RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS PELA TÉCNICA DE OPU NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE DOADORAS DA RAÇA GUZERÁ APÓS TRATAMENTO COM FSH/GnRH

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1 RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS PELA TÉCNICA DE OPU NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE DOADORAS DA RAÇA GUZERÁ APÓS TRATAMENTO COM FSH/GnRH REUBES VALÉRIO DA GAMA FILHO UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ JANEIRO

2 RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS PELA TÉCNICA DE OPU NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE DOADORAS DA RAÇA GUZERÁ APÓS TRATAMENTO COM FSH/GnRH REUBES VALÉRIO DA GAMA FILHO Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Orientador: Prof. Francisco Aloizio Fonseca CAMPOS DOS GOYTACAZES - RJ JANEIRO

3 RECUPERAÇÃO DE OÓCITOS PELA TÉCNICA DE OPU NA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES IN VITRO DE DOADORAS DA RAÇA GUZERÁ APÓS TRATAMENTO COM FSH/GnRH REUBES VALÉRIO DA GAMA FILHO Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal. Aprovada em 17 de janeiro de Comissão Examinadora: Prof. Aldo Shimoya (D.Sc., Genética e Melhoramento) - UNIVERSO Prof. Reginaldo da Silva Fontes (D.Sc., Reprodução Animal) - UENF Prof. José Frederico Straggiotti Silva (D.Sc., Reprodução Animal) - UENF Prof. Francisco Aloizio Fonseca (Ph.D., Fisiologia Animal) - UENF (Orientador)

4 Toda resposta precede um novo questionamento e, assim, somos eternamente alunos, buscando a compreensão para o inexplicável sentido da vida. Reubes Valério (2006). ii

5 DEDICATÓRIA Á minha amada família, Meus filhos, Pedro Henrique, Maria Clara e minha esposa, Verônica Monteiro Machado da Gama, pelo seu amor e compreensão. Aos meus pais, Lisete Monteiro da Gama e Reubes Valério da Gama, que me mostraram o valor da vida e sempre estiveram presentes nos momentos mais difíceis. Aos meus irmãos, Leonardo Monteiro da Gama e Deborah Monteiro da Gama, por todo afeto, companheirismo e ajuda. Ao meu sobrinho Davi, por mostrar que a vida sempre recomeça. iii

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Norte Fluminense - UENF e a Fundação Estadual do Norte Fluminense - FENORTE, pela oportunidade de realizar este curso e pelo aprendizado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Rio de Janeiro - FAPERJ, pelo apoio financeiro. Ao professor Francisco Aloizio Fonseca, pela sensatez, amizade e orientação criteriosa, sempre disposto a transpor os obstáculos. Ao professor e Chefe do setor de Reprodução do LMGA, Reginaldo da Silva Fontes, pelo apoio, confiança e incentivo para a realização do experimento. Ao professor e Chefe do LZNA, Carlos Augusto de Alencar Fontes, pela solicitude para equacionar os problemas surgidos durante a realização do trabalho. Ao professor e Chefe do LMGA, José Frederico Straggiotti Silva, pela postura de humildade, serenidade e amizade nestes quatro anos de curso. Aos profissionais e amigos, Vanessa, Leonardo, Marco César pelo apoio e incentivo durante todo o Doutorado. Aos alunos de graduação Carlos Henrique e Fernanda, pela imensa ajuda e amizade. Aos funcionários do LMGA e LZNA, pelo auxílio nos problemas diários. A todos os colegas do curso de pós-graduação, pelo convívio agradável. Aos amigos do LZNA João, Lombardi, pelo companheirismo. iv

7 Aos meus familiares Sr a Ruth, Sr. Enilton, Andréa, Enilton, Maria Luiza e Amanda, Leandro, Geane e minha afilhada Maria Eduarda pelo incentivo e amizade. Aos funcionários do Setor de Reprodução do LMGA, pelo apoio durante o período experimental. À professora Célia pela orientação, amizade e realização das análises estatísticas. A Jovana, Etiene e Nara pela paciência e amizade. A Simone do LZNA, pela ajuda e amizade. A todos os meus familiares, que apoiaram e incentivaram a realização deste trabalho. Muito obrigado. v

8 BIOGRAFIA Reubes Valério da Gama Filho, filho de Lisete Monteiro da Gama e Reubes Valério da Gama, nasceu em 18 de outubro de 1971, na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ. Em agosto de 1993, ingressou no curso de Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) - RJ, diplomando-se em dezembro de Em agosto de 1999, foi admitido no curso de Pós - Graduação em Produção Animal ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - Campos dos Goytacazes, RJ. Em agosto de 2001, submeteu-se a defesa de Tese e conclusão do curso. Em agosto de 2001, foi admitido no curso de Pós - Graduação em Produção Animal ao nível de Doutorado, na área de Reprodução Animal, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - Campos dos Goytacazes, RJ. Em janeiro de 2006, submeteu-se a defesa de Tese e conclusão do curso. vi

9 CONTEÚDO RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Dinâmica folicular ovariana em zebuínos Aspiração folicular guiada por ultra-som Parâmetros hormonais e superestimulação Formação de oócitos não inclusos em folículos MATERIAL E MÉTODOS Ambiente experimental e doadoras Delineamento experimental Tratamento hormonal FSH/GnRH Aspiração folicular guiada por ultra-som Análise hormonal Ultra-sonografia Avaliação morfológica e classificação dos COCs MIV, FIV, CIV e capacitação espermática Classificação embrionária Histologia ovariana Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS VIII X vii

