EFEITO DO LH NA QUALIDADE E COMPETÊNCIA DE OVÓCITOS OBTIDOS POR MEIO DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR IN VIVO EM ANIMAIS DA RAÇA GUZERÁ

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1 EFEITO DO LH NA QUALIDADE E COMPETÊNCIA DE OVÓCITOS OBTIDOS POR MEIO DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR IN VIVO EM ANIMAIS DA RAÇA GUZERÁ VANESSA GOMES UENO UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ ABRIL 2005

2 EFEITO DO LH NA QUALIDADE E COMPETÊNCIA DE OVÓCITOS OBTIDOS POR MEIO DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR IN VIVO EM ANIMAIS DA RAÇA GUZERÁ VANESSA GOMES UENO "Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal." Orientador : Prof. Reginaldo da Silva Fontes CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ ABRIL

3 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 016/2005 Ueno, Vanessa Gomes Efeito do LH na qualidade e competência de ovócitos obtidos por meio de aspiração folicular in vivo em animais da raça Guzerá / Vanessa Gomes Ueno f. : il. Orientador: Reginaldo da Silva Fontes Tese (Doutorado em Produção Animal) Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, Bibliografia: f Gado Guzerá 2. Aspiração folicular 3. Sincronização 4. Ovócito 5. Embrião animal I. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias. II. Título. CDD

4 EFEITO DO LH NA QUALIDADE E COMPETÊNCIA DE OVÓCITOS OBTIDOS POR MEIO DA ASPIRAÇÃO FOLICULAR IN VIVO EM ANIMAIS DA RAÇA GUZERÁ VANESSA GOMES UENO Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal. Aprovada em 01 de abril de Dra. Cláudia Lima Verde Leal (PhD. Reprodução Animal-USP/FZEA-SP) Prof. Francisco Aloízio Fonseca (PhD. Fisiologia Animal/UENF/CCTA-RJ) Prof. Aldo Shimoya (DSc. Genética e Melhoramento - UNIVERSO/Campos-RJ) Prof. Reginaldo da Silva Fontes (DSc. Reprodução Animal/UENF/CCTA-RJ) (Orientador)

5 Aos meus queridos pais, Takashi Ueno e Lourdes Gomes Garcia Ueno, pelo seu amor e apoio muito importantes em minha vida. Ao meu irmão André Luis, e à amiga, Maria Lucia Chagas Bello, por todo o afeto e companheirismo. Ao meu namorado, Denilson Burkert, pelo seu amor e companheirismo. DEDICO

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), pela oportunidade do aprendizado. À CAPES e FAPERJ, pelo apoio financeiro. À Schering-Plough Coopers, pelo apoio para realização deste trabalho. À Helcimar Palhano, pela amizade e apoio. Ao laboratório de Sanidade Animal, em especial, à profissional Luciana, pelo apoio para realização deste trabalho. Ao professor Reginaldo da Silva Fontes, pela orientação, apoio, aprendizado e amizade. Aos professores, Maria Clara, Cláudia, Angelo e Francisco Aloízio, pela orientação e amizade. Aos profissionais, Carla, Fausto, Mariane, Bruna, pelo apoio e amizade. Aos amigos, Reubes, Leonardo e Carlos Henrique, pela grande ajuda para realização deste trabalho. À aluna de graduação, Fernanda, pela ajuda e amizade. Aos vigias do setor de reprodução animal, pelo apoio durante o período do experimento. Ao amigo Aldo Shimoya, pelo apoio na estatística. Aos Pesquisadores da Embrapa-CNPGC Dra. Margot, Dr. Luis Otávio e Dr. Kepler, pela amizade e grande ajuda no meu aprendizado. Aos grandes amigos, Mariana, Kimie, Marcinha, Hebinho, Paulo, Débora e Roseane, pela amizade e companheirismo e que, hoje, fazem parte da minha família.

7 A toda minha família, pelo incentivo, carinho e apoio. Ao meu tio Gil e meus avós (in memorian), pelo seu amor e carinho. Às amigas, Andréia e Flavinha, pela amizade e carinho. À família Bello, pelo amor e carinho. Aos amigos da graduação e pós-graduação do LMGA/setor de reprodução animal, pelo apoio e amizade.

8 BIOGRAFIA Vanessa Gomes Ueno, filha de Takashi Ueno e Lourdes Gomes Garcia Ueno, nasceu em 23 de outubro de 1970, na cidade de Flórida Paulista - SP. Em janeiro de 1990, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade de Marília (UNIMAR), em Marília - SP, onde colou grau em janeiro de Foi admitida em março de 1999 no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Mestrado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), em Campos dos Goytacazes - RJ, submetendose à defesa da tese e conclusão do curso em abril de Foi admitida em março de 2001 no Curso de Pós-Graduação em Produção Animal, Doutorado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes - RJ, submetendo-se à defesa da tese e conclusão do curso em abril de 2005.

9 CONTEÚDO RESUMO... ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Dinâmica folicular em bovinos Divergência folicular Função do hormônio folículo estimulante (FSH) Função do hormônio luteinizante (LH) Sincronização da onda folicular e tratamento superovulatório... viii x Aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som e produção in vitro de embriões Maturação ovocitária Competência ovocitária e tamanho folicular MATERIAL E MÉTODOS DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

10 5. RESULTADOS DISCUSSÃO... 7.CONCLUSÕES... 8-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

11 RESUMO UENO, VANESSA GOMES; D. S.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; Abril de 2005; Efeito do LH na qualidade e competência de ovócitos obtidos por meio da aspiração folicular in vivo em animais da raça Guzerá. Prof. Orientador: Reginaldo da Silva Fontes; Comissão Examinadora: Francisco Aloizio Fonseca, Cláudia Lima Verde Leal, Aldo Shimoya. O presente experimento objetivou avaliar o efeito do hormônio luteinizante (Lutropin ) na qualidade e competência dos ovócitos obtidos através da aspiração folicular in vivo, utilizando diferentes tempos de maturação para aumentar a eficiência da produção in vitro de embriões animais da raça Guzerá. Foram utilizadas oito vacas com idade variando entre 36 e 48 meses, mantidas em regime de semiconfinamento. Inicialmente, todos os animais foram sincronizados por meio da inserção de um dispositivo liberador de progesterona (CIDR-B ), durante um período de nove dias, juntamente com aplicação de 2 mg de benzoato de estradiol (Estrogin ), em qualquer fase do ciclo estral, sendo o início do tratamento considerado o dia zero (D0). A dinâmica folicular foi acompanhada um dia antes da inserção do CIDR (D-1), quatro dias após (D4) e no dia da aspiração (D9), utilizandose o ultra-som (Scanner 240 Vet-Pie Medical) acoplado a um transdutor transretal linear de 5,0 e 7,5 MHz. Cinco dias após a inserção do dispositivo (D5), foi iniciado o tratamento superestimulatório com a dosagem total de 100 mg de hormônio folículo estimulante (FSH, Folltropin-V ) durante três dias consecutivos, com dosagens decrescentes e intervalos de 12 horas entre as aplicações, sendo realizada

