Mutações de resistência aos Inibidores de Protease em pacientes com Hepatite C crônica no Brasil

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1 ARTIGO DE REVISÃO / ARTÍCULO DE REVISIÓN Mutações de resistência aos Inibidores de Protease em pacientes com Hepatite C crônica no Brasil Resistance-associated variants to Hepatitis C virus Protease Inhibitors in naïve DAA patients in Brazil Mário G. Pessôa 1 Daniel F. C. Mazo 1 Isabel M V G de Carvalho 2 Flair José Carrilho 1 Rev Panam Infectol 2014;16(1):57-61 Recebido em 20/12/2013 Aprovado em 7/2/ Departamento de Gastroenterologia, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. 2 Laboratório de Hepatologia Molecular Aplicada, Setor de Hepatites (LHeMA), Disciplina de Gastroenterologia, Departamento de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil. RESUMO A resistência viral aos inibidores de protease aparece rapidamente, pois essas cepas resistentes já existem naturalmente na população de quasispécies do vírus, emergindo como cepas mais prevalentes em relação às cepas selvagens quando o vírus sofre a pressão da droga. Esta seleção de cepas resistentes (RAVs) tem um papel importante na falha terapêutica dessa classe de droga. Análise por sequenciamento direto em pacientes não tratados têm demonstrado diversas RAVs aos inibidores de protease (substituições nas posições V36, T54, V55, Q80, R155, D168 e V170). As mutações nas posições R155K e A156T da região NS3 estão associadas à alta resistência aos inibidores de protease. Dessa forma, os antivirais de ação direta (DAA) não podem ser utilizados em monoterapia. Aparentemente, existe uma diferença geográfica na distribuição dessas variantes de resistência. Nas populações europeia e americana, por exemplo, a variante de resistência na posição Q80K no genótipo 1a, que confere resistência ao simeprevir, foi encontrada em 25% a 35%. No entanto, na população brasileira uma frequência em torno de 1,8% de RAVs na posição Q80K, em três estudos, dois em VHC monoinfectados e outro em co-infectados VHC-HIV. O conhecimento da distribuição dos subgenótipos e do perfil de mutações nas diversas populações em todo o mundo vai se tornar importante na confecção de guidelines regionais, que seguramente terão suas particularidades de acordo com o perfil de cada região, no intuito de atingirmos máxima eficácia dos diferentes esquemas terapêuticos. Palavras chave: HCV; Hepatite C; Hepatite crônica C; Inibidores de proteases; Resistência; Genótipo 57

2 Pessôa MG et al Mutações de resistência aos Inibidores de Protease em pacientes com Hepatite C crônica no Brasil ABSTRACT Viral resistance to protease inhibitors appear quickly because these resistant strains occur naturally in the virus quasispecies population, emerging as the most prevalent strains compared to wild type strains when the virus is under drug pressure. This selection of resistant strains (RAVs) has an important role in therapeutic failure of this class of drug. Analyses by direct sequencing in untreated patients have shown various RAVs to protease inhibitors (substitutions at positions V36, T54, V55, Q80, R155, A156, D168 and V170). Mutations at positions R155K and A156T on NS3 region are associated with high resistance to protease inhibitors. Thus, the direct action antivirals (DAA) may not be used as monotherapy. Apparently, there is a geographical difference in the distribution of these variants of resistance worldwide. In European and American HCV population for example, resistance variants in the position Q80K genotype 1a, which confers resistance to simeprevir was found in 25% to 35% of patients. However, in the Brazilian population the Q80K mutation was found at a frequency of around 1.8%, in three studies, two in HCV monoinfected and another in coinfected HIV-HCV patients. The distribution of this mutation profile in different populations around the world will become important in the preparation of regional guidelines, which surely will have their