10 RESUMO GAMA FILHO, Reubes Valério; DsC ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; janeiro de 2006; Recuperação de oócitos pela técnica de OPU na produção de embriões in vitro de doadoras da raça Guzerá após tratamento com FSH/GnRH; Professor Orientador: Francisco Aloizio Fonseca; Professores Conselheiros: Reginaldo da Silva Fontes e Célia Raquel Quirino. Objetivou-se verificar os efeitos da aplicação de GnRH, associado ao aumento do tempo de maturação in vivo, na taxa de recuperação e no potencial de desenvolvimento oocitário para a produção in vitro de embriões e avaliar a eficácia do protocolo utilizado para a sincronização da onda folicular em novilhas da raça Guzerá. As fêmeas foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos, GI (n=4) o controle (FSH) e o GII (n=4) FSH/GnRH. A sincronização foi realizada com CIDR (por 9 dias) associando uma aplicação de 2 mg de Estrogin, em qualquer fase do ciclo estral, sendo o dia da colocação do implante o dia zero (D0). Nos dias D-1, D4, D6 e D9 (dia da aspiração), foi coletado sangue para dosar a concentração de estradiol e progesterona. No D5 foi iniciado o tratamento estimulatório com a dosagem total de 100 mg de FSH por animal em doses decrescentes por três dias consecutivos, com intervalo de 12 h. Quarenta e oito horas após o início do tratamento hormonal aplicou-se 500 µg de cloprostenol sódico (IM). No GII as novilhas receberam a aplicação IM de 25 µg de GnRH (Fertagyl - Intervet) 12 h antes da aspiração folicular. Em ambos os grupos a aspiração foi realizada 48 h após a última aplicação de FSH e, seis dias após, foi inserido novamente um CIDR. viii

11 Onze dias após a aspiração folicular foi reiniciado o tratamento estimulatório. Os folículos com diâmetro 6mm e > 6 mm foram puncionados em tubos diferentes. Os oócitos recuperados foram classificados e submetidos à rotina de MIV, FIV e CIV. Três meses do término do experimento, 2 animais de cada grupo foram submetidos à histologia ovariana. Ocorreu aumento do número de folículos no período préestimulatório. A dose de 100 mg de FSH demonstrou-se suficiente para a mobilização folicular. Trinta e cinco por cento das fêmeas apresentaram fibrose difusa no estroma ovariano e a hialinização do endotélio arterial foi observado em 100 % das novilhas. A recuperação ovocitária foi de 87,4 ± 3,72 (GI-controle) e 88,5 ± 5,25 (GII-GnRH). Foi encontrado aumento no número de oócitos grau 1 no GII (7,71 ± 1,48) e no GI (6,36 ± 2,04). O GII apresentou maior número de blastocistos em relação ao GI (6,10 ± 1,86 e 5,18 ± 2,36, respectivamente), onde os de grau I e II foram identificados em maior quantidade no GII (4,08 ± 0,93) se comparado ao GI (3,02 ± 1,18). Blastocistos grau III (GI - 1,12 ± 0,33 e GII - 1,43 ± 0,61) e IV (GI - 1,04 ± 0,63 e GII - 0,59 ± 0,26), apresentaram diferença significativa entre os grupos. Conclui-se que o protocolo utilizado foi eficiente na sincronização da onda folicular e doses menores de FSH parecem ser suficientes para um adequado estímulo ovariano. Oócitos derivados de folículos com diâmetro > 6 mm possuem maior competência que os originados de folículos menores ( 6 mm) e a associação do coasting period de 48 h após a última aplicação de FSH e a administração de GnRH 12 h antes da aspiração folicular sugere incremento na produção de blastocistos grau I e II, elevando a viabilidade embrionária. Palavras chaves: sincronização folicular, blastocisto, GnRH, Guzerá, coasting period ix

12 ABSTRACT GAMA FILHO, Reubes Valério; DsC. ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; January de 2006; COCs Recovery the oocytes per OPU technology in embryo production in vitro of Guzerá breed donors after treatment with FSH/GnRH; Advisor: Francisco Aloizio Fonseca; Committee members: Reginaldo da Silva Fontes e Célia Raquel Quirino. The objective of this study was to verify the effect of the application of GnRH, associated to the increase of the maturation time in vivo, on the recovery rate and the potential of oocyte development for the in vitro production of embryos and to evaluate the effectiveness of the protocol used for the synchronization of the follicular wave in Guzerá breed heifers. The heifers had been distributed randomly in two groups, GI (n=4) the control (FSH) and GII (n=4) FSH/GnRH. The synchronization was carried out through the CIDR (during 9 days) associated with an application of 2 mg of Estrogin, in any phase of the estrous cycle, being the day of the implantation day zero (D0). On the D-1 day, D4, D6 and D9 (day of the aspiration) blood were collected to measure the estradiol and progesterone concentration. In the D5 it was initiated the estimulatory treatment in decreasing doses per three consecutive days with the total dosage of 100 mg the FSH, per animal with interval of 12 h. Twenty eigthy hours after the beginning of the hormonal treatment it was applied 500 µg of cloprostenol (IM). In the GII the heifers had received IM application of 25 µg of GnRH (Fertagyl - Intervet) 12 h before the follicular aspiration. In both the groups the aspiration was carried through 48 h after the last application of FSH and, 6 days after, a CIDR was inserted again. Eleven days after the follicular aspiration the estimulatory treatment was restarted. The follicles with diameter 6mm and > 6 mm

13 had been punched in different pipes. The recovered oocytes had been classified and submitted to the routine of MIV, FIV and CIV. Three months after the end of the experiment 2 animals of each group were submitted to the ovarian histology. Increase of the number of follicle in the period occurred daily pre-estimulatory. 100 mg of FSH demonstrated enough mobilization of follicles. 35 % of the females had presented diffuse fibrose in the ovarian estroma and the hialinization of the arterial endotelio was observed in 100 % of the heifers. The oocyte recovery rate was of 87.4 ± 3.72 (GI-control) and 88.5 ± 5.25 (GII-GnRH). An increase in the number of oocytes was found in degree 1 in the GII (7.71 ± 1.48) and in the GI (6.36 ± 2.04). The GII presented greater number of blastocysts in relation to the GI (6.10 ± 1.86 and 5.18 ± 2.36, respectively), where degree I and II had been identified in bigger amount in the GII (4.08 ± 0.93) if compared with the GI (3.02 ± 1.18). Blastocysts degree III (GI ± 0.33 and GII ± 0.61) and IV (GI ± 0.63 and GII ± 0.26) had presented significant difference between the groups. One concludes that the used protocol was efficient in the synchronization of the follicular wave and lower doses of FSH seem enough for one to be adjusted ovarian stimulated. Oocytes derived from follicles with diameter > 6 mm possess greater competence than, that originated from smaller follicle (< 6 mm) and the 48 h association of "coasting period" after the last application of FSH and the administration of GnRH 12 h before the follicular aspiration suggests increment in the production of blastocists degree I and II, increasing the embryonic viability. Key words: follicular synchronization, blastocysts, GnRH, Guzerá, coasting period