12 aplicação intramuscular de 500 µg de cloprostenol sódico (Ciosin ), 48 h após o tratamento superestimulatório ser iniciado. Os animais foram divididos em dois grupos: no grupo I (controle, n=4), os animais receberam somente a aplicação intramuscular de FSH e, no GII (LH, n=4), foi realizada a administração de FSH associada à aplicação intramuscular de 25 mg de LH (Lutropin ) 6 horas antes da aspiração folicular (OPU). Em ambos os grupos, a OPU foi realizada 48 horas após a última aplicação de FSH, com intervalo de 15 dias entre as aspirações. De modo geral, os resultados demonstraram que quando o tratamento superestimulatório foi iniciado, não foi observada a presença de folículos grandes ( 10 mm) nos ovários, mas havia um grande número de folículos de 3-5 mm de diâmetro. Não foram encontradas diferenças significativas (P<0,05) entre os tratamentos na taxa de recuperação e no número de folículos observados por meio da ultra-sonografia. Entretanto, houve diferença significativa (P>0,05) entre os tratamentos quanto ao número e qualidade de ovócitos recuperados através da OPU no grupo LH (14 ± 2,56 e 7,0 ± 0,77) quando comparados aos do grupo-controle (7,5 ± 3,87 e 3,5 ± 1,73), respectivamente. Também não foi observada diferença significativa (P>0,05) na taxa de clivagem, na percentagem de blastocistos e no número de células embrionárias quando comparados ao tamanhos foliculares ( 6mm e > 6mm) dentro de cada tratamento (grupo-controle e LH) e entre os tratamentos relacionados aos tempos de 16 e 22 horas de maturação in vitro. Pôde ser observado que os ovócitos recuperados de folículos > 6 mm do grupo LH, com 16 horas de maturação in vitro, tiveram uma maior na taxa de blastocistos (57%) quando comparados às do grupocontrole (36%), embora não tenha sido encontrada diferença significativa entre os dois tratamentos. Com os resultados obtidos neste trabalho, pôde ser concluído que o protocolo utilizado associado à aplicação de LH pode proporcionar o aumento no número e na qualidade de ovócitos de grau I e II e que, devido à diferença individual encontrada na produção de ovócitos e embriões produzidos por sessão de OPU, torna-se necessário selecionar as doadoras em relação a estes parâmetros antes que elas sejam inseridas nos programas de aspiração folicular. Palavras chave: Guzerá, sincronização, ovócitos, embriões, aspiração folicular

13 ABSTRACT UENO, VANESSA GOMES; D. S.; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; April 2005; Effect of LH on the quality and competence of oocytes obtained by in vivo follicular aspiration in Guzerá breed animals. Supervisor: Reginaldo da Silva Fontes; Committee members: Francisco Aloizio Fonseca, Cláudia Lima Verde Leal, Aldo Shimoya. The present experiment aimed to evaluate the effect of luteinizing homone (Lutropin ) on the quality and competence of oocytes obtained by in vivo, follicular aspiration using different periods of maturation to increase the efficiency of in vitro embryo production of Guzerá cattle. Eight heifers with age varying between 36 and 48 months, maintained in a semi-confinement regime were used. At the beginning, all animals were synchronized by the insertion a progesterone-releasing device (CIDR- B ), during a period of nine days, together with 2 mg estradiol benzoate (Estrogin ) injection, at any phase of the estrus cycle, being the start of the treatment considered day zero (D0). The follicular dynamic was assessed one day before CIDR (D-1) insertion, four days after (D4) and at the day the aspiration, using an ultra-sound (Scanner 240 Vet-Pie Medical) attached to a transretal linear 5,0 e 7,5 MHz transducer. Five days after the device insertion (D5), the super stimulatory treatment was initiated with a total dosage of 100 mg follicle-stimulation hormone (FSH, Folltropin-V ) during three consecutive days, with decreasing dosages and intervals of 12hours between the applications, 48hours after the super stimulatory initiation of treatment an intramuscular injection of 500 µg of prostaglandine-f 2α (Ciosin ) was

14 given. The animals were divided in two groups: the group I (control, n=4), the animals received only FSH and, in group II (LH, n=4) the FSH administration was given together with an intramuscular application of 25 mg LH (Lutropin ) 6 hours before the follicular aspiration (OPU). In both groups the OPU was accomplished 48 hours after the last FSH application, an interval of 15 days between the aspirations. In a general, the results demonstrate that when the super stimulatory treatment was initiated, there no large follicles ( 10 mm) in the ovaries, but there was a high number of 4-6 mm of diameter follicles. Significative differences (P>0,05) on recovery ration and number of observed follicles by ultra sound were not found between the two treatments. However, there was significative difference (P>0,05) between the treatments how to number and quality oocytes recovered by OPU, (14 ± 2,56 e 7,0 ± 0,77) in LH group and (7,5 ± 3,87 e 3,5 ± 1,73) in control group, respectively. Also was not found significative differences (P>0,05) in cleavage ration, percentage of blastocysts and number of embryo cells in a comparison between the follicular sizes ( 6mm and > 6mm) inside the each treatment (control group and LH) and between the treatments in relation to in vitro maturation times of 16 and 22 hours. Could be observed that oocytes recovered from follicles > 6 mm in LH group, at 16 hours in vitro maturation, a higher blastocysts ration (57%) when compared to control group (36%), however have not been found significative difference between the two treatments. With the results obtained in this work, can be concluded that the protocol used associated to LH injection can provide the increasing in the number and in quality of oocytes degrees I and II and, such the individual difference found in this experiment the production in terms of oocytes and embryos produced by OPU section, is necessary to select the donators in relation to these parameters before they are included in the follicular aspiration programs. Keywords: Guzerá, synchronization, oocytes, embryos, follicular aspiration

