TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR Lívia Ferreira S. Verzola 2016
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TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR Mais do que um complexo conjunto de técnicas que geram conflitos intelectuais, sociais e religiosos, a manipulação genética cria condições para que nós possamos conhecer melhor não só o mundo e os seres que nele vivem. Antes disso, ela nos permite viver mais próximos à nossa vaidade e nos remete ao questionamento de nossas limitações. A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e Síntese Protéica. É um campo de estudo amplo, que abrange outras áreas da Biologia e da Química, em especial, Genética e Bioquímica. Muito do trabalho feito no âmbito da Biologia Molecular relaciona se com a obtenção, identificação e caracterização de genes. No estudo da Microbiologia, diversas técnicas de biologia molecular são utilizadas para o isolamento e caracterização de organismos patogênicos (ou de seus genes), como vírus e bactérias. Desde o início da década de 1970 foram desenvolvidas e/ou aperfeiçoadas diversas técnicas de detecção ou diferenciação de ácidos nucléicos. A maioria dessas técnicas é realizada em função da variação da temperatura e/ou do ph do meio onde os ácidos nucléicos se encontram. Considerando que a temperatura e o ph estão relacionados com a capacidade do DNA em desfazer e refazer as pontes de hidrogênio, deve se então ter em mente que a hibridização dos ácidos nucléicos é a base fundamental da maioria das técnicas moleculares como Western blot, Southern blot, Northen blot, ISH, FISH, PCR Convencional, PCR em Tempo Real, Seqüenciamento, etc. OBTENÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS EXTRAÇÃO 3
Princípio: A obtenção de DNA e ou RNA para qualquer finalidade é sem dúvida uma etapa fundamental em qualquer protocolo, pois a pureza e a integridade das moléculas de ácidos nucléicos certamente influenciarão nos resultados finais dos experimentos para as quais se destinam. Existem métodos clássicos, com pequenas variações, para a obtenção dos ácidos nucléicos a partir de amostras biológicas em geral, e são aplicáveis em qualquer laboratório que disponha dos equipamentos e reagentes necessários, como a técnica SALTING OUT. Outros métodos mais modernos são baseados no uso de KITS INDUSTRIALIZADOS preparados com variados tipos de soluções salinas de diferentes concentrações, tampões e colunas de troca iônica para a purificação de DNA ou RNA, são de modo geral mais práticos e rápidos, porém todos seguem as mesmas etapas básicas: Ruptura (físico e químico) das membranas celulares para liberação do material genético. Desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas. Separação do DNA dos demais componentes celulares. OBS.: Cada Kit de Extração Comercial possui seu próprio procedimento, mas com o mesmo princípio. Sempre verificar o procedimento do Kit que você está utilizando para não errar na técnica. PROTOCOLOS UTILIZADOS NO LABORATÓRIO DE PATOLOGIA MOLECULAR 4
EQUIPAMENTOS UTILIZADOS Centrifuga de tubos 1,5 2,0 ml Kit Comercial para extração. Banho Maria Vortex Timer EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE MATERIAL PARAFINADO: KIT DNA ISOLATION FROM FFPE SAMPLES MACHEREY NAGEL MN 1. Desparafinizar amostra: Adicionar 400ul de Paraffin Dissolver na amostra. 2. Incubar 3 minutos à 60 C (esta temperatura é de acordo com a temperatura de fusão da parafina). 3. Vortexar a amostra ainda quente imediatamente depois dos 3 minutos. 4. Lizar amostra: Adicionar 100ul do Buffer FL. 5. Vortexar vigorosamente e Centrifugar a 11.000 rpm por 1 minuto. Depois da centrifugação irá formar 2 fases no tubo da amostra. Retirar com a pipeta todo o sobrenadante, manter somente a fase do fundo no tubo. 6. Pipetar 10ul de Proteinase K diretamente no fundo do tubo e homogeneizar. 7. Incubar o tubo em temperatura ambiente por 3 horas ou overnight. 8. Depois da incubação vortexar o tubo e ligar o banho maria na temperatura 90 C. 9. Adicionar 100ul do Decrosslink Buffer D Link no tubo e vortexar. Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. 10. Adicionar 200ul de etanol (96 100%) no tubo e vortexar. Depois dar um Spin no tubo. 11. Pipetar todo o conteúdo do tubo na coluna com o tubo coletor e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar. 5
12. Adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar. 13. Novamente adicionar 400ul de Buffer B5 na coluna e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. Retirar todo o filtrado no tubo coletor e descartar. 14. Centrifugar somente a coluna com o tubo coletar por 1 minuto para retirar todo o etanol da amostra. 15. Eluir o DNA: Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um tubo tipo eppendorf. Adicionar 20ul do Buffer BE diretamente na coluna de sílica e Centrifugar a 11.000 rpm por 30 segundos. EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE MATERIAL PARAFINADO: KIT QiAamp FFPE TISSUE QIAGEN 1. Cortar a parafina com a amostra no tamanho de 5 10 um. Colocar em um eppendorf. 2. Adicionar 1 ml de xilol na amostra e vortexar por 10 seg. centrifugar na velocidade máxima por 2 min. 3. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de álcool (96 100%) e vortexar. Centrifugar na velocidade máxima por 2 min. 4. Remover o sobrenadante, abrir o tubo e deixar à temperatura ambiente ou à 37 C por 10 min para evaporar o álcool. 5. Ressuspender o pellet em 180ul de tampão ATL, adicionar 20ul de proteinase K e vortexar. 6. Incubar à 56 C por 1 hora e depois incubar à 90 C por mais 1 hora. 7. Dar um spin e adicionar 2ul de RNAse e incubar por 2 min. na temperatura ambiente. Adicionar 200ul do tampão AL, vortexar, adicionar 200ul de álcool (96 100%) vortexar. 8. Transferir tudo para a coluna. Centrifugar a 8.000 rpm por 1 min. 9. Desprezar a solução do tubo coletor e adicionar na coluna 500ul do AW1. 10. Centrifugar a 8.000 rpm por 1 min. desprezar e adicionar 500ul do AW2 e centrifugar. 11. Desprezar e centrifugar a coluna sem nada a 14.000 rpm por 3 min. para retirar totalmente o álcool. 12. Adicionar de 20 100ul do tampão ATE, eluição, deixar 1 min. na temperatura ambiente e centrifugar a 14.000 rpm por 1 min. 6
EXTRAÇÃO DE RNA A PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL SIGMA RTN70 1. Antes de iniciar o experimento preparar a solução de lise. Manipular tudo no gelo (amostras/lisado). Adicionar 2 mercaptoetanol ao volume de solução de lise que será utilizada no dia, usualmente 250 ou 500ul por preparação de RNA. Usar 10ul para cada 1ml de solução de lise. TECIDO 2. 40 mg de tecido adicionar 500ul sol. lise 25 mg de tecido adicionar 300ul sol. lise 100 mg de tecido adicionar 1250ul sol. lise Obs.: O lisado acima de 500ul deve ser divido em 2 colunas e processar separadamente. 3. Separar o tecido e colocar em um tubo próprio para homogenização. O volume do tampão de lise deve ser suficiente para a amostra. Não deixar o tecido congelado, descongelar antes da ruptura na solução de lise/2 ME e homogenizar sempre no gelo. 4. Pipetar o homogenato em uma coluna Gen Elute Filtration (azul inserido em um tubo de 2ml). Centrifugar a velocidade de 12.000 16.000 g por 2 min. (a centrifuga já tem que estar refrigerada a 4 C). descartar a coluna de filtração. 5. Adicionar ao filtrado 500ul de Etanol 70%. Vortexar 6. Pipetar 700ul da mistura lisado/etanol na coluna Gen Elute Binding Column. Se o volume for maior fazer em 2 etapas. Centrifugar na velocidade máxima por 15 seg. 7. Primeira lavagem: adicionar 500ul de Wash Solution 1 na coluna e centrifugar a velocidade máxima por 15 seg. 8. Segunda lavagem: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 500ul do wash solution 2 na coluna e centrifugar a velocidade máxima por 15 seg. 9. Terceira lavagem: pipetar 500ul do wash solution 2 na velocidade máxima por 2 min. 10. Dar um Spin para secar a coluna 7
