124 Influêni d sensiilidde individul de vrrões sore qulidde espermáti pós desongelção Influene of or individul sensiility on spermti qulity fter twing Rirdo Toniolli,* An Betriz Grç Durte,* Jorge Luiz Ferreir,* Fvino Rielli d Cost e Moreir* Resumo Diversos trlhos têm demonstrdo diferençs n qulidde espermáti do sêmen desongeldo entre diversos reprodutores suínos, demonstrndo vrições n resistêni individul dos espermtozóides destes nimis o proesso de ongelção. Este trlho teve por ojetivo testr o sêmen proveniente de diferentes reprodutores pr se identifir sensiiliddes individuis o proesso de ongelção. Qutro mhos form oletdos, em reipiente de 500 ml oerto por gze pr seprção d prte geltinos e protegido por envoltório térmio. Cd mostr ontinh 112 x10 6 sptz/ml pr s nálises in vitro. A téni de Pquignon foi utilizd pr ongelção do sêmen. Após desongelção, 37 o C durnte 30 segundos, o onteúdo de d plhet foi ressuspenso pós desongelção no diluente Beltsville Thwing Solution (BTS). Form vlids em mirosopi ópti o vigor e motilidde espermáti pós desongelção (M1), ressuspensão (M2) e 10 minutos (M3) e 2 hors de inução (M4) 37 o C. A morfologi do rossom foi nlisd em esfregço de sêmen feito em M3. Foi utilizdo o teste de Mnn Whitney trvés do Generl Liner Models do progrm Sttistil Anlysis System (SAS 6.03, 1988) 5% (p<0,05). Plvrs-hve: vrrões, sêmen, ongelção, espermtozoides, sensiilidde. Astrt Severl works hve een demonstrting differenes in spermti qulity of the thwed semen mong severl swine mles. Vritions re dignosed in the individul resistne of the spermtozoids of these nimls to the freezing proess. This work hd for ojetive to test the semen from the different ors to identify individul sensiilities to the freezing proess. Four mles were olleted, in reipient with 500 ml overed y filter for seprtion of the geltinous prt nd proteted y therml wrpper. Eh smple ontined 112 x10 6 sptz/ml for the in vitro nlyses. The Pquignon tehnique ws used for the semen freezing. After desongeltion t 37 o C during 30 seonds, the ontent of eh slt ws diluted in Beltsville Thwing Solution (BTS). They were nlysed in optil mirosopy, the vigour nd the spermti motility, fter desongeltion (M1), dilution (M2), 10 minutes (M3) nd 2 hours of inution (M4) t 37 o C. The rossome morphology ws nlyzed in M3. The Mnn Whitney s test ws used with the Linel Generl Models in Sttistil Anlysis System Progrm (HEALTHY 6.03, 1988) t 5% (p<0,05). Keywords: ors, semen, freezing, spermtozoids, sensiility. Introdução As diferentes ténis empregds n ongelção do sêmen do vrrão esrr ind em rreirs de ordem práti, presentndo prtiulrmente um grnde vriilidde nos resultdos de fertilidde de fêmes inseminds om doses de sêmen desongelds (Pursel e Johnson, 1971; Pquignon e Courot, 1975; Pquignon et l., 1977; Toniolli et l., 1997). Est vriilidde pode estr reliond om os diferentes métodos que vism um melhor reuperção do sêmen pós desongelção (Pquignon et l., 1974; Almlid et l., 1989; Holfo e Almlid, 1992; Eriksson e Rodriguez-Mrtinez, 2000). N espéie suín, lguns indivíduos presentm um melhor qulidde espermáti pós desongelção (Lrsson e Einrsson, 1976; Wtson, 1995; Cerolini, 2001; Oht et l., 2001). Prkinson e Whitfield (1987) reltrm que má qulidde espermáti individul pós desongelção pode ser melhord de ordo om o método de ongelção utilizdo. As vrições n resistêni dos espermtozoides de diferentes vrrões, os proessos de ongelção/ desongelção, permitem diferentes txs de fertilidde utilizndo-se um mesmo método (Lrsson e Einrsson, 1976; Pquignon et l., 1977; Almlid et l., 1989; Eriksson e Rodriguez- Mrtinez, 2000). Este trlho teve por ojetivo identifir vrição de resistêni nos ejuldos de diferentes vrrões utilizndo-se um mesmo método de ongelção. * Lortório de Reprodução Suín e Tenologi de Sêmen FAVET / Universidde Estdul do Cerá, Av. Prnjn, 1700 Cmpus do Itperi, Fortlez, CE. CEP: 60.740-000, e-mil: toniolli@rodnet.om.r R. rs. Ci. Vet., v. 16, n. 3, p. 124-128, set./dez. 2009