14 1 I - INTRODUÇÃO O desenvolvimento das biotecnologias da reprodução demonstrou um grande potencial no aumento da produtividade da pecuária bovina, proporcionando uma exploração mais efetiva de animais que se destacam pelo seu elevado mérito genético. A manipulação das funções reprodutivas provavelmente é uma das formas mais antigas de intervenção do homem no processo de domesticação dos animais. A coleta de gametas masculinos não chegou a ser um problema de difícil solução, sendo a inseminação artificial uma das primeiras técnicas modernas de reprodução assistida, podendo ocorrer a inseminação de várias fêmeas com o esperma de um único touro. Diante destas considerações, ficou evidente o papel dos machos nos programas de seleção. A influência das fêmeas em um programa de acasalamentos limitava-se em média, a um máximo de 10 partos por vaca durante sua vida reprodutiva. Com o desenvolvimento da técnica de transferência de embriões o papel da fêmea na reprodução aumentou significativamente. A superovulação em novilhas ou em vacas possibilitou a produção de vários embriões por inseminação, mesmo sendo uma técnica que apresenta grande variação na resposta individual das doadoras ao tratamento superovulatório, traduzindo em alta variabilidade nas taxas de ovulação e fecundação, resultando em uma falta de previsão confiável do número de embriões coletados por lavado (HASLER, 1998).

15 2 A fertilização in vitro (FIV) pode ser considerada a terceira geração de biotecnologia da reprodução, após a inseminação artificial e a transferência de embriões (THIBIER, 1990). Esta técnica associada à maturação in vitro demonstrou um grande potencial na utilização da reserva de gametas presentes nos ovários das fêmeas bovinas. As técnicas como a maturação, a fertilização e o cultivo in vitro (CIV) estão sendo exploradas com o objetivo de maximizar a utilização do grande número de oócitos presentes nos ovários das potenciais doadoras. A qualidade dos oócitos recuperados é um dos principais requisitos para o sucesso da FIV. Estas técnicas podem contornar diversas limitações inerentes aos procedimentos usuais de superovulação, sem comprometer a fertilidade das doadoras, permitindo explorar esta reserva nas diversas fases da vida reprodutiva, aumentando o potencial produtivo (ARMSTRONG, 2001; KRUIP et al., 1998; KRUIP e DEN DAAS, 1997). Entretanto, a maioria dos estudos foi realizado em oócitos cultivados provenientes de ovários de matadouro, onde esta qualidade em muitos casos não é atendida, devido ao desconhecimento da condição hormonal e sanitária das fêmeas abatidas (BOLS et al., 1995). Mesmo assim, oócitos cultivados e fecundados in vitro têm resultado em gestações nas diversas espécies de mamíferos, onde destaca-se a bovina. As punções ovarianas podem ser uma alternativa para a produção de gametas de novilhas e fêmeas de elevado mérito genético que não respondem aos tratamentos superovulatórios convencionais (LOONEY et al., 1994), ou que apresentam um quadro de infertilidade. Estes animais não possuem capacidade para manter uma prenhez quando cobertos naturalmente ou inseminados artificialmente e também apresentam inabilidade para produzir embriões viáveis após coletas com superovulação. Explorar eficientemente o potencial das técnicas de maturação e fertilização in vitro, na multiplicação do material genético, depende do desenvolvimento de procedimentos que permitam repetidas coletas oocitárias dos animais utilizados como fonte de gametas, para que se possa otimizar a produção de embriões a partir do cultivo in vitro. Uma das técnicas mais utilizadas para solucionar esta questão é a punção ovariana transvaginal guiada por ultra-som, que permite a aspiração dos folículos intra - ovarianos repetidas vezes ao longo do ciclo estral (BONI et al., 1997; BOLS, 1997).

16 3 A metodologia de coleta dos oócitos por punção dos folículos foi descrita pela primeira vez por PIETERSE et al. (1988). Algumas vantagens da técnica de aspiração folicular em comparação ao MOET (múltipla ovulação e transferência de embrião) podem ser observadas. Duas sessões de punção ovariana por semana, produzem aproximadamente 150 embriões, que resultam em 70 nascimentos/ano em média. Outra vantagem desta técnica, é a possibilidade de fertilizar os oócitos recuperados com sêmen de diferentes touros, aumentando o número de possíveis combinações genéticas. Todavia, a técnica de aspiração folicular apresenta desvantagens, como por exemplo: a taxa de gestação é baixa depois da transferência do embrião e casos de distocia são freqüentemente reportados, devido ao tamanho do feto (FARIN et al., 2001; VAN WAGTENDONK et al., 2000). A técnica de aspiração de oócitos intra-ovarianos e posterior cultivo in vitro, é totalmente recomendada e justificável quando as fêmeas que serão submetidas a este programa possuem elevado mérito genético. O aumento do número de produtos destes animais, em tempo reduzido, permite ganhos genéticos imediatos para o rebanho, além de potencializar programas de melhoramento e seleção animal. A produção de um grande número de nascimentos destes animais diferenciados envolve a coleta de oócitos durante a gestação ou em fêmeas jovens, aumentando a intensidade de seleção e reduzindo o intervalo entre as gerações. O termo competência oocitária refere-se a habilidade do oócito em desenvolver-se até o estádio de embrião ( 16 ou 32 células, mórula ou blastocisto, respectivamente) após a maturação in vitro, fertilização in vitro e cultivo in vitro. A manipulação folicular busca produzir maior número de oócitos competentes e a técnica in vitro oferece esta possibilidade, porém com taxas de sucesso variáveis. Uma das possíveis causas destas variações é o estágio de maturação que se encontram os folículos. As condições in vitro para a cultura embrionária não são responsáveis pelo decréscimo na competência oocitária (GORDON e LU, 1990). De fato, complexos cumulus-oócitos que são maturados in vivo, fertilizados e desenvolvidos in vitro aumentam o seu potencial para produzirem blastocisto, depois de 11 dias de cultura, dobrando a percentagem de blastocistos produzidos, quando

