UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO NA PRODUÇÃO DE PROBIÓTICO

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1 UTILIZAÇÃO DO SORO DE QUEIJO NA PRODUÇÃO DE PROBIÓTICO 1 Elizângela Maia e Sá, Paula Rúbia Ferreira Rosa, 3 Ubirajara Coutinho Filho, 3 Vicelma Luiz Cardoso 1 Bolsista de Programa de Ensino (PIBEG/UFU), discente do curso de Graduação em Engenharia Química Bolsista de Pós-Graduação (FAPEMIG/UFU),discente do curso de Pós-Graduação em Engenharia Química 3 Professor da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG 1,,3 Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 11, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP vicelma@ufu.br RESUMO - O presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência conjunta das variáveis concentração de lactose, ph e concentração de inoculo, na fermentação de soro de queijo. A cultura utilizada consistiu de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, micro-organismos geralmente utilizados na produção de queijos, iogurte e outros. A otimização das variáveis foi realizada aplicando um planejamento composto central. Os experimentos foram realizados em frascos de vidro do tipo penicilina com 5 ml de volume, em mesa agitadora (1 rpm) e temperatura ambiente (8 ± 3 o C). Nos testes preliminares utilizouse soro in natura e no planejamento soro em pó. Os resultados dos testes preliminares mostraram que o melhor tempo de processo foi de 36 horas. Utilizando a técnica de superfície de resposta foi possível otimizar, dentro das faixas estudadas, as variáveis: concentração de lactose (35,8 g/l), de inóculo (1,3 g/l) e o ph (6,) obtendo como resposta a concentração celular de 1,1 ± 1, 1 1 NMP/mL. Palavras-Chave: fermentação láctea, soro de queijo, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus. INTRODUÇÃO No processamento do leite para a fabricação de certos derivados, como o queijo e caseínatos, um dos principais rejeitos líquidos é o soro lácteo que possui alta taxa de matéria orgânica e geram uma carga altamente poluente. Este subproduto é uma matéria prima rica e nobre do ponto de vista nutricional, com alto teor de proteínas e vitaminas. Produtos tais como soro em pó, proteína do soro, queijo, lactose, ácido láctico, álcool, vinagre, probióticos e alimentos especiais (concentrado protéico, bebidas etc.) podem ser obtidos do soro de queijo (Ribeiro, ). Os probióticos constituem micro-organismos vivos que ao serem agregados como componentes da dieta exercem ação benéfica na flora intestinal microbiana tanto em animais como em humanos (Gueimonde et al., 6). No caso de animais esta ação benéfica pode ser definida como ganho de peso, melhora na resistência a doenças e auxílio na recuperação de infecções microbianas (Balcázar et al., 6) e para humanos ela está associada a melhora de gastroenterites resistentes, melhora do quadro a intolerância à lactose, estimulação do sistema imune, redução do colesterol sérico, prevenção da formação de câncer e substâncias carcinogênicas no intestino (Collins e Gibson, 1999). Segundo a legislação brasileira vigente para alimentação humana (Anvisa, 8) os microorganismos utilizados no presente trabalho foram retirados da classificação de micro-organismos probióticos, mas esta mudança é controversa (Hauly et al., 5) e o termo probiótico tem uma extensão maior que o uso exclusivo para alimentação humana (Balcazar et al., 6). O objetivo deste estudo foi otimizar as variáveis concentração de lactose, ph e concentração de micro-organismos, visando uma maior produção de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, aplicando a técnica de superfície de resposta através de planejamento composto central, empregando bioreator tipo frasco de penicilina com 5 ml. Cultura MATERIAIS E MÉTODOS Os micro-organismos foram adquiridos a partir de um produto comercial da marca Rich, utilizado para a produção de iogurte natural, tendo como ingredientes culturas superconcentradas de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus. VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 7 a 3 de julho de 9 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 Meio de Cultura Foi utilizado o meio de cultura seletivo para Lactobacillus conhecido como meio MRS, cuja composição em g/l foi a seguinte: peptona de caseína 1, extrato de carne 1, extrato de levedura 5, glicose, tween 8 1, K HPO 4, acetato de sódio 5, citrato de amônia, MgSO 4.7H O, e MnSO 4.H O,5. Teste Preliminar No teste preliminar foi realizado empregando soro de queijo in natura produzido na fabricação do queijo tipo mussarela fornecido pela Cooperativa Agropecuária Ltda de Uberlândia (CALU). Neste soro foram feitas análises de ph e da concentração de lactose. O teste preliminar consistiu na determinação da concentração de proteína, de lactose e do crescimento celular em função do tempo, com a finalidade de avaliar o melhor tempo a ser adotado no planejamento de experimento. Após a amostragem do soro para as análises mencionadas anteriormente, foram realizadas fermentações em biorreator do tipo frasco de penicilina com volume total de 5 ml, com 4 ml de soro e,6 ±,5 g/l de inoculo, o que correspondia a um volume de 4 ml de inoculo para 4 ml de volume total de meio para fermentação no frasco de penicilina. As fermentações foram conduzidas em escala de bancada em incubadora rotativa com movimentos orbitais a temperatura