15 INTRODUÇÃO Nos últimos anos, grande progresso tem sido alcançado no desenvolvimento de novas biotecnologias, o que tem permitido avanços em pesquisas relacionadas à área de reprodução. Diversas biotécnicas têm sido empregadas visando ao aumento da produção animal e a rápida disseminação de material genético superior. A Inseminação Artificial (I.A) em bovinos foi o primeiro passo, sendo que a primeira inseminação que se tem notícia data do ano de Esta técnica somente alcançou impulso a partir de 1970, objetivado o melhoramento zootécnico do rebanho por meio da utilização de sêmen de reprodutores com características comprovadamente superiores para a produção, tanto em termos de carne como de leite. A transferência de embriões (TE) em bovinos com fins comerciais teve início na década de 70 nos Estados Unidos, onde os embriões eram coletados através da laparotomia do flanco. Ainda nesta mesma década, foram desenvolvidas a coleta e a transferência por via transcervical. Este método não-cirúrgico tornou-se um marco na história da TE em bovinos, possibilitando a comercialização de embriões no Brasil na década de 80 (REICHENBACH et al., 1993). Neste mesmo período, surgiu a produção in vitro de embriões (PIV), que envolve desde a aspiração de ovócitos imaturos diretamente dos folículos ovarianos, associada à maturação, fecundação de ovócitos in vitro, bem como o cultivo de embriões in vitro. Após o nascimento do primeiro bezerro produzido por esta técnica por Bracket et al. (1982), foram obtidos grandes avanços tecnológicos e produtivos.

16 A aspiração de ovócitos imaturos diretamente dos folículos ovarianos, associada à maturação e fecundação in vitro dos ovócitos, e o cultivo in vitro de embriões permite que possa ser produzida, em média, uma gestação por semana (Peixer et al., 1996; Bousquet et al., 2000; citados por DODE e RUMPF, 2002). A aspiração folicular transvaginal guiada por ultra-som tem sido descrita em várias espécies como: caprinos (HAN et al., 1995), equinos (BRÜCK et al., 1997), bubalinos (BONI et al., 1996); e humanos (DUBEY et al., 1995). Esta técnica pode ser aplicada em qualquer fase do ciclo estral (VAN DER SCHANS et al., 1991), em fêmeas pré-púberes (ARMSTRONG et al., 1992), vacas em lactação (BUNGARTZ et al., 1995), durante o primeiro trimestre de gestação (MEINTJES et al., 1995; BUNGARTZ et al., 1995), vacas senis (DODE et al., 2002), em animais de alto valor genético com patologias reprodutivas adquiridas (LOONEY et al., 1994; BOLS et al., 1996) que não respondem adequadamente aos programas convencionais de superovulação (LOONEY et al., 1994). O uso desta técnica auxiliada pelo ultra-som permite uma cuidadosa aspiração dos folículos e a coleta de ovócitos imaturos sem prejudicar a habilidade reprodutiva das doadoras e sua saúde. Apesar de resultar num maior número de embriões produzidos in vitro por doadoras devido à sua alta repetibilidade, esta técnica ainda apresenta algumas variações nos seus resultados devido a diferenças individuais dos animais, fatores fisiológicos envolvidos (VAN DER SCHANS et al., 1991) e fatores limitantes na maturação in vitro dos ovócitos (BLONDIN et al., 2002). Dentre os processos da produção in vitro, a maturação representa um papel fundamental para que ocorra o subseqüente desenvolvimento embrionário in vitro e está altamente relacionada com as diferenças nas características foliculares, hormonais, competência ovocitária e o momento da ocorrência da onda préovulatória de LH no início da maturação (VAN DE LEEMPUT et al., 1999). Contudo, a compreensão da fisiologia reprodutiva e dos mecanismos envolvidos na maturação in vivo e in vitro, que possibilitam a obtenção de embriões de melhor qualidade, torna-se necessária para explicar as variações na produção in vitro. O melhor conhecimento das biotécnicas da reprodução é de fundamental importância para o aumento da eficiência das tecnologias de reprodução empregadas e para o desenvolvimento de protocolos que permitem tornar esta técnica cada vez mais promissora para uso no campo.

17 No presente estudo foi levantada à hipótese de que o intervalo de 48 horas entre a última aplicação de FSH e a aspiração folicular, associados à administração de LH exógeno poderia proporcionar uma pré-maturação ou capacitação dos ovócitos, possibiltando o aumento no tempo entre a maturação e a aspiração, permitindo, assim a ocorrência de mudanças necessárias à aquisição da competência ovocitária e ao posterior desenvolvimento de embriões em animais da raça Guzerá. Portanto, este trabalho teve como objetivos: avaliar a eficiência do protocolo hormonal na sincronização da onda folicular antes de iniciar o tratamento com FSH e avaliar o efeito do LH, no número e qualidade dos ovócitos recuperados por meio da OPU, na maturação nuclear dos ovócitos e na competência dos ovócitos recuperados de folículos 6 mm e > 6 mm, utlizando diferentes tempos de maturação in vitro e desenvolvimento embrionário.

18 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Dinâmica folicular em bovinos Embora não se conheçam precisamente os mecanismos que controlam a foliculogênese bovina, sabe-se que existe um padrão contínuo de crescimento e atresia dos folículos ovarianos durante o ciclo estral. Este processo contínuo de crescimento e regressão dos folículos, que leva ao desenvolvimento do folículo préovulatório, é conhecido como dinâmica folicular (LUCY et al., 1992). Os processos de recrutamento, seleção e dominância foram definidos por Hodgen (1982), primeiramente, em primatas, sendo as mesmas definições utilizadas no processo de dominância e dinâmica folicular durante o ciclo estral em bovinos (SIROIS e FORTUNE, 1988; GINTHER et al., 1989a). O desenvolvimento folicular durante o ciclo estral em fêmeas bovinas pode ser dividido em três fases: Recrutamento - é o processo pelo qual um grupo de folículos inicia o seu crescimento sincrônico sob influência de estimulação por gonadotrofina; Seleção - é o processo pelo qual apenas um dentre os folículos recrutados é selecionado, não sofre atresia e potencialmente pode chegar a ovular. Dominância - quando o folículo selecionado cresce mais rapidamente que os demais, suprimindo o crescimento destes e inibindo o recrutamento de um novo grupo de folículos. O período de divergência é caracterizado pelo crescimento contínuo do maior folículo a se tornar o folículo dominante e a redução ou parada do crescimento dos demais folículos que se tornarão os folículos subordinados. O diâmetro observado do maior folículo no início