11. Eluição do RNA: transferir a coluna para um novo tubo e pipetar 50ul da solução de eluição e centrifugar na velocidade máxima por 1 min. Se é esperado uma concentração maior que 50ug de RNA, repetir a eluição com 50ul extra da solução de eluição. 12. Manter no gele até estocar no 70 C EXTRAÇÃO DE RNA PARTIR DE TECIDO (MAT. BIOL.): KIT COMERCIAL RNeasy MICRO KIT) QIAGEN Procedimento: 1. Adicionar B Mercaptoetanol ao tampão RLT. Adicionar 10ul de B ME em 1ml de Buffer RLT. 2. Adicionar ETOH 4V no Buffer RPE 3. Adicionar 350ul Buffer RLT no tecido e homogeneizar por 30 seg. 4. Centrifugar a 14.000 rpm por 3 min. Transferir o sobrenadante para outro tubo, adicionar 350ul de etanol 70% e transferir para uma coluna. Centrifugar a 8.000 10.000 rpm por 15 seg. 5. Adicionar 350ul de buffer RW1 a 10.000 rpm por 15 seg. 6. Adicionar 10ul de DNAse I a 70ul Buffer RDD e adicionar sobre a coluna e incube em banho maria a 20 30 C por 15 min. 7. Adicionar 350ul RW1 a 10.000 rpm por 15 seg. 8. Troque o tubo que sustenta a coluninha e adicione 500ul de Buffer RPE a coluna e centrifugue a 10.000 rpm por 15 seg. 9. Adicione 500ul de etanol 80% e centrifugue a 10.000 rpm por 2 min. 10. Centrifugue a 10.000 rpm por 2 min. para retirar o excesso de etanol. 11. Colocar a coluninha em um outro tubo coletor e adicionar 14ul de RNAse Free Water, centrifugar a 10.000 rpm por 2 min. 8
EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE TOTAL: KIT COMERCIAL GEN ELUTE SIGMA 1. Coletar o sangue total em um tubo anticoagulante 2. Adicionar 500ul de sangue total a 1 ml de solução de lise (160 mm amonium chloride e 20 mm sodium bicarbonate ph 7.2 com HCl). Misturar gentilmente por 5 minutos a 700 g em uma microcentrífuga. 3. Descartar o sobrenadante. Gentilmente ressuspender o pellet em 1 ml de solução de lise cloreto de amonium (a mesma anteriormente), misturar gentilmente e dar um spin. 4. Descartar o sobrenadante manter o pellet no gelo. CÉLULAS BRANCAS PELLET 5. Ressuspender o pellet com 200ul de solução ressuspensão. Adicionar 20ul de proteinase K a amostra e vortexar. Adicionar 20ul RNAse e incubar por 2 min. em temperatura ambiente. LISE CELULAR 6. Adicionar 200 ul da solução de lise C na amostra vortexar. Uma mistura homogênea é essencial para uma lise eficiente. Incubar a 55 C por 10 min. PREPARO DA COLUNA 7. Adicionar 500ul da solução preparação da coluna para cada coluna e centrifugar 12.000 g por 1 min. descartar o líquido. 8. Adicionar 200ul ETOH ao lisado, misturar vortexando 5 10 seg. uma solução homogênea é essencial. 9. Carregar o lisado transferir o conteúdo do tubo para coluna tratada e centrifugar a 6.500 g por 1 min. descartar o tubo coletor contendo o fluido e colocar a coluna em um outro tubo. LAVAGENS 10. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 6.500 g por 1 min. Descartar o liquido que está no fundo do tubo coletor 11. Adicionar 500ul wash solution na coluna e centrifugar a 12.000 g por 3 min. Descartar o líquido que está no fundo do tubo coletor. Colocar a coluna em um outro tubo coletor. 12. Adicionar 200ul de solução de eluição e centrifugar a 6.500 g por 1 min. para eluir o DNA. 9