particularities according to the HCV subtyping distribution and mutation profile of each region in order to achieve maximum effectiveness of different treatment regimens. Keywords: HCV; Hepatitis C; Chronic hepatitis C; Protease inhibitors; Resistance; Genotyping INTRODUÇÃO A Hepatite crônica pelo virus C (VHC) ainda permanece um sério problema de saúde pública mundial, com aproximadamente 3% da população global infectada por este vírus (1). No Brasil, a prevalência de hepatite C foi estimada em 1,5% para todas as idades e 2,5% entre os adultos, sendo projetada para 2021 prevalência global de indivíduos infectados pelo VHC (2-3). Globalmente, o tratamento padrão para pacientes com hepatite crônica C até 2011 era baseado na combinação de interferon alfa peguilado (PegIFNa) e ribavirina (RBV), administrados por 48 semanas (para os genótipos 1,4,5 e 6) ou por 24 semanas (para os genótipos 2 e 3) (4). Este tratamento oferecia uma chance de resposta virológica sustentada (RVS) de aproximadamente 40% - 50% em pacientes infectados pelo genótipo 1 e entre 60% e 80% em pacientes infectados pelos genótipos 2 e 3 (5-6). Na vida real, onde os pacientes normalmente não são selecionados para tratamento baseados em critérios de inclusão tão restritos, esses índices de RVS costumam ser mais baixos. O VHC é classificado em sete diferentes genótipos e vários subtipos, devido à sua diversidade genética (7). A proteína polimerase dependente de RNA (NS5B), responsável pela replicação do genoma viral, a proteína serina-protease (NS3), com atividades de helicase de RNA e protease e a NS5A são os alvos mais promissores para os denominados antivirais de ação direta (DAA) (8). Estas novas drogas com alvo de ação nos sítios de replicação do VHC vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos, e pelo menos duas delas já estão sendo utilizadas em nosso país, pertencendo à classe dos inibidores de protease lineares da região NS3, o telaprevir e o boceprevir (9-13), com ação apenas no genótipo 1. Esses últimos elevaram a chance de RVS em aproximadamente 30% em relação ao tratamento padrão, porém com um perfil de segurança não ideal, principalmente nos pacientes com fibrose mais avançada, exatamente a população contemplada em nosso meio pela portaria do Ministério da Saúde (14-15). Mais recentemente, foi aprovado também nos Estados Unidos um Inibidor de protease macrocíclico, o simeprevir, e um inibidor nucleosídeo da RNA polimerase da região NS5B, o sofosbuvir (16-17). Outras drogas que têm como alvo outros sítios de replicação, como por exemplo a região NS5A, encontram-se em fase III de desenvolvimento (18). Os inibidores de protease, além de serem genótipos específicos, têm também diferentes resultados de acordo com os subtipos, sendo que os pacientes 1b respondem melhor que os portadores do subtipo 1a, por uma questão de barreira genética. Barreira genética é o limiar de probabilidade que um vírus tem de sofrer mutação ou escapar da ação seletiva de uma droga. Pode ser definida também como o número de mutações necessárias para o desenvolvimento de resistência primária à droga antiviral (19). Enquanto o subtipo 1b necessita de dois pontos de mutação para se tornar resistente ao inibidor de protease, o subtipo 1a necessita apenas de um ponto de mutação (20). A resistência viral aos inibidores de protease aparece rapidamente (<15 dias) 21-22), pois essas cepas resistentes já existem naturalmente na população de quasispécies do vírus, emergindo como cepas mais prevalentes em relação às cepas selvagens quando o vírus sofre a pressão da droga. Esta seleção de cepas resistentes, da sigla em inglês RAVs (resistant-associated variants), tem um papel importante na falha terapêutica dessa classe de droga (23). Análise por sequenciamento direto em pacientes não tratados tem demonstrado como pré-existentes, em frequência variada, diversas RAVs aos inibidores de protease (substituições nas posições V36, T54, V55, Q80, R155, 58