19 da divergência foi de 8,5 mm (Holandês) e de 6 mm (Nelore), ambos com início da divergência 2,8 dias após a emergência dos folículos de 4 mm (GINTHER, 2000; SARTORELLI et al., 2003). Contudo, o folículo dominante cresce por cerca de seis dias e, ao atingir seu diâmetro máximo, persiste estático por alguns dias quando, então, inicia sua regressão. O folículo ovulatório do ciclo estral corresponde ao folículo dominante da última onda. A onda folicular tem sido definida como a sincronia do desenvolvimento de vários folículos de 4-5 mm de diâmetro, seguido pela seleção e crescimento do folículo dominante e supressão dos subordinados (GINTHER et al., 1989b). A maioria dos bovinos apresenta durante o ciclo estral duas a três ondas foliculares. A emergência da onda foi detectada em animais com duas ondas, no dia zero da ovulação (D0) e no décimo dia pós-ovulação (D10). Já em animais com três ondas, a emergência ocorreu no D0, D9 e no D16, (GINTHER et al., 1989a). Entretanto, existe uma grande variação não só na proporção de animais que exibem duas a três ondas por ciclo, mas também no dia da emergência da onda folicular. Sucessivas ondas foliculares permanecerão anovulatórias até que a luteólise ocorra (BERGFELT et al., 1991). O folículo ovulatório e a emergência da próxima onda são mantidas até o dia da ovulação subseqüente. O corpo lúteo começa a regredir mais cedo nos ciclos de duas ondas (D 16) que nos ciclos de três ondas (D 19), resultando num ciclo estral mais curto (20 dias vs 23 dias, respectivamente). Portanto, a duração do ciclo estral pode fornecer uma idéia do número de ondas foliculares que uma determinada vaca tem dentro de cada ciclo. A proporção de animais apresentando ciclos estrais com duas ou três ondas foliculares varia entre os diversos trabalhos, sendo que alguns relatam a maioria dos ciclos com duas ondas (> 80%, GINTHER et al., 1989b; RAJAMAHENDRAN & TAYLOR, 1990) outros relatam uma maioria de ciclos com três ondas (> 80%, SIROIS e FORTUNE, 1988), enquanto outros ainda observaram uma distribuição mais equilibrada em relação ao número de ondas (SAVIO et al., 1993a; SAVIO et al., 1993b; EVANS et al., 1994). Em animais zebuínos (Bos indicus), Mattos et al. (2000), trabalhando com novilhas da raça Guzerá, encontraram uma predominância de animais com três ondas foliculares. Esses autores relataram que, dos animais avaliados, 55,6%, 33,4% e 11% apresentaram três, duas e quatro ondas, respectivamente. Entretanto, Barros et al. (1993), mostraram a predominância de 90% de ciclos com duas ondas de crescimento em vacas Nelore, enquanto, em

20 novilhas, a ocorrência de três ondas foi mais frequente, 67% (FIGUEIREDO et al., 1994). Embora o assunto não tenha sido sistematicamente estudado, parece não estar clara uma preferência específica para idade ou raça, quanto ao predomínio de um padrão de onda folicular sobre outro, ou se existe alguma diferença aparente na fertilidade. Apesar disso, o efeito da nutrição na dinâmica folicular foi observada quando os animais foram tratados com diferentes níveis nutricionais. Vacas alimentadas com ração de baixa energia mostraram maior proporção de ciclos com três ondas do que as alimentadas com ração alta em energia (MURPHY et al.,1991). Em relação ao tamanho dos folículos ovarianos, Figueiredo et al., (1994 e 1995) encontraram, para vacas Nelore, o diâmetro máximo do primeiro folículo dominante de 10,78 ± 0,64 mm e, do segundo, 11,78 ± 0,57 mm. Estes resultados mostram que o diâmetro do folículo dominante foi menor nas vacas da raça Nelore, quando comparado ao das novilhas de raças européias, nas quais em que o tamanho relatado na literatura é entre 15 e 20 mm (SAVIO et al., 1988; KNOPF et al., 1989; GINTHER et al., 1996). Da mesma forma, os folículos observados em novilhas da raça Guzerá tiveram média do tamanho de 11,4 mm (MATTOS et al., 2000), também inferior ao observado para novilhas Bos taurus. O diâmetro máximo do corpo lúteo encontrado em fêmeas zebuínas foi de 16,31 ± 0,51 mm para vacas Nelore (FIGUEIREDO et al., 1994 e 1995) e de 16,2 mm de diâmetro para novilhas da raça Guzerá (MATTOS et al. 2000). A melhor compreensão das funções ovarianas tem proporcionado maior capacidade de controlá-las. Portanto, o crescente conhecimento sobre os papéis do corpo-lúteo (CL) e das ondas foliculares no ciclo estral bovino tem resultado em novas perspectivas para controlar a indução da ovulação e uma sincronização mais precisa da onda folicular Divergência folicular O momento da divergência é definido como a diferença no crescimento dos folículos ou entre os dois maiores folículos.