125 Mteril e métodos Animis e olet do sêmen Form utilizdos ejuldos de qutro nimis dultos, dois híridos omeriis (Dllnd) e dois puros (Duro e Lndre), sumetidos um mesmo mnejo e regime de dus olets semnis. Cd reprodutor foi oletdo 10 vezes pel téni d mão enluvd om mnequim. O sêmen foi oletdo em frsos plástios om pidde pr 500 ml, previmente queidos 37 o C e protegidos om opo térmio, sendo utilizdo o ejuldo totl pós seprção d frção geltinos trvés de filtrção em gze espeil. Após olet, o ejuldo foi nlisdo qunto à su onentrção espermáti (x10 6 sptz/ml), volume (ml), totl de espermtozoides (x10 9 ), vigor espermátio (esore de 0 5 Toniolli, 1996) e motilidde espermáti (perentul de éluls móveis). Todos os ejuldos utilizdos no experimento presentrm vlores im de 3,5 e 80% pr vigor e motilidde, respetivmente. Todos os nimis oletdos erm sumetidos periodimente exmes morfológios enontrndo-se dentro do pdrão exigido pelo Colégio Brsileiro de Reprodução Animl (1998). Congelção e desongelção do sêmen O sêmen foi ongeldo pelo método de Pquignon et l. (1974). De d ejuldo, foi retirdo um totl de 4 x10 9 sptz, olodo em tuos de fundo ônio (Corning de 50 ml) inudo em nho-mri 30 o C por 30 minutos. Em seguid, o sêmen in ntur foi entrifugdo 800g por 15 minutos pr retird do plsm seminl e dição do diluente de ongelção. O sêmen diluído foi ondiiondo em plhets de 0,5 ml, devidmente identifids e vedds om esfers plástis. Visndo desongelção, s plhets form olods em desongeldor utomátio 37 o C por 30 segundos. Momentos de nálise pós desongelção do sêmen O sêmen foi nlisdo em 4 momentos diferentes: 1) Logo pós desongelção, nlisndo-se um got do onteúdo d plhet entre lâmin e lmínul (M1); 2) O restnte do onteúdo d plhet foi diluído em 1,0 ml no Betsville Thwing Solution (BTS), 37 o C sendo vlid em seguid (M2); 3) A tereir nálise foi feit pós 10 minutos de inução do sêmen diluído no BTS (M3); 4) O qurto momento de nálise foi pós 120 minutos de inução no diluído no BTS (M4). Crterístis nlisds Vigor e motilidde espermáti: s rterístis de vigor (VIG) e motilidde (MOT) form vlids trvés de leiturs feits à luz d mirosopi ópti pós 10 minutos de inução do sêmen 37 o C, que se estendeu té 120 minutos pr plição do teste de termorresistêni (TTR) trvés d nálise do vigor espermátio, sutrindo-se o resultdo d primeir leitur pelo d segund, dividindo-se pelo primeiro resultdo e multiplindo-se por 100. Vlor finl expresso em perentgem. Ests dus rterístis (VIG e MOT) form vlids em todos os momentos (M1, M2, M3 e M4). Morfologi: Um mostr de sêmen (0,1 ml) foi retird pr nálise pens pós 10 minutos de inução 37 o C (M3), diluíd em prtes iguis em solução slin formolizd (0,9% de NCl e 0,4% de formol), pr vlição do perentul de éluls om rossomo intto. As nálises form relizds olondo-se 15µL d solução entre lâmin e lmínul, onde form ontds 200 éluls por lâmin em mirosópio óptio om ontrste de fse (1000x). Os espermtozoides form lssifidos em 5 diferentes tegoris, segundo Pursel et l., 1972). Com rossomo norml (NAR): ontornos nítidos, regulres, superfíie lis e de form rredondd; ) Com perd de rossomo (PAR): superfíie frmente visulizd, vesiuld, trnsprente, om o rossomo em degenerção; ) Com rossomo edemido (EAR): om um inhço n região rossômi; d) Com rossomo dnifido (DAR): superfíie rossômi em visível porém irregulr, om invginções ou evginções; e) Sem rossomo (SAR): rossomo não visulizdo e região equtoril em definid. Análise esttísti O delinemento experimentl utilizdo foi o de loos o so om nálise esttísti feit pel vlição ds médis e desvios-pdrões, om plição de testes de nálise de vriâni. O