17 4 comparados com a maturação in vitro (MIV - 26,4% ± 1,0 % blastocistos; maturação in vivo - 49,3% ± 6,1% blastocistos) (VAN DE LEEMPUT et al., 1999). A qualidade do ambiente onde o oócito foi produzido parece ser de vital importância para o desenvolvimento de sua competência. Muitos estudos têm avaliado as diferentes características foliculares, que podem apresentar fatores associados com o aumento da competência oocitária. Algumas características como, tamanho folicular, integridade do folículo, perfil hormonal e status ovariano (HAGEMANN et al., 1999; OUSSAID et al., 2000), possivelmente influenciam o desenvolvimento da competência oocitária. É interessante ressaltar que deve ser utilizado sêmen de touros testados in vitro, com o objetivo de maximizar a produção embrionária, chegando a alcançar uma taxa de blastocisto na ordem de 60% (WATANABE et al., 1997). Alguns fatores parecem estar intimamente relacionados com o desenvolvimento da competência do oócito, dentre os quais destacam-se: diâmetro folicular (FAIR et al., 1995), integridade das células do cumulus, homogeneidade do ooplasma. Estas características podem ser observadas em oócitos oriundos de folículos que apresentaram um eficiente processo de maturação (BLONDIN et al., 2002). Não é observado incremento na proporção de oócitos competentes derivados de folículos com diâmetro variando entre 3 a 7 mm. Contudo, quando é realizada a punção de folículos de > 8 mm de diâmetro recuperados de doadoras tratadas com gonadotrofinas evidencia-se um aumento na competência dos oócitos coletados (HENDRIKSEN et al., 2000). A superestimulação hormonal aumenta o número de folículos com diâmetro adequado para aspiração e, conseqüentemente, maior número de embriões podem ser produzidos, devido as maiores taxas de recuperação (BROGLIATTI e ADAMS., 1996). Contudo, a taxa de recuperação tende a diminuir com o decorrer do tempo, podendo ter como justificativa, a elevação da concentração plasmática de progesterona observada em animais superestimulados, devido à presença de corpos lúteos persistentes, formados após a punção (PIETERSE et al., 1992).

18 5 Deve ser considerada a possibilidade da utilização de menores doses de FSH nos programas de estimulação hormonal, buscando o prolongamento da resposta das doadoras e também tornando a técnica mais accessível no que tange às questões econômicas. A superestimulação ovariana pode causar desbalanço endócrino, mudanças na esteroidogênese folicular, anormalidades na maturação citoplasmática e nuclear dos oócitos e assincronia entre o crescimento folicular e a ovulação (ASSEY et al., 1994; GREVE et al., 1995). A administração de FSH não aumenta a percentagem de blastocistos produzidos, quando comparado com animais não tratados, podendo ser um fator de redução no desenvolvimento da competência do complexo cumulus-oócito recuperado (LONERGAN et al., 1994). Recentes publicações demonstram que múltiplas doses de FSH não têm efeito significativo sobre a taxa de produção embrionária, somente aumentando o número de embriões transferíveis (GOODHAND et al., 2000). Outro aspecto relevante é a importância do estádio de desenvolvimento dos folículos e o tempo de maturação in vivo dos oócitos que serão recuperados e manipulados no laboratório. A inabilidade do oócito de ser fertilizado provavelmente é atribuída a incompleta maturação citoplasmática, sendo esta definida como processos oocitários que o preparam para a fertilização e ativação (EPPIG et al., 1992). Claramente, os complexo cumulus-oócitos apresentam redução do potencial de desenvolvimento quando coletados durante a fase de crescimento, período de dominância e desenvolvimento folicular (HAGEMANN et al., 1999). Tem sido demonstrado que o coasting period afeta significativamente o potencial de desenvolvimento do complexo cumulus-oócito. Este período consiste no intervalo entre o término do estímulo hormonal e a aspiração folicular (BLONDIN et al.,1997; DE WIT et al., 2000). O aumento do tempo de maturação in vivo dos oócitos, associado ao tratamento hormonal com GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) pode aumentar o potencial de desenvolvimento dos oócitos aspirados (BORDIGNON et al., 1997). In vivo, a pré-maturação ocorre durante o desenvolvimento pré-ovulatório e antes da liberação da onda de LH. A pré-maturação parece fornecer uma capacidade intríseca para os oócitos atingirem a condição de embrião, após fertilização e cultivo in vitro (HENDRIKSEN et al., 2000).

19 6 Uma hipótese para a diferenciação incompleta dos oócitos é a ausência da fase de platô durante o desenvolvimento folicular, devido ao rápido e exponencial crescimento folicular induzido pelo tratamento com FSH. Este platô parece ser necessário para a maturação citoplasmática do oócito (SIRARD et al., 1999). Provavelmente, o maior desafio para aumentar a eficiência da técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som, associada à produção in vitro, é elevar a produção de embriões viáveis por sessão de aspiração. Alcançar 100 % de competência do complexo cumulus-oócito é um desafio árduo, devido à dificuldade de se reproduzir às condições ideais in vitro, contudo, ao se permitir maior tempo de maturação oocitária in vivo (coasting-period), provavelmente, obtenha-se um incremento na taxa de formação de blastocistos, em conseqüência de uma maior competência oocitária. Diante das considerações supracitadas, objetivou-se com a realização deste experimento verificar os efeitos da aplicação de GnRH, associada ao aumento do tempo de maturação in vivo, na taxa de recuperação e no potencial de desenvolvimento de oócitos para produção in vitro de embriões, recuperados por meio de punção folicular guiada por ultra-som, utilizando-se dose reduzida de FSH, bem como avaliar a eficácia do referido protocolo utilizado para a sincronização da onda folicular em novilhas da raça Guzerá. Identificar, ainda, possíveis lesões provocadas pela punção folicular e avaliar a influência do diâmetro folicular no desenvolvimento da competência oocitária.