21 A divergência dos folículos é um dos eventos mais importantes do processo de seleção ou, em outras palavras divergência e seleção podem ser considerados sinônimos (GINTHER et al., 1996). O mecanismo da divergência é caracterizado por mudanças hormonais como do FSH, LH, inibina, ativina, hormônios de crescimento e entre outros que ocorrem durante o crescimento do futuro folículo dominante e do subordinado Função do hormônio folículo estimulante (FSH) Os folículos ovarianos variam em número, taxa de crescimento, tamanho e em relação a fase do ciclo. Durante a dinâmica folicular normal, o ciclo estral se caracteriza por crescimento e regressão de um ou dois folículos dominantes, seguidos de ovulação do próximo folículo dominante (SIROIS e FORTUNE, 1988). O mecanismo envolvido é baseado na responsividade diferenciada do ovário ao hormônio folículo estimulante (FSH) e ao hormônio luteinizante (LH) (GINTHER et al., 1996). A emergência de cada onda folicular está temporariamente associada ao aumento na liberação de FSH, portanto, vacas com duas ondas possuem dois picos de FSH e vacas com três ondas possuem três picos (ADAMS et al., 1992). A onda de FSH encontra seu platô quando os folículos atingem o diâmetro de 4-5 mm em bovinos (BODENSTEINER et al., 1996; KULICK et al., 1999). Depois, as concentrações declinam, o que coincide com o final da seleção e aquisição da dominância. Em bovinos, folículos de 3 mm não suprimem o FSH, mas adquirem esta capacidade durante seu crescimento de até 5 mm (GIBBONS et al., 1999). No momento da divergência da taxa de crescimento dos folículos subordinados e do dominante (momento da seleção), dois ou três dias depois da emergência da onda, o FSH sofre rápido declínio (MAPLETOFT et al., 2000), com subseqüente aumento da concentração de estradiol no fluido folicular do folículo dominante e no sistema circulatório (KANEKO et al., 1991; MIHM et al., 1997; EVANS et al., 1997). Nesse momento de divergência folicular, no qual o folículo dominante segue seu crescimento e o segundo maior folículo atinge o seu maior tamanho e inicia a sua atresia, o FSH atinge o mais baixo nível depois de 8 horas da divergência, indicando que o folículo com menor diâmetro pode ser inibido em menos de 8 horas em consequência da inibição causada pelos hormônios estrógeno e inibina produzidos pelo folículo dominante (GINTHER et al., 1999). A diminuição do

22 FSH por esses hormônios é decorrente de uma ação direta na hipófise anterior, diminuindo a expressão do gene que codifica a sub-unidade beta do FSH e reduzindo a transcrição e estabilidade do RNAm (ROCHE, 1996). As células da granulosa do folículo dominante começam a expressar receptores para LH próximo ao momento de seleção (JOLLY et al., 1994; XU et al., 1995; BODENSTEINER et al., 1996). Os demais folículos (subordinados) não expressam receptores para LH em suas células da granulosa e requerem maior concentração de FSH para continuar crescendo. A diminuição da concentração de FSH, portanto, causa atresia dos folículos e apenas o folículo dominante continua crescendo, podendo se tornar ovulatório. O folículo dominante apresenta duas habilidades principais: a primeira, suprir a quantidade de FSH necessária para o crescimento dos outros folículos e, a Segunda, utilizar baixas concentrações de FSH para seu crescimento e desenvolvimento (GINTHER et al., 2000) Função do hormônio luteinizante (LH) Em geral, o LH é um dos principais hormônios envolvidos no final do crescimento do folículo dominante. Os mecanismos envolvidos na função do LH, no momento da divergência folicular e início do crescimento do folículo selecionado, têm demonstrado que os folículos não crescem entre 7-9 mm quando ocorre supressão do LH (Gong et al., 1995; citados por GINTHER 1996) e que a fase de crescimento do folículo dominante é associada com a alta freqüência dos pulsos de LH (RHODES et al., 1995). Do mesmo modo a duração do folículo dominante pode ser aumentada com o aumento na freqüência dos pulsos de LH (FORTUNE et al., 1991; SAVIO et al., 1993a) e as células da granulosa adquirem receptores para LH no D2 e D4 depois da emergência da onda ou ovulação (Bodensteiner et al., 1996; Xu et al., 1995; citados por GINTHER, 2000). Contudo, as concentrações de LH aumentam antes do platô da divergência, mantendo-se elevada até depois deste e diminui a seguir, demonstrando que as elevadas concentrações de LH e a redução de FSH estão envolvidas no momento da divergência. Além do mecanismo endócrino, a seleção da dominância folicular ocorre por regulação autócrina e parácrina. Esses mecanismos ainda não estão muito compreendidos, mas já foi estabelecido que inibina, ativina, fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I) e suas proteínas de ligação (IGFBP) estão envolvidos

23 e atuam diretamente nas células da teca e granulosa, modulando o desenvolvimento folicular e a estereidogênese. O crescimento do folículo dominante e o aumento do estrógeno são caracterizados pelo aumento nos níveis de inibina, ativina e diminuição IGFBP, simultaneamente com o aumento nas concentrações de IGF-I. Existem evidências de que a ativina, inibina e IGFBP-2 têm efeito negativo na ação das gonadotrofinas no folículo e que os diferentes padrões de secreção de FSH e LH regulam esses fatores na seleção, dominância e perda de dominância do folículo dominante (Knight, 1991; Erickson et al., 1994; Roche, 1996; citados por NEVES et al., 1999). Portanto, o conhecimento do nível de cada hormônio em cada fase do ciclo é de fundamental importância para adotar qualquer conduta a respeito de tratamento ou interferência no ciclo normal dos animais Sincronização da onda folicular e tratamento superovulatório Segundo MARTINEZ et al. (1993), a razão evolucionária para um ciclo de duas ou três ondas ou, na verdade, para os próprios padrões de onda, não está clara, mas as diferenças entre os padrões de ondas existem e têm evidentes implicações sobre os esquemas para sincronização e superestimulação ovariana. O início do tratamento apenas um dia após a emergência da onda reduziu significativamente a resposta superovulatória comparada a tratamentos no dia da emergência da onda de crescimento (ADAMS, 1994). Está bem claro que o início da emergência de cada nova onda é precedido pelo aumento de FSH (ADAMS et al., 1992; ADAMS et al., 1993). É importante ressaltar que o decréscimo de FSH está associado à seleção do folículo dominante que ocorre um a três dias depois da emergência da onda folicular. O folículo dominante adquire a capacidade de continuar seu crescimento e produzir estradiol mesmo com a redução das concentrações de FSH. Esta capacidade parece ser devido à aquisição de receptores pelas células da granulosa para hormônios gonadotróficos, como o LH. Na superovulação, o decréscimo de FSH pode ser evitado pelo fornecimento de FSH exógeno, permitindo que vários folículos adquiram a capacidade funcional de um folículo dominante.