REAÇÃO EM CADEIA PELA AÇÃO DA POLIMERASE (PCR) Princípio: A reação em cadeia pela ação da polimerase, ou simplesmente PCR (do inglês polimerase chain reaction), desenvolvida por Kary B. Mullis, é o ensaio mais sensível para a detecção de DNA. A técnica de PCR é um método baseado na amplificação enzimática de um determinado segmento de DNA pela extensão de oligonucleotídios (primers ou seqüências iniciadoras) que hibridizam com as fitas complementares de uma seqüência molde também conhecida como seqüência alvo. Repetidos ciclos com sucessivas variações de temperatura permitem a desnaturação do DNA molde, hibridização e extensão dos primers pela ação da DNA polimerase. Ao decorrer de vários ciclos o segmento de DNA limitado pelos primers vai sendo amplificado, de modo que passa a existir um acúmulo exponencial dessa região. Então se partirmos de uma única molécula de DNA molde, após 30 ciclos de desnaturação, hibridização e extensão, será obtido cerca de 1,4 bilhão de cópias da região limitada pelos primers. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS Termociclador Vórtex Obs.: A quantidade a ser adicionada de cada reagente depende da concentração dos mesmos e da marca dos reagentes que estão sendo utilizados. Observar o protocolo que acompanha os reagentes para não errar a técnica. Procedimento: A PCR consiste em uma reação em que são misturados em um tubo: DNA: que se deseja amplificar Primers: que atuam como iniciadores e que limitarão a região a ser amplificada Bases nitrogenadas (dntps): serão incorporadas às novas cadeias de DNA Tampão: fornece o ph ótimo para a atividade da polimerase Taq Polimerase: atividade enzimática. 10
(Protocolo para 1 paciente) 1. Definir o volume final da reação de PCR (por ex: 25ul). 2. Adicionar em um tubo tipo eppendorf ou poço de uma placa de 0,2ul os reagentes fazendo um mix : 3. Adicionar primeiramente 9,0 ul de H 2 O ultrapura 4. Adicionar 12,0 ul Taq DNA Polimerase JumpStart (já com MgCl e dntps) 5. Adicionar 1,0 ul de Primer Foward 6. Adicionar 1,0 ul de Primer Reverse 7. Adicionar 2,0 ul do DNA a ser amplificado (paciente) 8. Depois que adicionou tudo, vortexar o tubo e colocá lo no termociclador no programa (ciclo) adequado. PCR em Tempo Real Princípio: Trata se de uma inovação que permite o acompanhamento do número de cópias feitas numa PCR. Neste sistema, além dos primers, você utiliza uma sonda interna ao segmento a ser amplificado também é hibridizado ao DNA molde. Essa sonda possui um marcador fluorescente que permanece protegido, sendo liberado quando a sonda é destruída pela ação da enzima polimerase. Assim quando ocorre a extensão dos primers, a polimerase passa pelo local onde a sonda está ligada, promovendo a sua desintegração. Esse evento pode ser acompanhado pela liberação da fluorescência, que é captada pelo equipamento e processada no computador. Esse é um teste que está sendo bastante utilizado para verificação de carga viral. RT PCR Princípio: Consiste em um método de amplificação de ácidos nucléicos a partir de moléculas de RNA convertidas em DNA complementar (cdnas). Neste sistema, o RNA, após ser isolado, é convertido em cdna devido à atividade da transcriptase reversa (RT). O cdna é então utilizado como molde da reação de PCR que fornece dados quantitativos e/ou qualitativos. 11
DILUIÇÃO DOS PRIMERS Observar como chegaram os primers, geralmente eles estão liofilizados e temos que reconstituí los. Ler o protocolo que acompanha os primers. PARA RECONSTITUIR OS PRIMERS: Primeiramente: Recomenda se que a diluição dos primers seja realizada em uma concentração > 10 um. Geralmente o mais utilizado é deixar os primers para estoque na concentração de 100 um. CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DOS PRIMERS: [ ] nmoles x 1.000 / 100 um = V. final Concentração do Primer (ler na bula do primer) Fator de Conversão Concentração Desejada OBS.: Geralmente no protocolo que acompanha os primers já vem o volume que você tem que adicionar de H2O ou TE. Se não tiver, fazer o cálculo ao lado. Procedimento: 1. Centrifugar o tubo por poucos segundos SPIN 2. Abrir com cuidado 3. Adicionar H 2 O Ultrapura ou TE deixar 2 minutos em temperatura ambiente reidratando 4. Vortexar 15 segundos 5. Aliquotar os primers e armazená los OBS.: Verificar muito bem a H 2 O ultrapura ou TE se estão estéreis (sem contaminação), fazer uma assepsia adequada na bancada, nas mãos (luvas) e de preferência diluir em uma Workstation ou Capela (UV) para que não haja contaminação. 12
