoxona metílica 0,08-0,3 0,02 0, ,3 75 7,8 Parationa metilica 0,03-0,3 0,01 0, ,6 80 4,5 Pirazofós 0,06-0,6 0,02 0, , ,4 Pirimifós metílico 0,03-0,3 0,01 0, ,6 73 3,4 Profenofós 0,03-0,3 0,02 0, ,3 95 6,0 Triazofós 0,06-0,6 0,03 0, , ,2 LD: Limite de Detecção; LQ: Limite de Quantificação, RSD: Desvio Padrão RSD Os limites de detecção e quantificação foram 0,01μg/L a 0,06μg/L e 0,1μg/L a 0,2μg/L, respectivamente. As recuperações sob condições de repetitividade (N=6) variaram de 53% a 103% para o nível de 1LQ e de 50% a 119% para o nível de 2LQ. O método apresentou boa precisão com desvios padrão relativos de 3,6% a 10,1% e 2,4% a 23,2% para 1LQ e 2LQ, respectivamente (Tabela 1). Estes resultados estão de acordo com o estabelecido pela AOAC [18], cujas recuperações devem estar entre 50 e 120% e desvios padrão relativos menores ou iguais a 30%, para níveis até 1ppb. As legislações brasileiras referentes à qualidade de águas normatizam um pequeno número de agrotóxicos u

5 organofosforados, como: parationa metílica, malationa e profenofós que foram incluídos neste estudo. Outros ingredientes ativos estudados que não constam nas legislações estão na Tabela 1. Os agrotóxicos organofosforados são utilizados na agricultura, horticultura e em campanhas de saúde pública contra insetos vetores de doenças. A presença de organofosforados em sua forma primária pode ser indicativo de contaminação recente e pode causar danos principalmente nas populações residentes próximas às áreas de aplicação dos mesmos. Ao atingir fontes de água potável, esses compostos sofrem degradação em água e podem gerar resíduos e subprodutos em níveis relativamente tóxicos à saúde [3]. A parationa metílica em águas decompõese rapidamente pela ação de bactérias e luz solar, formando a paraoxona metílica, produto mais tóxico [21]. Segundo a EPA, os níveis de parationa metílica na água potável que não causam efeitos nocivos para a saúde em longo prazo são de 0,002mg/L [22]. A malationa presente em água se converte em malaoxona durante o processo de cloração em estações de tratamento de água [23]. Em vista disso, destaca-se a importância da investigação da presença dos produtos de transformação de relevância toxicológica. Para controlar a exposição humana aos resíduos de agrotóxicos e assegurar a saúde pública, agências reguladoras de vários países, como Estados Unidos e membros da Comunidade Européia, têm criado programas de monitoramento incluindo os resíduos de agrotóxicos em águas destinadas ao consumo humano. O monitoramento permite avaliar a qualidade da água consumida pela população, bem como identificar os fatores de riscos associados ao consumo em níveis fora dos padrões de potabilidade estabelecidos, para a prevenção de agravos e a manutenção da saúde humana. O desenvolvimento de pesquisas nesta área é relevante; no Brasil há poucos estudos e não há monitoramento sistemático da avaliação da qualidade da água [3]. A determinação de resíduos de agrotóxicos da água consumida pela população possibilita a identificação de riscos associados ao consumo. Enfim, o método estudado mostrou ser adequado para análise multirresíduo de agrotóxicos organofosforados em águas e contribui para programas de monitoramento e pesquisas, escassos no país. Fornece subsídios aos órgãos envolvidos com a saúde e o meio ambiente para ações de prevenção à Saúde Pública e atualização da legislação à realidade do país.t Reconhecimentos Agradecemos à Antonia Lima de Silva pelo apoio técnico na realização das análises e à Agilent Technologies pelo fornecimento dos consumíveis. Referências [1] FARIA, A M. QUEIROZ, M. E. L. R.; NEVES, A., A. Extração por Ponto Nuvem: Técnica Alternativa para a Extração de Resíduos de Agrotóxicos, Pesticidas: r.ecotoxicol. e meio ambiente (2005), Curitiba, v. 15, jan./dez. [2] SCORZA JR, R. P.; RIGITANO, R. L. O.; LIMA, L. A.; GOUVÊA, A. V., Avaliação de dois simuladores para a predição da lixiviação de sulfona de aldicarbe em um latossolo vermelho-amarelo, Pesquisa Agropecuária Brasileira (2000) 35(2): [3] SANTOS NETO, A.J.; SIQUEIRA, M.E.P.B., Análise de praguicidas organofosforados em água por extração em fase sólida (SPE) utilizando discos C18 e cromatografia em fase gasosa: avaliação da contaminação do reservatório de Furnas (MG-Brasil), Quim. Nova (2005) 28 (5): [4] RISSATO S.R.; LIBÂNIO M.; GRAFFERIS G.P.; GERENUTTI M., Determinação de pesticidas organoclorados em água de manancial potável e solo da região de Bauru (SP), Quim. Nova (2004) 27(5): [5] GRIZA, F.T.; ORTIZ, K.S.; GEREMIAS, D.; THIESEN, F.V., Avaliação da contaminação por organofosforados em águas superficiais no município de Rondinha Rio Grande do Sul, Quim. Nova (2008) 31(7): [6] FILIZOLA, H.F.; FERRACINI, V.L.; SANS, L.M.A.; GOMES, M.A.F.; FERREIRA, C.J.A., Monitoramento e avaliação do risco de contaminação por pesticidas em água superficial e subterrânea na região de Guaíra, Pesq. Agrop. Bras. (2002) 37(5): [7] MARQUES, M.N; COTRIM, M.B; PIRES, M.A. F; FILHO, O.B., Avaliação do impacto da agricultura em áreas de proteção ambiental, pertencentes à bacia hidrográfica do rio Ribeira de Iguape, São Paulo, Química Nova (2007) 30(5): [8] BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução RE nº 165,

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