teste proposto foi o de Mnn Whitney pr omprção entre grupos. A nálise ds diferençs entre médis foi feit por vriâni multiftoril usndo-se o Generl Liner Models do progrm Sttistil Anlysis System (SAS 6.03, 1988), om um intervlo de onfinç de 5% (p<0,05). Resultdos e disussão Vigor e motilidde espermáti pós-desongelção Pr rterísti vigor espermátio, em todos os momentos de nálise, o niml 2 presentou vlor inferior (p<0,05) em relção os outros reprodutores (Figur 1). Os miores vlores de VIG form enontrdos no sêmen dos nimis 3 e 4 (p<0,05). Entretnto, pós o TTR (M4), o niml 4 presentou o mior vlor de VIG em relção todos os outros (Figur 1, p<0,05). Por outro ldo, o niml 1 foi melhor em tods s etps pós-desongelção pens em relção o niml 2. Os nimis 3 e 4 presentrm os mesmos vlores médios de VIG durnte o M1, (niml 3 e 4 = 3,3) e M2 (niml 3 e 4 = 2,6, fig. 1). Após dez minutos de inução diluído no BTS (M3), o niml 3 (3,3) e o 4 (3,4), não presentrm diferençs (p>0,05) entre si. Entretnto, no M4, o niml 4 presentou mior vlor de VIG (2,8) em relção os outros reprodutores (Figur 1, p<0,05). As diferençs individuis n sensiilidde dos espermtozoides de diferentes mhos podem estr relionds om o hoque osmótio que s éluls sofrem durnte formção de ristis de gelo, umento d pressão osmóti e lterção d permeilidde d memrn (Wtson, 2000), influenindo dest form n sorevivêni e pidde R. rs. Ci. Vet., v. 16, n. 3, p. 124-128, set./dez. 2009
126 vigor espermátio (0 5) 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1, 5 1, 0 0,5 0,0 M1 M2 M3 M4 de fertilizção dos espermtozoides (Holt, 2000). Portnto, os diferentes resultdos do vigor espermátio entre os reprodutores neste trlho podem ter sido devido à resistêni individul d memrn plsmáti do espermtozoide de d um dos vrrões estuddos. Os resultdos de VIG enontrdos nos ejuldos do niml 2, evidenirm um ix resistêni à ongelção. Sese que mgnitude n perd d qulidde do sêmen de vrrões pós riopreservção, pode estr diretmente reliond om ix qulidde iniil dos ejuldos in ntur (Cerolini et l., 2001). Portnto, s diferençs enontrds n ongelilidde individul entre os nimis deste trlho não podem estr relionds om s rterístis dos ejuldos in ntur, devido um trigem iniil do sêmen onforme desrito n metodologi, e sim ftores intrínseos reltivos às rterístis individuis dos espermtozoides de diferentes reprodutores. Pr rterísti motilidde espermáti, o reprodutor 2 presentou o menor vlor (61,1%; p<0,05) no M1 em relção os outros nimis e permneeu ssim durnte todos os outros momentos de vlição. Pr os reprodutores 1, 3 e 4, logo pós desongelção (M1), não houve diferençs entre si (niml 1 = 66,6%, niml 3 = 69% e niml 4 = 69,2%; Figur 2). Entretnto, em M2 e M3 os nimis 3 e 4 presentrm vlores de MOT miores do que os nimis 1 e 2 (p<0,05) não hvendo entretnto, diferenç signifitiv entre eles (niml 3 = 49,5% e niml 4 = 49, 2%, no M2, Figur 2). Animl 1 = Animl 2 = Animl 3 = Animl 4 = Animl 1 = Animl 2 = Animl 3 = Animl 4 = d Letrs diferentes indim diferençs entre os nimis, dentro de d momento (p<0,05). Figur 1: Vigor espermátio individul do ejuldo de diferentes vrrões, em qutro momentos de vlição (M1, M2, M3, M4) pós desongelção do sêmen. % de sptz móveis 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 Letrs diferentes indim diferençs entre os nimis, dentro de d momento (p<0,05). Figur 2: Motilidde espermáti individul do ejuldo de diferentes vrrões, em qutro momentos de vlição (M1, M2, M3, M4) pós desongelção do sêmen. d Crterístis omo frequêni de ejulção e o tempo de permnêni dos espermtozoides no epidídimo, estão reliondos om vriilidde n respost individul o proesso de riopreservção (Wtson, 1995). Um vez que todos os reprodutores testdos neste trlho form sumetidos um mesm frequêni de olet (dus vezes por semn), diferençs