24 Mapletoft et al. (2000), baseando-se na duração das fases de desenvolvimento do folículo dominante, em intervalos interovulatórios de duas a três ondas, observaram que apenas cerca de 20% (quatro ou cinco dias) do ciclo estral estão disponíveis para se iniciar o tratamento no momento da emergência da onda folicular. Portanto, 80% do ciclo estral não são propícios para a obtenção de uma boa resposta superovulatória. Além destas dificuldades em iniciar o tratamento superovulatório no início da onda folicular, outros problemas nas respostas superovulatórias podem ser também decorrentes da proporção de FSH: LH nos produtos, da dosagem hormonal utilizada em protocolos de superovulação e a diferença das respostas entre animais da raça zebuína e taurina. Em vários estudos realizados com animais zebus comparando doses reduzidas de hormônios de 200 mg e 160 mg de FSH (Folltropin), foi observada a produção de embriões transferíveis de 9,37 e 9,60 (FERNANDES et al., 2000). Resultados semelhantes foram encontrados por Baruselli et al. (2002), trabalhando com vacas da raça Nelore superovuladas, não observaram diferenças significativas na produção de embriões transferíveis (6,5 ± 7,7, 5,6 ± 4,1, 7,7 ± 7,4), utilizando dosagens de 100, 130 e 200 mg de FSH (Folltropin-V). Outro aspecto importante foi que os animais tratados com menor dose retornaram mais rapidamente à atividade cíclica normal após a coleta, concluindose, assim, que a utilização de doses menores pode ser mais eficiente tanto no aspecto econômico quanto no aspecto técnico (FERNANDES et al., 2000). Outro problema é devido à presença do folículo dominante no início do tratamento com FSH. Apesar de algumas publicações discordantes (GRAY et al., 1992; MACIEL et al., 1995), atualmente, existem evidências na literatura de que a presença de um folículo dominante é prejudicial aos tratamentos para induzir superovulação (GUIBAULT et al., 1991; HUHTINEN et al., 1992; BUNGARTZ e NIEMANN, 1994; LUSSIER et al., 1995). Acredita-se que a presença de um folículo dominante (FD) no início do tratamento superovulatório suprima o crescimento de folículos menores não-dominantes, reduzindo as taxas de ovulação e recuperação de embriões quando comparadas a tratamentos com gonadotrofinas iniciados com a ausência de um folículo dominante. Portanto, várias estratégias têm sido utilizadas para evitar a presença do folículo dominante no início da administração de gonadotrofinas visando melhorar a

25 resposta superovulatória. Os métodos de sincronização da emergência da onda folicular em qualquer fase do ciclo estral em bovinos, antes da superestimulação, têm importante implicação no sucesso dos programas de transferência de embriões (WOLFSDORF et al., 1997) e de aspiração folicular in vivo em bovinos. A manipulação da onda folicular antes e durante a superestimulação pode reduzir a variabilidade na qualidade ovocitária e embrionária associada aos esquemas convencionais de produção de embriões. Considerando que, após a manifestação do cio, ocorrem a ovulação e o início de uma nova onda folicular, vários autores propuseram que o tratamento para induzir superovulação fosse realizado no início do ciclo estral (GOULDING et al., 1990; FRICK et al., 1994; STOCK et al., 1996). A desvantagem desse sistema é que o tratamento com gonadotrofinas tem que ser realizado por um período mais prolongado (seis dias), de forma a permitir que o corpo lúteo recém-formado tenha idade suficiente para responder à administração de PGF 2α e, assim, regredir. Entretanto, esse protocolo proporcionou uma menor resposta quando comparado aos protocolos tradicionais (oito a doze dias após o estro). Para diminuir tais problemas, tem sido proposta uma alternativa eficaz, a sincronização da emergência da onda, utilizando-se métodos mecânicos ou farmacológicos sem a necessidade de se esperar até a metade do ciclo estral para o início do tratamento superovulatório. Uma das alternativas para sincronizar a emergência da onda envolve a aspiração transvaginal guiada por ultra-som do folículo dominante ou de todos os folículos acima de 5 mm para a emergência de uma nova onda em qualquer fase do ciclo estral, seguida do tratamento com gonadotrofinas (BERGFELT et al, 1994; BODENSTEINER et al., 1996; HILL et al., 1996). Vários trabalhos realizados na espécie bovina utilizando esta técnica, seguida do tratamento com FSH um dia após a ablação e aplicação de prostaglandina 48 horas após o início do tratamento com FSH, comparando com animais sem a utilização da ablação do folículo dominante ou de folículos 5 mm e início do tratamento superovulatório 8 a 12 dias após o estro, obtiveram resultados semelhantes (SHAW e GOOD, 2000; KIM et al., 2001; BÓ et al., 2004). Tal fato sugere que estes tratamentos são bastante eficazes e que podem ser utilizados nos protocolos de superovulação, embora, necessitem de um equipamento dispendioso. Uma alternativa mais econômica é a utilização de tratamentos hormonais para sincronização da onda folicular de modo que o início desta coincida com o

26 início da superovulação, por meio do uso de prostaglandinas, progestágenos, estrógenos e outros hormônios como os análogos do GnRH e LH. Prostaglandinas A PGF 2 α foi descoberta no início da década de 70 como um potente agente luteolítico (Mc CRAKEN, 1972). A partir disto, a prostaglandina e seus análogos têm sido os produtos farmacológicos mais utilizados nos tratamentos para sincronização do estro em fêmeas bovinas (ODDE, 1990). O sucesso da resposta na sincronização do estro depende da presença e da maturidade do corpo lúteo (CL), já que a função da luteolisina é provocar a regressão morfológica e funcional desta estrutura (RATHBONE et al., 2001). As prostaglandinas e seus análogos funcionam como agentes luteolíticos em vacas que estão ciclando normalmente, determinando queda dos níveis de progesterona, desenvolvimento folicular e pico de LH com horas ou 48 horas em animais superovulados, após a aplicação de prostaglandina. Após a luteólise, o estro e a ovulação são distribuídos ao longo de seis dias e são influenciados, não apenas pela responsividade do corpo lúteo, mas também pelo estádio de desenvolvimento do folículo dominante (KASTELIC e GINTHER, 1991). Foi observada, no intervalo uma mínima variabilidade para o estro, quando o tratamento da prostaglandina foi iniciado no diestro (7 e 8 dias após o estro) e no período final do diestro (15 dias após o estro) em comparação com a da fase intermediária do diestro (10 a 13 dias após o estro (Seguin, 1987; Tanabe e Hann, 1984; citados por MAPLETOFT et al., 2000). Essa variação pode ser devida ao estado folicular no momento do tratamento. Trabalhos realizados em animais da espécie bovina com prostaglandina com a aplicação no 5 dia do ciclo estral, quando o folículo dominante da primeira onda ainda se encontra em fase de crescimento, possibilitaram observar o intervalo de três dias entre a aplicação e a ovulação. Quando o tratamento foi iniciado no 12 dia do ciclo estral, o folículo dominante da segunda onda encontra-se no início da fase de crescimento e a ovulação ocorreu 4,5 dias após a aplicação. No caso do tratamento ser iniciado no 8 dia do ciclo, pode ser observada a ovulação do folículo dominante da primeira onda dois dias após a aplicação, mas, ocasionalmente pode