20 7 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Dinâmica Folicular Ovariana em Zebuínos Como dinâmica folicular ovariana, considera-se o processo contínuo de crescimento e regressão folicular, resultando no desenvolvimento do folículo préovulatório. Em bovinos, o crescimento folicular geralmente é caracterizado pelo desenvolvimento de um ou dois folículos dominantes anovulatórios, antes da maturação do folículo ovulatório. O padrão de crescimento folicular nos bovinos ocorre na forma de ondas, onde normalmente são recrutados em média de 5 a 10 folículos por ovário (KASTELIC, 1994). O eixo hipotálamo-hipófise-gônadas atua sinergicamente controlando a ciclicidade ovariana, onde o GnRH (hormônio liberador de gonadotrofinas) é secretado pelo hipotálamo e este por sua vez, estimula a hipófise a secretar LH e FSH (hormônio luteinizante e hormônio folículo estimulante, respectivamente). Estes hormônios hipofisários promovem o crescimento folicular (produção de estradiol) e posterior ovulação (DOBSON e SMITH, 2000).

21 8 A fase inicial do desenvolvimento folicular denomina-se recrutamento, onde um grupo de folículos começa a crescer sob ação estimulatória do FSH (LUCY et al., 1992). Segundo GINTHER et al. (1989) entre os folículos recrutados, um destaca-se e começa a crescer mais que os outros (seleção), concomitantemente ocorre queda do FSH sérico inibindo o crescimento dos demais folículos (atresia dos folículos subordinados). O folículo selecionado torna-se LH dependente e continua o seu desenvolvimento (SIROIS e FORTUNE, 1988), impedindo o recrutamento de um novo grupo de folículos (dominância). A dominância folicular pode ser morfológica e funcional. Entretanto, nem sempre o maior folículo domina os menores e impede o surgimento de uma nova onda de crescimento folicular (FORTUNE, 1993). Na presença de altas concentrações plasmáticas de progesterona o folículo dominante inicia o processo atrésico, permitindo o reinício de uma nova onda folicular (LUCY et al., 1992). As ondas foliculares aparecem logo após haver um aumento nas concentrações séricas de FSH (GONG et al., 1996). Estudos realizados em Bos taurus taurus e Bos taurus indicus, constataram a possibilidade de existir variações no número de ondas foliculares entre animais de uma mesma raça e em um mesmo animal de um ciclo para o outro (FIGUEIREDO et al., 1997). As causas destas variações não estão totalmente esclarecidas, mas sabe-se que há influência das variações sazonais (BADINGA et al., 1992; BADINGA et al., 1993), fisiológicas (prenhez, lactação, pós-parto) e nutricionais (LUCY et al., 1992). Segundo GAMBINI et al. (1998), o diâmetro máximo dos folículos ovulatórios parece ser maior que dos outros folículos dominantes. Nos animais com três ondas, o segundo folículo dominante é menor que o primeiro, provavelmente porque o segundo folículo dominante nas vacas com três ondas está sob altas concentrações de progesterona durante todo o seu desenvolvimento. Tal fato não ocorre na fase inicial de crescimento do folículo dominante da primeira onda (fase de formação do corpo lúteo), nem na fase final de desenvolvimento do folículo dominante da terceira onda (início da luteólise).

22 9 FIGUEIREDO et al. (1997), evidenciaram o tamanho reduzido do folículo dominante e do corpo lúteo em novilhas Nelore. O diâmetro máximo do folículo dominante observado nesses animais variou de mm e as dimensões máximas encontradas para os corpos lúteos foram em média de aproximadamente 18 mm. PINHEIRO et al. (1998), também constataram que o diâmetro do folículo dominante e do corpo lúteo é significativamente menor na raça Nelore em relação às raças européias. Estes autores observaram ainda que a duração do comportamento de estro e o intervalo entre o estro e a ovulação são menores nos zebuínos do que nas raças européias. Quanto às características das populações de folículos ovarianos, observou-se que os ovários de novilhas Bos taurus indicus apresentam maior número de folículos < 5 mm e menor número de folículos 5 mm, quando comparados aos ovários de novilhas Bos taurus taurus (SEGERSON et al., 1984). GAMA FILHO et al. (2002), acompanharam 24 ciclos estrais em novilhas da raça Guzerá e a dinâmica folicular ovariana caracterizou-se por uma (46%) ou duas ondas (54%) de crescimento folicular. Foi também identificado o diâmetro máximo do folículo dominante, onde as novilhas apresentaram em média folículos pré-ovulatórios de 10 mm de diâmetro Bases Fisiológicas As fêmeas ruminantes domésticas são poliéstricas, apresentando estro em intervalos regulares de vinte e um dias na vaca e dezessete dias na ovelha. Durante o ciclo estral ocorre uma cadeia de eventos que se repetem até o impedimento da luteólise pela gestação. O processo de foliculogênese (crescimento e maturação folicular) tem início com a formação dos folículos durante a vida fetal, ou seja, ao nascimento a bezerra já tem determinado o número de folículos primordiais nas suas gônadas. A maioria desses folículos, durante seu desenvolvimento e crescimento irá tornar-se atrésico, enquanto uma minoria irá completar sua maturação e ovular (WEBB et al., 1982).

23 10 As diversas etapas da folículogênese podem ser divididas de acordo com as características fisiológicas de cada grupo de folículos nas seguintes categorias: folículos primordiais, comprometidos (também denominados de ativados) que recebem a denominação pelo fato de estarem comprometidos com o crescimento e não mais voltarem a quiescência, sensíveis a gonadotrofinas, dependentes de gonadotrofinas e ovulatórios (MORAES et al., 2002). Os folículos primordiais compõem o estoque de folículos formados durante a fase fetal e que vão se desenvolver durante a vida reprodutiva da fêmea. Esses folículos em estado de latência são caracterizados por um oócito na prófase da primeira divisão meiótica, sem zona pelúcida, circundado por algumas células da pré-granulosa e envolvidas pela membrana basal (VAN WEZEL e RODGERS, 1996; WEBB et al., 1999a). Os folículos neste estádio não têm suprimento sanguíneo próprio e, dessa forma, recebem nutrientes por difusão passiva (HIRSCHFIELD, 1991). Os ditos folículos ativados, após reiniciar seu desenvolvimento, estão comprometidos a crescer, resultando em atresia ou ovulação. O mecanismo determinante da passagem do estádio de folículo primordial para o de folículo primário, no qual as células da granulosa crescem e se multiplicam, não é totalmente conhecido, mas acredita-se que ocorra sem a participação de gonadotrofinas. Existem algumas evidências de que fatores de crescimento estão envolvidos no desenvolvimento de folículos primordiais e primários. Recentemente, resultados obtidos em animais de laboratório sugerem que fatores como o KL (Kit Ligand), bfgs (basic fibroblast growth factor), MIS (Mullerian Inhibitin Substance) e NGF (Nerve Growth Factor), participam da regulação do reinício do desenvolvimento de folículos primordiais (DURLINGER et al., 1999; DISSEN et al., 1993; DISSEN et al., 2001; PARROT e SKINNER, 1999; NILSSON et al., 2001). As evidências supracitadas, associadas a resultados anteriores que demonstram a presença de bfgf em oócitos de folículos primários e primordiais de animais de diversas espécies, incluindo a bovina (VAN WEZEL e RODGERS, 1996) solidificam a ação desses fatores de crescimento no início da foliculogênese.