enontrds omo os resultdos otidos om o sêmen do niml 2, podem tmém estr relionds om rterístis individuis de sensiilidde espermáti e téni de ongelção utilizd. Est possível orrelção deve ser verifid posteriori. Todos os nimis presentrm diferençs individuis entre qulidde dos espermtozoides no M4, sendo que o niml 4 foi quele que melhor suportou o período de inução do sêmen pós-desongelção, presentndo mior número de éluls móveis em relção todos os outros (niml 1 = 31,9%, niml 2 = 19,7%, niml 3, = 41,5%, niml 4 = 54%; p<0,05). O niml 2 presentou o menor vlor de MOT (p<0,05), evidenindo um menor resistêni espermáti o proesso de ongelção em relção os outros reprodutores. Este resultdo pode estr reliondo om mudnçs nos lipídeos de memrn durnte o trânsito epididimário (Wtson, 1981), onde os espermtozoides dquirem resistêni o hoque térmio, fto este que pode influenir n diferenç individul dos ejuldos o proesso de riopreservção. Bixs onentrções espermátis no ondiionmento do ejuldo podem umentr sensiilidde ds éluls o hoque térmio. Os melhores resultdos de espermtozoides móveis pós desongelção são otidos om onentrções finis vrindo entre 400 e 800 x10 6 /ml (Pquignon e Courot, 1975). Entretnto, neste trlho form utilizdos 200 x10 6 sptz/ml sendo os resultdos de MOT enontrdos no niml 4 (54% em M4, figur 2), melhores do que os otidos por estes utores (20%). Mis um vez s diferençs pós-desongelção enontrds neste trlho não preem estr relionds pens om o proesso de riopreservção, em omo tmém ftores individuis, fto este enontrdo tmém onfirmdo por outros utores (Wtson, 1995; Cerolini et l., 2000). Os diferentes resultdos entre os vrrões, podem estr reliondos om resistêni individul dos ejuldos o estresse osmótio sofrido pelos espermtozoides durnte o proesso de ongelção, desongelção e pós diluição om BTS. Logo pós desongelção, s éluls espermátis sem de um diluente hiperosmótio (gem de ovo/gliose), pr um isosmótio (BTS) (Pquignon et l., 1986), onde o niml 2 presentou os menores vlores de VIG e MOT, podendo indir um produção de éluls om menor resistêni osmóti. Ciz de l Cuev et l. (1997) reltrm um efeito individul signifitivo n viilidde dos espermtozoides pós serem sumetidos um rus mudnç de um meio hiperosmótio pr um meio isosmótio indindo que o sêmen de diferentes indivíduos pode interferir n respost do espermtozoide suíno o estresse hiperosmótio, fto este onsttdo nos resultdos deste trlho. Após s dus hors de inução, o vrrão 2 presentou menores vlores de VIG e MOT, indindo um ix tx de sorevivêni dos espermtozoides deste niml em relção os outros. Lrsson e Einrsson (1976) reportrm diferen- R. rs. Ci. Vet., v. 16, n. 3, p. 124-128, set./dez. 2009
127 tes resultdos de motilidde espermáti entre vrrões, om um mior derésimo no perentul de éluls móveis pós inução estr reliondo om resultdos mis ixos de fertilidde. Outros utores verifirm que, espermtozoides om urt sorevivêni in vitro tmém possuem urt durção dentro do trto genitl de fêmes inseminds om sêmen desongeldo (Einrsson et l, 1973, Einrsson e Viring; 1973 Lrsson et l., 1976), dest form pode ser esperdo que o vrrão 4, por ter presentdo melhores resultdos de VIG e MOT pós desongelção pode presentr espermtozoides om mior resistêni o hoque térmio e provvelmente lnçr melhores resultdos de fertilidde do que o niml 2. Morfologi espermáti pós-desongelção Os resultdos de morfologi do rossom estão presentdos n tel 1. Houve um reuperção de 45 50% ds éluls om o rossom norml pós desongelção, em todos os nimis testdos. No entnto, o niml 2, o ontrário dos prâmetros de VIG e MOT, presentou mior porentgem de espermtozóides om NAR do que os nimis 3 e 4 ms não foi diferente do niml 1 (p>0,05). Os nimis 1 e 3 tmém não presentrm diferençs entre si nos vlores de NAR. Tel 1: Aspetos morfológios individuis