ARMAZENAMENTO DOS PRIMERS 20 C = Material liofilizado (estabilidade > 1 ano) 20 C = Material reidratado/diluído (estabilidade > 6 meses) 4 C = Material reidratado/diluído (estabilidade até uma semana) ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS Eletroforese, do grego elektronphorese (conduzida pela eletricidade), refere se ao deslocamento de biomoléculas numa matriz sólida (agarose ou poliacrilamida) pela ação de um campo elétrico. A velocidade do deslocamento dessas moléculas é determinada pelos fatores: carga elétrica (positiva, negativa ou neutra), estrutura tridimensional e tamanho da molécula. Por ser uma técnica simples e relativamente rápida, a eletroforese é a metodologia mais utilizada para separação de biomoléculas. Princípio: A técnica apresenta basicamente um sistema de suporte (gel de agarose, por exemplo), uma cuba com eletrodos, um tampão no qual está imerso o gel e os eletrodos nas extremidades da cuba. Você adiciona a amostra em um dos poços do gel. A amostra deve estar corada ou o gel deve ter o corante como por exemplo o brometo de etídio. Sob influência de um campo elétrico, moléculas carregadas e partículas migram em direção ao pólo oposto. A carga e a massa das moléculas fazem com que elas migrem em velocidades diferentes e, portanto, propiciam a separação destas. Como os ácidos nucléicos (DNA e RNA) possuem carga elétrica negativa eles sempre migrarão em direção ao pólo positivo. Equipamentos Utilizados: Microodas Fonte e Cuba de Eletroforese Formas e Pentes para montagem do gel Balança Analítica 13
Procedimento: PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 1 Pesar 1,5 g de Agarose. 2 Colocar 100ml de TAE ou TBE 10x em uma proveta de 1000 ml e adicionar Água MiliQ ou Destilada até completar 1000 ml, para que eu tenho um tampão TAE ou TBE 1x. 3 Colocar a agarose em um erlenmeyer, adicionar 100mL do tampão TAE ou TBE 1x já diluído anteriormente, cobrir com um papel filme, fazer furos no papel filme, colocar no microondas por no máximo 1minuto ou até dissolver a agarose. O restante do tampão TAE ou TBE 1x que sobrou colocar na cuba de eletroforese. Se sobrar mais tampão, guardar em um frasco. 4 Depois colocar o gel já dissolvido no suporte com o pente para que ele endureça. PREPARAR A AMOSTRA PARA SER APLICADA NO GEL 5 Retirar o gel do suporte, colocar na cuba de eletroforese. 6 Para aplicar o DNA amplificado ou genômico, colocar em um papel 1 ul de Azul de Bromofenol 3 ul de água MilliQ ou Destilada 2 ul do DNA genômico ou amplificado (PCR) 7 Fazer Up and Down com a pipeta para misturar e pegar todo volume e aplicar no pocinho do gel que já está dentro da cuba de eletroforese com o tampão. 8 Ligar a fonte de eletroforese para que ocorra a corrida. 9 Depois da corrida, pegar o gel e colocá lo no aparelho foto documentador ligando a UV e ver o resultado. A quantidade dos reagentes e do DNA genômico ou amplificado vai depender do tamanho do poço do gel. 14
TÉCNICA HIGH RESOLUTION MELTING HRM Princípio: É um método poderoso em biologia molecular para a detecção de mutações e polimorfismos, foi descoberto e desenvolvido na Universidade de Utah, é uma técnica utilizada para identificar as variações nas seqüências de ácidos nucléicos que é baseado na detecção de pequenas diferenças na PCR de fusão (dissociação). Possui várias vantagens sobre os outros métodos como o: baixo custo em relação a outras tecnologias; baixo consumo de reagentes requerendo apenas o volume da reação de PCR (20ul) para análise de cada amostra. Equipamentos Utilizados: Equipamento de PCR em tempo real