27 ocorrer a ovulação do segundo folículo dominante seis dias após o tratamento (Kastelic e Mapletoft, 1998; citados por BARUSELLI et al., 2002). Outro tratamento é a aplicação de duas doses de prostaglandina com intervalo entre 10 a 11 dias, o qual tem sido utilizado por representar o ponto médio do ciclo estral e, teoricamente, todas as vacas devem ter um corpo lúteo responsivo em uma ou em ambas as aplicações. Baseado na dinâmica folicular, no entanto, um intervalo mais longo de 14 dias entre as aplicações resultou numa melhor taxa de concepção quando comparada ao do tratamento com 11 dias (FOLMAN et al., 1990). Entretanto, tais tratamentos têm apresentado grande variação na detecção do estro e ovulação, tanto em Bos taurus, quanto em Bos indicus. Este dado demonstra que os tratamentos feitos somente com prostaglandina sincronizam eficientemente a luteólise e não o estádio de desenvolvimento do folículo ovulatório (BARUSELLI et al., 2002). Desta maneira, pesquisadores propuseram outros protocolos que controlam o desenvolvimento luteínico e folicular com o objetivo de sincronizar o crescimento dos folículos e ovulação, permitindo a inseminação com tempo fixo (IATF) sem a necessidade da observação do cio (BÓ et al., 2003). Progestágenos e estrógenos A ação da progesterona na sincronização do ciclo estral tem sido demonstrada desde a década de 60. Este hormônio pode ser utilizado por meio de implantes subcutâneos e dispositivos intravaginais. Existem dois tipos de implantes, o hidrônico com 6 mg de norgestomet (Syncromate-B) e o silástico com 3 mg de norgestomet (Crestar) e 1,9 g de progesterona (CIDR), que agem de forma diferente. O primeiro libera níveis mais altos de progesterona nos primeiros dois dias, diminuindo-os nos dias restantes e o segundo libera progesterona de forma mais homogênea e linear (BARUSELLI et al., 2002). Trabalhos em que os animais recebiam doses diárias deste hormônio em doses variadas por períodos de até 20 dias, apresentavam índices satisfatórios para a sincronização do estro de até 90% no entanto, com baixo índice de fertilidade de 33 e 68% por induzir a ovulação de folículos persistentes (ODDE et al., 1990).

28 Este produto associado a estrógenos e à prostaglandina mostrou ser eficaz na sincronização da nova onda folicular. Os implantes intravaginais de progesterona têm a finalidade de manter altos níveis de progesterona para suprimir a liberação endógena do hormônio luteinizante, imitando a fase luteínica do ciclo estral. A regressão luteal é alcançada pela aplicação de estradiol no início do tratamento ou pela administração de prostaglandinas no momento ou horas antes da remoção do implante. BÓ et al. (1996) testaram a eficácia da associação dos progestágenos com estrógenos e verificaram que estes hormônios induziam o crescimento de uma nova onda folicular entre quatro a cinco dias após o início do tratamento. Tais hormônios associados ao tratamento superovulatório resultaram em um número de embriões transferíveis de 6,6 ± 0,2 similares aos dos tratamentos superovulatórios tradicionais realizados entre os dias 8 e 12 do ciclo estral que foram de 6,3 ± 0,6 embriões. A progesterona exógena tem mostrado ser capaz de suprimir o crescimento do folículo dominante de forma dose-dependente (SAVIO, et al., 1993a, 1993b; ADAMS, 1994; BURKE, et al., 1994), enquanto o estradiol induz a atresia folicular (DIERSHKE, 1994). Portanto, a utilização destes hormônios permite o início do tratamento superovulatório em qualquer dia do ciclo estral, de maneira sincronizada e pré-determinada. Os protocolos de superovulação desenvolvidos nos últimos anos têm melhorado o manejo das doadoras, entretanto, a variabilidade da resposta ovariana aos tratamentos superovulatórios continua sendo o maior problema nos programas de transferência de embriões. Essa variabilidade pode ser decorrente da assincronia entre a maturação nuclear e citoplasmática dos ovócitos recuperados de animais superovulados (Hytell et al., 1991; citados por BARROS et al., 2001). Vos et al. (1994); citados por BARROS et al. (2001), observaram que somente 25% dos folículos estimulados por FSH exógenos foram capazes de ovular em resposta à onda pré-ovulatória de LH. Isto pode ser explicado pela diferença observada entre os diâmetros dos folículos em crescimento, em decorrência da maior presença de folículos menores os quais não estariam maturos o suficiente para responder a onda de LH e a ovulação. Mediante essas dificuldades, uma hipótese proposta por estes autores seria provocar o atraso da onda de LH que permitiria que um maior número de folículos em desenvolvimento adquirisse a

29 capacidade de ovular, com consequente aumento na taxa de recuperação de embriões de animais superestimulados. Trabalhos realizados em ruminantes sugeriram que a progesterona inibe a frequência do pulso do LH e que o estradiol age principalmente na inibição da amplitude do pulso de LH e que pode ocorrer certa sinergia entre esses dois hormônios (PRICE et al., 1999). Contudo, em trabalho realizado com vacas da raça Nelore, sincronizando a onda folicular com progestágeno (CIDR) e benzoato de estradiol, realizando o tratamento superovulatório 5 dias após, com aplicação de prostaglandina realizada 48 horas após o início do FSH. As amostras de sangue foram coletadas 36 horas após a prostaglandina, durante 60 horas com intervalos de 4 horas. Tal procedimento permitiu observar que o pico pré-ovulatório de LH ocorreu aproximadamente 47 horas após a administração de prostaglandina e, cerca de 12 horas antes, em animais que não foram superovulados (MONTEIRO et al., 2003). Vos et al. (1994) utilizaram um progestágeno para inibir o pico endógeno do LH e induziram a ovulação por meio da aplicação de GnRH, em novilhas da raça Holandesa superovuladas com ecg. Pôde ser observada a onda pré-ovulatória de LH, 50 horas após a prostaglandina, como também, o maior número de maturação e ovulação dos folículos, contudo, com uma redução no número de embriões viáveis. No estudo seguinte, tais autores utilizaram o mesmo protocolo, sendo os ovócitos coletados 24 horas após o pico de LH (56,6 ± 0,2 h após a PGF2α) e fertilizados in vitro. Obtiveram uma produção de embriões semelhantes ao do grupo que não teve atraso na ocorrência do pico de LH (40,8 ± 1,3 h após a PGF2α). Tal fato sugere que o atraso no pico de LH não afetou a fertilização ou o desenvolvimento embrionário (VOS et al., 1996). Van de Leemput et al. (1999), comparando a capacidade de fertilização e produção de embriões de ovócitos maturados in vitro versus in vivo em novilhas holandesas superovuladas com ecg, observaram o pico de LH 56 horas após a aplicação de prostaglandina e uma percentagem na produção de blastocistos duas vezes maior nos ovócitos maturados in vivo quando comparados aos in vitro (49,3 ± 6,1% e 26,4 ± 1,0%), respectivamente. Com estes resultados, os autores sugeriram que a maturação in vitro é um dos fatores mais limitantes na produção de embriões viáveis.