3 D168 e V170). As mutações nas posições R155K e A156T da região NS3 estão associadas à alta resistência aos inibidores de protease (24). Dessa forma, os DAAs não podem ser utilizados em monoterapia. Estudos de seguimento de longo prazo de até cinco anos estão disponíveis para os pacientes dos estudos de fase I que receberam telaprevir ou boceprevir. Usando análise clonal ou de deep sequence, mutações no gene da protease NS3 causando resistência foram encontradas somente em um pequeno numero de pacientes e naqueles com RAVs detectadas, a frequência dentro das quasiespecies do VHC foram geralmente baixas (<5%) (25-26). Estudos de seguimento de longo prazo geralmente mostram um declínio na frequência de RAVs com o tempo após a exposição a diferentes durações de tratamento com inibidores de protease NS3 (27). Isto decorre do fato do VHC ser um vírus RNA de fita única que, diferente do vírus da hepatite B ou HIV, não tem a capacidade de arquivar essas mutações (28). Uma vez que variantes conferindo resistência a um inibidor de protease NS3 são selecionadas e podem resistir na presença da droga, mutações adicionais são selecionadas para aumentar a eficiência de replicação da variante (fitness viral), que geralmente é significantemente comprometida. Desta forma, a parada do inibidor de protease em pacientes com replicação viral ativa é importante para evitar a seleção de variantes de resistência com fitness viral aumentado (27). As regras de parada com o uso do telaprevir e boceprevir devem ser seguidas. Trabalho realizado com o banco de dados Los Alamos, pelo Instituto Butantan em São Paulo, analisou sequências de protease NS3 com o objetivo de caracterizar as mudanças de aminoácidos nas posições anteriormente associadas com a resistência aos inibidores de protease de pacientes com infecção crônica pelo VHC, virgens de tratamento com DAAs, portadores de genótipos 1a, 1b e 3a (29). Sequências de genótipo 3a mostraram baixo nível de mutação de resistência na posição V36L. Sequências de genótipos 1 apresentaram mutações nas posições 36, 39, 41, 43, 54, 80, 109, 155 e 168 em uma frequência inferior a 2%, exceto para o Q80R, mutação encontrada em 35% do genótipo 1. Esta última mutação, encontrada em alta frequência na população americana, está associada à resistência ao simeprevir, o que levou o FDA a sugerir a realização da pesquisa dessa mutação previamente à utilização desta droga nos Estados Unidos. VARIANTES DE RESISTÊNCIA AOS INIBIDORES DE PROTEASE NS3/4A DURANTE O TRATAMENTO Telaprevir As RAVs foram identificadas primeiramente na posição A156 do domínio catalítico da protease NS3/4A nas análises in vitro (30). Três outras posições foram identificadas, V36, T54 e R155, com mutações únicas ou duplas, sendo a maioria com nível de resistência médio ou baixo pela análise fenotípica (V36, T54, R155, A156S). Variantes com altos níveis de resistência também foram descritas (A156V/T e V36A/M + A156V/T). Nos estudos de fase III, 74% dos pacientes não respondendo à terapia tripla com telaprevir tinham RAVs detectadas no momento da falha terapêutica (31). Boceprevir: RAVs foram detectadas nas posições V36, T54, R155, A156 e V170 in vitro (32). In vivo outras mutações nas posições Q41, F43, V55 e V158 foram descritas. Dos pacientes sequenciados que falharam ao tratamento, 53% tinham RAVs detectáveis (33). Assim como com o telaprevir, a frequência de RAVs foi mais comum em pacientes com genótipo 1a. RESISTÊNCIA AOS INIBIDORES DE PROTEASE NO BRASIL Em um estudo realizado em pacientes com infecção crônica pelo vírus C do Ambulatório de Hepatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, virgens de tratamento com inibidores de protease, apresentado no Congresso Brasileiro de Hepatologia em 2013, foi investigada a presença de RAVs em 171 pacientes com genótipo 1, 54 com subtipo 1a e 117 com subtipo 1b (34). No genótipo 1a foram encontrados RAVs em 7,4% dos pacientes nas posições V36L, T54S, Q80K e R115K. No genótipo 1b variantes resistentes foram encontradas