24 11 Provavelmente, a interação de diversos fatores de crescimento seja responsável pelo recrutamento de folículos primordiais até a expressão de mrna para receptor de FSH e conseqüente dependência de gonadotrofinas para continuar seu desenvolvimento. Fatores de crescimento e diferenciação, conhecidos como proteínas morfogenéticas, são expressos em oócitos a partir de folículos primários e são essenciais para continuar o desenvolvimento a partir de folículo secundário (GALLOWAY et al., 2000). Esses estudos demonstram que o desenvolvimento folicular inicial ocorre em decorrência de uma seqüência de diferentes fatores de crescimento específicos para cada estádio da foliculogênese. Os sinais iniciais do reinício do desenvolvimento folicular são a síntese de RNA e proliferação das células da granulosa, seguidas de aumento de diâmetro do oócito Aspectos Hormonais O requerimento de gonadotrofinas para o crescimento folicular, tem sido demonstrado em várias circunstâncias tais como: hipofisectomia (DUFOUR et al., 1979), imunização ativa contra GnRH (McNEILLY e FRASER., 1987) e infusão crônica de agonistas de GnRH (McNEILLY, 1988). Das gonadotrofinas somente o FSH tem sido observado como capaz de estimular o crescimento folicular, enquanto que a presença de LH não é capaz de suportar desenvolvimento de folículos até o estádio pré-ovulatório (CAMPBEL et al., 1991; ADAMS et al., 1992; CAMPBELL et al., 1995). A necessidade aguda de FSH nos folículos dependentes de gonadotrofinas é a característica que distingue os folículos responsivos a gonadotrofinas dos folículos ovulatórios. Essa dependência de FSH também torna essa classe de folículos particularmente susceptível a atresia (SCARAMUZZI et al., 1993). Durante este estádio, os folículos sobreviventes dobram seu diâmetro em aproximadamente quatro dias.

25 12 Esse crescimento rápido em volume é devido quase que exclusivamente à acumulação de fluido folicular, já que a taxa de proliferação celular declina progressivamente após diâmetros maiores (CAHILL e MAULÉON, 1980; TURNBULL et al., 1977). Simultâneo ao declínio da proliferação celular, as células da granulosa e da teca se diferenciam, o que se reflete no aumento de responsividade ao FSH medido pela produção de camp pelas células da granulosa. O camp aumenta duas a dez vezes, enquanto o folículo progride no seu desenvolvimento (HENDERSON et al., 1987). Os folículos estrogênicos também são designados como dominantes pela sua habilidade de resistir a atresia e passar aos estádios finais de maturação (DRIANCOURT, 1994). Esses folículos têm o potencial de se tornarem ovulatórios quando expostos a um ambiente endócrino adequado, especialmente na presença de um padrão pulsátil de LH com alta freqüência. A principal característica dessa classe de folículos a uma maior atividade das proteases específicas para IGFBP-4 (proteína ligante do fator de crescimento semelhante à insulina-4), do que nos subordinados, liberando IGF o que, provavelmente, potencializa ou permite a ação das gonadotrofinas em estimular o crescimento e diferenciação folicular, resultando no estabelecimento da dominância (RIVERA e FORTUNE, 2001; RIVERA et al., 2001). Na fase final de desenvolvimento folicular, após a dominância, é observada a expressão de receptores de LH na camada de células da granulosa (WEBB e ENGLAND, 1982; EVANS e FORTUNE, 1997). O folículo dominante secreta mais de 80 % do estradiol e também é responsável por 55 % da inibina liberada na circulação (CAMPBEL et al., 1991). As mudanças observadas na arquitetura intracelular desses folículos também refletem a alta capacidade de produção de hormônios, já que eles apresentam três vezes mais área de retículo endoplasmático liso, aumento de cinco vezes na área do aparelho de Golgi e o dobro de membranas mitocondriais, quando comparado com folículos antrais pequenos (McNATTY et al., 1992).