30 Progestágenos e hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) associados ao hormônio luteinizante (LH) Uma outra estratégia para sincronização da onda folicular seria a utilização de análogos do GnRH, que provocam a dessensibilização da hipófise anterior à ação do GnRH endógeno ou exógeno. Como este procedimento ocasiona também o atraso no pico endógeno pré-ovulatório de LH, propicia o tempo necessário para que os folículos menores, recrutados, por meio da aplicação exógena de FSH, sofram mudanças intrafoliculares e possam estar plenamente maduros e aptos a ovular quando o pico endógeno de LH for induzido (D'OCCHIO et al., 1997; PRICE et al., 1999; VAN DE LEEMPUT et al., 1999). Alguns autores, trabalhando com novilhas da raça Brahman, inibiram o pico pré-ovulatório de LH com implante de deslorelina e progesterona e induziram a ovulação com a administração exógena de LH no final do tratamento superovulatório com 48, 60, 72 horas após a aplicação de prostaglandina, comparando ao grupocontrole cujos animais não receberam o implante e aplicação de LH (D'OCCHIO et al., 1997). Foram observadas melhores taxas de embriões transferíveis no grupo que recebeu LH 60 horas após a aplicação de prostaglandina, ou seja, o LH foi aplicado com 12 horas de atraso em relação ao pico endógeno de LH, que ocorre aproximadamente 48 horas após a aplicação de prostaglandina. Os piores resultados foram notados no grupo que recebeu o LH 72 horas após a prostaglandina. Com estes resultados, os autores sugeriram que, no grupo que recebeu a aplicação de LH 48 horas após a prostaglandina, ou seja, no momento do pico do LH endógeno, alguns folículos ainda não tinham adquirido competência para responder ao LH e, 12 horas mais tarde, já teriam condições de responder ao estímulo gonadotrófico e ovular. Nogueira et al. (2000) trabalharam com animais da raça Nelore superovuladas com FSH, com objetivo de avaliar os efeitos do atraso na ovulação na produção de embriões viáveis e na taxa de prenhez após a transferência dos mesmos. O pico endógeno de LH foi atrasado com a utilização de análogo do GnRH (grupo D) ou com a inserção de um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR, grupo P), cuja aplicação de prostaglandina foi realizada 48 horas após o FSH. A ovulação foi induzida pela administração exógena de LH 48 (P48) e 60 (P60, D60) horas após a aplicação de prostaglandina. Foram observados neste experimento, o

31 número de embriões (8,5 ± 1,9, 9,0 ± 1,3, 5,6 ± 1,9, 6,7 ± 1,8) e a taxa de prenhez (51,1%, 47,7%, 45,5% e 48%) em relação aos grupos-controle, P48, P60 e D60. Os autores concluíram que a utilização do análogo do GnRH leva à taxa normal de prenhez e a presença do dispositivo de progesterona, por 48 ou 60 horas após a administração de prostaglandina, não apresentou problemas na produção de embriões viáveis, bem como na taxa de prenhez. Concluiram ainda que o protocolo P48 é o mais promissor, devido à praticidade do manejo das doadoras por dispensar a observação do cio e pela produção mais elevada de embriões viáveis. Outros autores, trabalhando com animais Nelore e protocolo similar ao do trabalho anterior em que, para o atraso da onda de LH, foi utilizado o implante de progesterona (CIDR), e a ovulação foi induzida pela aplicação do GnRH (Acetato de buserelina) com 42 (P42), 48 (P48) e 54 (P54) horas após a prostaglandina, encontraram número de embriões viáveis de 5,86 ± 1,55, 5,13 ± 1,26, 2,86 ± 0,68, 2,86 ± 1,38 para o grupo-controle, P42, P48 e P54, respectivamente (Andreussi, 2001, citado por BARROS et al., 2001). Uma das possíveis explicações para estes resultados foi o nível subluteal de progesterona, mantido pelos dispositivos liberadores desse hormônio e o tempo de, aproximadamente, 48 horas foi o limite. Após este período, podem ocorrer alterações no ambiente dos ovidutos e comprometimento do desenvolvimento embrionário. A segunda explicação seria que, mesmo utilizando animais da mesma raça nos trabalhos realizados por Nogueira et al. (2000), os animais pertenciam a linhagens diferentes, tendo sido utilizadas vacas selecionadas durante muitos anos de acordo com o desempenho reprodutivo. Por outro lado, no trabalho de ANDREUSSI (2001), os animais foram selecionados somente pelos parâmetros morfológicos, o que demonstra a importância na seleção das doadoras. Entretanto, Barros e Nogueira (2001), trabalhando com animais da raça Nelore, propuseram uma modificação do P48, denominada P36, sendo o dispositivo CIDR-B removido 36 horas após a prostaglandina, ou seja, 12 horas antes em comparação com o protocolo P 48. Realizaram a aplicação de LH 12 horas após a retirada do dispositivo e as inseminações artificiais foram realizadas em tempo fixo, após 12 e 24 horas e, eventualmente, 36 horas. Os resultados iniciais obtidos foram bem satisfatórios com uma taxa de viabilidade de 78,7%, estruturas totais de 13,4 e embriões viáveis de 10,6, demonstrando, mesmo que inicialmente, resultados promissores. Resultados preliminares semelhantes foram observados em doadoras