em 5,1% (6 de 117) dos pacientes nas posições V36L, Q41R, T54S e D168S. Em estudo conduzido por Peres-da-Silva e colaboradores (2010) analisando 114 pacientes com hepatite crônica C virgens de tratamento com inibidores de protease, os autores puderam avaliar sequências de aminoácidos do VHC de 48, 53 e 13 isolados dos subtipos 1a, 1b e 3a, respectivamente (35). A substituição V36L foi observada em três pacientes com subtipo 1b e substituição T54S em dois subtipos 1a. As mutações R155K/T/Q/I/M/G/L/S, A156S/T/V/I e D168A/V/E associadas com níveis moderados a elevados de resistência a drogas aos principais novos inibidores de protease não foram observadas na amostra analisada. A substituição V170I esteve presente em 46 dos 48 isolados do subtipo 1a, em 19 dos 53 de subtipo 1b e em todos os isolados de subtipo 3a. Hoffmann e colaboradores (2013) analisaram em 68 pacientes com hepatite crônica C genótipo 1 a presença de mutações de resistência aos inibidores de protease NS3 antes, durante e após tratamento com PegIFNa e RBV (36). Desta casuística, 4,4% apre- 59

4 Pessôa MG et al Mutações de resistência aos Inibidores de Protease em pacientes com Hepatite C crônica no Brasil sentavam conhecidas mutações de resistência ao telaprevir e boceprevir: V36L, T54S e V55A. A mutação T54S foi detectada no sétimo dia de tratamento em um paciente com RVS. Já em um paciente recidivante, as mutações V36L e V55A foram detectadas antes, durante e após o tratamento (exceto no período de negativação viral durante o tratamento). Por outro lado, a mutação T54S esteve presente em todos os momentos de avaliação de um paciente não respondedor. Zeminian e colaboradores (2013) encontraram em 37 pacientes com VHC genótipo 1a sem tratamento prévio com inibidores de protease a presença de mutações de resistência em 18,9% da amostra (sete pacientes) (37). Mutações T54A, T54S, V55A e R155K foram detectadas em 2,7% dos casos e a mutação A156T em 5,4% da população estudada. Nishiya e colaboradores (2014) realizaram estudo de doadores de sangue no Brasil para avaliar a existência de RAVs aos inibidores de protease e sua associação com dados demográficos e fatores de risco envolvidos na disseminação do VHC (38). Foi realizada a amplificação e sequenciamento da região codificadora da protease viral NS3 em 50 amostras VHC genótipo 1a e 75 de genótipo 1b. A frequência de RAVs foi de 10,4% para boceprevir, 11,2% para telaprevir, 6,4% para simeprevir e 12,8% para todos os três inibidores de protease. As mutações foram encontradas em maior frequência nos indivíduos com genótipo 1a (20%) em relação ao genótipo 1b (8%). A mutação mais prevalente, R155K, foi encontrada em 4% de todas as sequências ou em 10% das sequências de subtipo 1a. A resistência a drogas não teve associação com dados demográficos ou fatores de risco de contágio ao VHC. Aparentemente, existe uma diferença geográfica na distribuição dessas variantes de resistência. A população brasileira apresentou uma frequência em torno de 1,8% de RAVs na posição Q80K, em três estudos, dois em VHC monoinfectados e outro em co-infectados VHC-HIV (34,39-40). No entanto, na população europeia e americana, esta variante de resistência na posição Q80K no genótipo 1a, que confere resistência ao simeprevir, foi encontrada em 25% a 35% (41). Se a realização da pesquisa de mutações de resistência vai se tornar uma rotina na prática clínica, antes da utilização de antivirais de ação direta, ainda não está definido. No entanto, o conhecimento da distribuição deste perfil de mutações nas diversas populações em todo o mundo vai se tornar importante na confecção de guidelines regionais, que seguramente terão suas particularidades a partir do perfil de cada região, no intuito de atingirmos máxima eficácia dos diferentes esquemas terapêuticos. REFERÊNCIAS 1. Pybus OG, Charleston MA, Gupta S, Rambaut A, Holmes EC, Harvey PH. The epidemic behavior of the hepatitis C virus. 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