26 13 A secreção de FSH, embora controlada por GnRH, parece ser contínua e não agudamente responsiva aos pulsos de GnRH, resultando em um padrão não pulsátil de secreção quando mensurado na circulação periférica (TANEJA et al., 2000). A secreção tônica de FSH está sob controle do feedback negativo de dois hormônios gonadais, estradiol e inibina (MARTIN et al., 1988), que diminuem a transcrição de mrna na hipófise (BISTER e PAQUAY, 1983; MILLER e MILLER, 1996). A secreção de FSH exibe variações cíclicas durante o ciclo estral (CAMPBELL et al., 1991; GINTHER et al., 1995), que estão relacionadas com o desenvolvimento e involução de folículos dominantes (SOUZA e MORAES, 1998). A secreção de LH é imediatamente regulada pela liberação pulsátil de GnRH hipotalâmico na circulação porta, que resulta em um pulso de LH correspondente liberado pela hipófise anterior (CLARKE e CUMMINS, 1982). A regulação da secreção de LH pelo feedback ovariano é devida à ação dos esteróides progesterona e estradiol (MARTIN et al., 1988). A importância de cada hormônio no controle do LH varia de acordo com a fase do ciclo estral (GOODMAN, 1994). Em fêmeas ciclando, durante a fase folicular, na presença de baixas concentrações de progesterona, o estradiol aumenta a frequência dos pulsos de LH e diminui sua amplitude, desencadeando o pico de LH. Na fase luteínica precoce, a progesterona age sinergicamente com o estradiol no controle da freqüência dos pulsos de LH, enquanto que, posteriormente, na fase luteínica média/tardia a progesterona sozinha é capaz de regular a freqüência dos pulsos de LH (ADAMS et al., 1998). Na ovelha, a frequência dos pulsos de LH durante a fase de platô da progesterona consiste em pulsos de baixa freqüência (1 a cada 4-6 horas) e alta amplitude (BAIRD et al., 1976). A secreção de FSH não é afetada pela progesterona (MARTIN et al., 1988; MANN et al., 1992) mas é regulada pelo estradiol e inibina produzidos pelos folículos que maturam (dominantes) durante essa fase do ciclo (ADAMS et al., 1998; SOUZA e MORAES, 1998). Após o pico de LH todos os folículos antrais grandes que não ovularam tornaram-se atrésicos (TURNBULL et al., 1977) e em conseqüência, a secreção de hormônios ovarianos esteróides e protéicos estavam nas mais baixas concentrações observadas durante o ciclo (BAIRD et al., 1981).

27 14 Nos dias iniciais do ciclo estral, as baixas concentrações de estradiol e inibina estão associadas com um rápido aumento nas concentrações de FSH (segundo pico de FSH), que é acompanhado por um aumento nas concentrações de estradiol e inibina, que por sua vez inibe a secreção de FSH (BAIRD et al., 1991). Esse padrão de aumento nas concentrações de FSH, seleção do folículo dominante, atividade do folículo dominante (secreção de estradiol e inibina), inibição da secreção de FSH, regressão do folículo dominante (baixa de estradiol e inibina) e conseqüente aumento da concentração de FSH, ocorre várias vezes durante a fase luteínica, no fenômeno conhecido como ondas de crescimento folicular Estro e Ovulação O estro é um complexo de sinais fisiológicos e comportamentais que precedem a ovulação. A duração do estro varia de doze a vinte e quatro horas na vaca. Os sinais de estro são: imobilidade da fêmea quando montada, vulva edemaciada, mucosa vaginal hiperêmica, descarga de muco vaginal claro e elástico, inserção da cauda arrepiada, inquietude, formação de grupo, lordose e algumas vezes redução do consumo alimentar e na produtividade leiteira. Muitos destes sinais também podem estar presentes no pró-estro, por isso o sintoma da fêmea ficar imóvel quando montada é o mais característico e confiável da ocorrência de estro. Esses sinais são induzidos pela elevada concentração de estradiol na circulação, proveniente do folículo pré-ovulatório, que atua em centros cerebrais (principalmente hipotalâmicos) e medulares. A ação do estradiol é potencializada pela pré-exposição a progesterona, fato esse, que é lógico e não traz maiores conseqüências quando em um ciclo estral normal, mas que tem implicações na indução de estro, notadamente em períodos de anestro (MORAES et al., 2002). O pico de LH, que inicia síncrono com o começo do estro, resulta em dois fenômenos independentes: a luteinização das camadas celulares da parede folicular (granulosa e teca) e ruptura do folículo ovulatório, culminando com a ovulação e a posterior formação do corpo lúteo.

28 15 O processo de luteinização resulta em mudanças estruturais e funcionais. Ocorre ruptura da membrana basal, que no folículo separa a camada da teca da granulosa (avascular), e determina mudanças bioquímicas fazendo que uma estrutura que secreta predominantemente andrógenos (teca) e estrógenos (granulosa) passe a secretar progesterona. A ovulação nos mamíferos é similar ao processo inflamatório e ocorre durante os primeiros estádios da luteinização que é indicado pelo pico de gonadotrofinas originário da hipófise. Embora o processo de luteinização não necessite da ovulação, o processo ovulatório é parte integrante dos estádios iniciais da luteinização. Durante a ovulação, os folículos pré-ovulatórios tornam-se hiperêmicos dentro de poucas horas do pico de gonadotrofinas. Essa hiperemia é mediada por agentes vasoativos tais como histamina, quininas e produtos metabólicos da lipogênese do ácido aracdônico. O aumento da permeabilidade dos capilares da teca leva ao aumento do volume folicular, acompanhado de dissociação dos fibroblastos da teca. Esse afrouxamento do tecido do ápice do folículo, aliado à ação das proteinases (colagenase), leva a formação do estigma ovulatório (EVANS et al., 1997; GINTHER et al., 2000). À medida que o processo ovulatório prossegue, as camadas da granulosa e da teca se rompem e o oócito, então, é liberado para ser captado pelo oviduto por meio da pressão negativa gerada pelos movimentos ciliares Corpo Lúteo Após a luteinização, as estruturas que antes formavam o folículo, sofrem alterações morfológicas, marcadas pela intensa angiogênese, proliferação de células fibroblásticas e hipertrofia das células luteínicas. As células luteínicas não proliferam após a ovulação, portanto a qualidade da função lútea depende do estado do folículo que a originou.