Centrífuga para placa Procedimento: Vamos utilizar um equipamento de PCR em Tempo Real ( Marca: Life Technologie (modelo: 7500 FAST ou StepOnePlus) e um reagente fluoróforo chamado MeltDoctor (Life Technologie). Para 1 amostra: 10uL MeltDoctor 1,2 ul Primer Fowarde a 5uM 1,2 ul Primer Reverse a 5uM 4uL do DNA estudado a 5ng/uL 3,6uL de Água MiliQ 1 Colocar todos os reagentes em um tubo tipo eppendorf, menos o DNA, formando um MIX. 2 Colocar 16 ul do MIX em cada poço de uma placa (de acordo com a quantidade de amostra que você possui) e por ultimo pipetar o DNA (amostra). 3 Dar um SPIN na placa. 4 Colocar a placa no aparelho e programar a corrida no software do computador. 15
TÉCNICA FISH (do inglês Fluorescence in situ hibridization) Princípio: Essa técnica é usada para estudar os cromossomos de células em metáfase, mas seu principal uso é nas células em interfase, quando anormalidades numéricas e algumas estruturais podem ser detectadas. Essa propriedade é de grande valor em estudos sobre câncer, já que um grande número de células pode ser verificado quanto a anormalidades clonais específicas que podem estar presentes somente em poucas células. A citogenética em interfase também possui enorme potencial para diagnóstico pré natal, sendo também um instrumento valioso para o mapeamento gênico. A técnica FISH envolve a preparação de sondas específicas de DNA, marcadas pela incorporação de nucleotídeos quimicamente modificados que são diretamente fluorescentes (método direto) ou podem ser detectados pela ligação a uma molécula fluorescente (método indireto), visualizados sob luz ultra violeta. Tais sondas de cadeias simples de DNA são hibridizadas com os cromossomos metafásicos como nas técnicas habituais de citogenética, mas também diretamente com os cromossomos de células interfásicas. Após a hibridização in situ, as lâminas formadas podem ser vizualizadas em microscópio de fluorescência, e as alterações cromossômicas, se presentes, identificadas. (ver etapas do processo adiante). Atualmente há sondas viáveis para todos os cromossomos, DNAs satélites e muitos locos específicos envolvidos em doenças, que podem ser obtidas em Kits pelos laboratórios de citogenética. Equipamentos Utilizados: Banho Maria Centrifuga Vortex Jarras de Coplin Estufa Termobrite e Timer 16
Procedimento: 1 Colocar as lâminas na estufa à 60 C overnight. 2 Desparafinização em Xilol 3 lavagens de 10 minutos cada 3 Passagem em álcool 3 banhos de 5 minutos cada 4 Passagem em água destilada 3 banhos de 2 minutos cada 5 Banho em solução 0,2N HCl por 20 minutos à temperatura ambiente 6 Pré tratamento com Citrato ph 6,0 à 80 C em banho maria por 1 hora 7 Digestão Enzimática com Pepsina (pronta para uso) por 8 minutos à temperatura ambiente ( este tempo é variável em decorrência do tipo e tamanho do tecido) 8 Lavagem em Solução de 2x SSC por 2 minutos cada 9 Desidratação em álcool: 75%, 80% e 100% por 2 minutos cada 10 Secagem das lâminas ao ar 11 Aplicação da sonda: Colocar 10ul da sonda e incubar no Hibridizador para Denaturação e Hibridização (tempo e temperatura é variável dependendo da indicação do fornecedor da sonda. Seguir a Bula da sonda). OBS.: Aplicar a sonda sempre ao abrigo da luz 12 Cobrir os cortes com lamínula e aplicar selante (Cola Fixogum) em volta e colocar as lâminas no Termobrite e deixar 20 horas à 37 C (lembrando para verificar na Bula da Sonda) 13 No outro dia tudo no escuro : Pré aquecer a solução de 1,5M Ureia/0,1x SSC em banho maria à 45 C 14 Mergulhar as lâminas em solução de Ureia/0,1x SSC 45 C por 30 minutos 15 Lavar em solução 2x SSC por 2 minutos à temperatura ambiente 16 Desidratação em álcool 75%, 80% e 100% por 2 minutos cada 17 Secagem das lâminas ao ar e no escuro. 18 Aplicar 15 ul de DAPI I ou 25 ul de DAPI II, colocar a lamínula e analisar a lâmina. 17