do rossom do sêmen diferentes vrrões pós desongelção, ressuspensão e inução 37 o C durnte 10 minutos Defeitos do rossom (%) NAR PAR EAR SAR DAR (1) Lndre 50,7 39,1 7,2 2,5 0,5 (2) Duro 52,3 36,7 6,5 3,3 1,2 (3) Dllnd 69 44,9 42,0 9,4 4,3 0,5 (4) Dllnd 70 45,9 40,3 8,4 4,4 1,0 Os.: Letrs soresrits diferentes indim diferençs esttístis dentro ds oluns (p<0,05). Foi oservdo um efeito individul om relção os resultdos de morfologi do rossom, entretnto, os nimis 1 e 2 form os que presentrm mior número de NAR e menor número de PAR. No entnto, estes nimis presentrm menores vlores de VIG e MOT em relção os nimis 3 e 4. Ests oservções n morfologi espermáti podem indir que ftores inerentes os próprios indivíduos são mis deisivos pr os resultdos pós desongelção do que qulquer outro intrínseo à téni de riopreservção (Pquignon e Courot, 1975; Almlid et l., 1989; Eriksson e Rodriguez-Mrtinez, 2000). Apesr dos nimis 1 e 2 terem presentdo miores perentuis de éluls om rossom intto, téni utilizd pr verifição ds rterístis morfológis neste trlho, não permitiu distinguir viilidde espermáti. Logo, não se pode firmr pens om este prâmetro que estes nimis possuem mior resistêni o hoque térmio, pois s éluls nlisds que estvm om NAR poderim não estr viáveis no momento (M3) em que form retirds e fixds pr est nálise. Os resultdos de MOT e NAR enontrdos no vrrão 2 orroorm om os de Eriksson e Rodriguez-Mrtinez (2000), que oservrm mior número de éluls om memrn rossoml íntegr do que de éluls móveis. Tis resultdos indim neessidde d utilizção de diferentes prâmetros pr verifir resistêni dos espermtozoides pós-desongelção. No M3 o vrrão 2 presentou número signifitivmente mis ixo de éluls móveis (niml 2 = 42% e niml 4 = 70%; p<0,05) e mior número de éluls om rossom intto (52%). Logo, pode-se estimr que 42% de seus espermtozoides estvm móveis; entretnto, pens 52% ds éluls presentvm om rossom intto enqunto o niml 4 presentou 70% de sus éluls móveis (M3) om 45% ds sus éluls om NAR. Portnto, pode-se estimr que o niml 4 presentou melhor qulidde espermáti pós desongelção. O niml 2 presentou um perentgem menor de espermtozoides om PAR do que os nimis 3 e 4 (p<0,05). Entretnto, não foi diferente do niml 1. Não houve diferençs individuis entre os nimis 1, 3 e 4 no número de espermtozoides que presentrm perd de rossom (PAR). A rterísti PAR foi lterção morfológi mis oservd pós desongelção, onde 36 40% dos espermtozoides de todos os nimis presentrm o rossom em proesso de perd (PAR). Com relção o edem de rossom (EAR), os nimis 1 e 2 presentrm um número menor (p<0,05) de éluls om esse defeito (niml 1 = 7,2% e niml 2 = 6,5%) em relção os nimis 3 e 4 (niml 3 = 9,4% e niml 4 = 8,4%). Em todos os reprodutores foi oservd um pequen proporção de éluls sem rossom (SAR = 2,5 4,4%, Tel 1), não hvendo diferençs entre os nimis testdos (p>0,05). No que diz respeito o rossom dnifido (DAR), este foi o defeito que preeu om menor proporção nos espermtozoides de todos os nimis estuddos, om 1% ou menos, nos nimis 1, 3 e 4 e 1,2% no niml 2. Com relção est rterísti, tmém não form oservds diferençs entre os nimis em estudo (p>0,05). Conlusões O uso do sêmen suíno riopreservdo em progrms de inseminção rtifiil om otenção de ons resultdos de fertilidde, deve estr origtorimente reliondo om o ftor individul nos resultdos pós-desongelção. Dest form, identifição e seleção de nimis om ejuldos mis resistentes o proesso de ongelção é neessári. O efeito individul dos ejuldos n riopreservção do sêmen de suínos, fet qulidde dos espermtozoides pós desongelção, tornndo-se neessário um nálise prévi d ongelilidde dos ejuldos dos diferentes reprodutores serem seleiondos pr o proesso. R. rs. Ci. Vet., v. 16, n. 3, p. 124-128, set./dez. 2009
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