29 16 O corpo lúteo (CL) começa a se organizar em seguida a ovulação, mas nos ruminantes o CL só começa a funcionar após um ou dois dias, com função plena após cinco dias. As variações das concentrações de progesterona durante a fase luteínica refletem os sucessivos estádios de crescimento, manutenção e regressão do CL. A funcionalidade do CL dos ruminantes (medida pela secreção de progesterona) é regulada por LH proveniente da hipófise anterior. Após a ligação de LH ao seu receptor, ocorre a ativação da adenil ciclase e a subseqüente elevação de camp. A presença de camp estimula a esteroidogênese em poucos minutos, facilitando o transporte de colesterol para dentro e do meio intracelular para dentro da mitocôndria, resultando em aceleração da conversão de colesterol em pregnenolona pela ação da enzima clivadora de cadeia lateral. A ação do LH (via camp) é de aumentar a concentração das enzimas esteroidogênicas. A regressão do CL nos ruminantes não pode ser atribuída à queda nos estímulos luteotrópicos (especialmente LH), mas sim a presença de um fator luteolítico, a PGF 2 α. Este hormônio é produzido durante todo o ciclo estral, mas atinge sua concentração máxima no momento da luteólise de cada espécie. Durante esse período, a secreção de PGF 2 α é pulsátil na razão de três a quatro pulsos por dia e está estabelecido que são necessários cerca de cinco pulsos para que ocorra luteólise completa (BOUSQUET et al., 2000). A PGF 2 α é extremamente sensível à oxidação que acontece durante sua passagem pelos pulmões. Dessa forma, a prostaglandina ativa chega aos ovários pelo mecanismo de contra corrente que opera transferindo a prostaglandina da veia uterovariana para a artéria ovariana, evitando a inativação do hormônio. Embora os mecanismos de luteólise e da atuação da PGF 2 α na regressão do CL não estejam totalmente elucidados, há evidências de que a involução estrutural do CL é mediada por apoptose (JUNGEL et al., 1993; RUEDA et al., 1995; RUEDA et al., 1997; McCORMACK et al., 1998; GAYTAN et al., 1998). Foi demonstrado que a caspase-3 (considerado executor primário de apoptose) não está envolvido na inibição da síntese de esteróide durante a luteólise, mas é essencial para que ocorra a regressão normal do CL (CARAMBULA et al., 2001; MAPLETOFT et al., 2000).

30 Sistema IGF Folicular Alguns estudos evidenciam que a síntese de altas concentrações de estradiol é uma característica chave para o folículo dominante (FORTUNE e HANSEL, 1985). Entretanto, análises realizadas em mrnas para receptores de gonadotrofinas e enzimas esteroidogênicas não revelaram mudanças que precedessem um aumento de estradiol folicular (YUAN et al., 1998). Alterações de mrnas para receptores/enzimas parecem ser importantes para a síntese de estradiol associada a dominância morfológica. A hipótese para determinar a aquisição de receptores para LH nas células da granulosa, é primariamente determinada pela seleção para dominância folicular (ZELEZNIK, 2001). A presença dos receptores de LH nas células da teca é essencial para estimular a produção de um andrógeno precursor para a síntese de estradiol pelas células da granulosa (BAO e GARVERICK, 1998; HAMPTON et al., 2004). Algumas revisões evidenciam a participação significativa do sistema IGF na seleção dos folículos dominantes e sua sustentação (ADASHI, 1998; BRIDGES e FORTUNE, 2003), demonstrando o aumento do envolvimento desse sistema como parte critica na determinação da dominância folicular (FISSORE et al., 1996; ARMSTRONG et al., 1998; YUAN et al., 1998). O sistema IGF ovariano é um complexo que consiste de dois ligantes (IGF-I e IGF-II), dois receptores (tipo 1 e 2), seis IGF binding proteins (IGFBP-1,-2,-3,-4,-5, e -6), e uma IGF binding protein protease (ECHERTHNKAMP et al., 1994; SPICER e ECHERTHNKAMP, 1995; LUCY, 2000; MHIM et al., 2000; GIUDICE, 2001; MONGET et al., 2002; MONGET et al., 2003; RIVERA e FORTUNE, 2003a). O sistema IGF é reconhecido pela capacidade de promover a síntese de estradiol em folículos do tipo antral, entretanto, algumas IGF binding proteins, especificamente, as de baixo peso molecular (IGFBP-2, -4, e -5) podem apresentar um efeito negativo na ação das IGFs, devido à ligação com seus receptores (ECHERTHNKAMP et al., 1994; BAKER et al., 1996; ADASHI, 1998; De la SOTA et al., 1996; STEWART et al., 1996; PORETSKY et al., 1999; CONOVER et al., 1999; MAZCRBOURG et al., 2001; MIHM et al., 2004).

31 18 Contudo, as IGFBP proteases específicas (ARMSTRONG et al., 1998) clivam as IGFBPs, permitindo a ação da IGF junto a seus receptores. Mudanças no complexo sistema IGF, potencialmente afetam o desenvolvimento folicular. Estudos têm explorado a relação entre estádios tardios de diferenciação folicular e alterações dos componentes do sistema IGF, e os resultados sugerem o comprometimento na relação existente entre os folículos dominantes ou préovulatórios e os folículos subordinados (SPICER, 2004). Também foi observado, em experimentos in vivo, a associação entre a IGF livre em fluido folicular bovino e o desenvolvimento e a dominância folicular (BEG et al., 2002; RIVERA e FORTUNE, 2003b; GINTHER et al., 2004), demonstrando a correlação positiva entre a concentração intrafolicular de estradiol e a concentração total de IGF (RIVERA e FORTUNE, 2001). A redução na ingestão de alimento na ordem de 25%, ou qualquer outra causa de estresse (FLAMENBAUM et al., 1995; TROUT et al., 1998), compromete o crescimento folicular, causa alterações na secreção de LH e, ainda, queda nas concentrações sanguíneas de IGF-I (LUCY et al., 1992). A redução nas concentrações séricas de IGF-I aumenta a apoptose nas células da granulosa, sendo um dos principais fatores que contribuem para a atresia folícular. RICHARDS (1985), encontrou correlação negativa entre a IGF-I e ambientes com alta temperatura. Quanto maior a temperatura menor a concentração sérica de IGF-I. Existem evidências de que a modulação da atividade ovariana exercida pelo sistema insulina-igf difere entre as subespécies. SIMPSON et al. (1994), registraram maiores concentrações séricas de IGF-I e maior atividade plasmática das proteínas ligantes de IGF (IGFBP) em vacas Brahman do que em vacas Angus. Constatou-se, ainda, que a administração de insulina resultou em aumento nas concentrações de IGF-I no fluido folicular de vacas Brahman. Já em vacas Angus nenhum efeito foi observado, provavelmente, devido ao menor número de receptores para insulina no tecido ovariano dos animais da raça Angus. Os folículos ovarianos são reconhecidos como um importante sítio de ação do IGF-I (WANDJI et al., 1996; WANDJI et al., 1997; YU e ROY, 1999; YANG e FORTUNE, 2002), por expressarem uma quantidade significativa de receptores para esse fator de crescimento (SPICER e ECHTERNKAMP, 1995).