ambiente de 8 ± 3 o C e 1 rpm. Análises de concentração de lactose e de micro-organismos eram feitas a cada 1 h durante 3 dias. Planejamento Experimental Foi realizado um planejamento fatorial do tipo composto central (PCC) a dois níveis com três variáveis, acrescido de três réplicas no ponto central e ainda 6 experimentos nos pontos axiais, utilizando o α de ortogonalidade de 1,35, totalizando 17 experimentos Os experimentos foram realizados com o objetivo de verificar a influência conjunta das três variáveis (concentração de lactose, de micro-organismo e ph) na resposta crescimento de micro-organismos viáveis. O PCC foi realizado nas mesmas condições do teste preliminar, utilizando o soro em pó, gentilmente cedido pela empresa Cargill de Uberlândia. Os valores fixados no PCC para essas variáveis foram baseados nos resultados obtidos no teste preliminar. Para a quantificação de células viáveis foi utilizado o método do número mais provável (NMP) com três tubos com meio de cultura MRS em frascos de penicilina de 1 ml (Bradbury, 1984). Devido a precipitação das proteínas do soro de queijo a baixo valores de ph, para a determinação da biomassa, na concentração em g/l, foi realizado o seguinte procedimento: o meio de cultivo inicial sem micro-organismos foi autoclavado (113 ± 1 o C por 1 minutos), o ph foi ajustado para o valor médio obtido no final das fermentações e a quantidade de proteína precipitada foi determinada após centrifugação a 189 g por 15 minutos e secagem a 43 ± o C até massa constante (Tari et al., 9). A concentração de micro-organismos era determinada subtraindo o valor de massa seca obtida no início e no final da fermentação e o valor do precipitado protéico determinado conforme descrito anteriormente. RESULTADOS E DISCUSSÕES Teste Preliminar As análises do soro in natura mostraram que a concentração de lactose era de 36 ± 1 g/l, a de proteína de,9 ±, g/l e o ph de 6,5 ±,. A Figura 1 ilustra as variações de concentrações de lactose, proteína e micro-organismo ao longo do tempo. Observa-se que a partir de 48 h não houve um crescimento de micro-organismo e nem consumo significativo de lactose. Assim, adotou-se como tempo de fermentação para os próximos ensaios 48 h. Vale ressaltar que todos os experimentos foram realizados em duplicata. Concentração de Proteína e de celula (g/l) Conc. Proteína Conc. Lactose Conc. celular Tempo (h) Figura 1 - Concentração de lactose, de proteína e crescimento microbiano em função do tempo Concentração de Lactose (g/l) Métodos Analíticos As análises de lactose foram realizadas por espectrofotometria seguindo o método DNS (Miller, 1959).

3 Planejamento Experimental A Tabela 1 mostra a matriz planejamento, onde as variáveis estudadas foram: concentração de lactose (X 1, g/l), ph (X ) e concentração de inóculo (X 3, g/l), e a variável resposta foi o crescimento celular em número mais provável (NMP/mL). Tabela 1 - Resultados de crescimento celular em diferentes condições experimentais de acordo com a matriz do planejamento composto central. Exp X 1 (g/l) X X 3 (g/l) NMP/mL 1-1 () -1 (5) -1 (,5) 9,5 ±, () -1 (5) +1 (1,5) 3, ±, () +1 (8) -1 (,5),1 ±, () +1 (8) +1 (1,5) 1,3 ± 3, (4) -1 (5) -1 (,5) 9, ± 1, (4) -1 (5) +1 (1,) 7,6 ± 1, (4) +1 (8) -1 (,5) 6, ± 1, (4) +1 (8) +1 (1,5) 1,4 ± 1, α (16,4) (6,5) (1,) 3, ± 1, α (43,531) (6,5) (1,) 9,3 ±, (3) -α (4,4) (1,) 3, ±, (3) +α (8,5) (1,) 9,7 ±, (3) (6,5) -α (,3) 5, ±, (3) (6,5) +α (1,7) 9,8 ± 1, (3) (6,5) (1,) 9,7 ± 1, (3) (6,5) (1,) 1, ± 1, (3) (6,5) (1,) 9,6 ± 1,1.1 9 Observa-se na Tabela 1, que os resultados de crescimento celular variaram entre 8,1 1 7 NMP/mL (ensaio 3) a 3,5 1 1 NMP/mL (ensaio 16). Verifica-se também, que os melhores resultados, de todas as respostas avaliadas, foram obtidos nos experimentos localizados no ponto central (experimentos 15, 16 e 17). A partir dos resultados obtidos para o crescimento celular, efetuou-se uma regressão múltipla, tendo como fatores os termos isolados, as interações e os termos quadráticos. Após a realização da regressão no software Statistica 7, obteve-se a Equação 1. M = 9, , X 1,3.1 9 X 1 4, X - 4, X + 1, X 3,6.1 9 X 3-8, X 1 X + 9, X 1 X 3-6, X X 3 (1) O coeficiente de determinação (R ) foi de 87%, indica um ajuste adequado dos dados experimentais em relação ao crescimento de micro-organismo, mostrando que 87% da variabilidade dos dados foram explicadas pela equação empírica. Nesta regressão foram eliminados os parâmetros com nível de significância do teste t-student superiores a 1%, sendo as variáveis relacionadas a estes consideradas não relevantes. A Equação representa a forma reduzida do modelo completo, com R de 81%. M = 9, , X 1,3.1 9 X 1-4, X + 1, X 3,6.1 9 X 3 (1) Como forma de ilustrar a influência das variáveis na concentração de micro-organismo, apresenta-se nas Figuras e 3 as curvas de contorno das variáveis concentração de lactose, inóculo e ph em relação à resposta estudada. A partir da Equação 1 foi feita a implementação de um algoritmo no software Maple 9.5 para calcular o ponto ótimo, visando maximizar a concentração de micro-organismo em função das variáveis estudadas. Os valores reais das variáveis no ponto de maximização foram: concentração de lactose de 35,8 g/l, ph 6, e concentração de inóculo de 1,3 g/l. A partir dos valores codificados das variáveis X 1, X e X 3 no ponto de máximo determinou-se pela Equação, que o crescimento celular teórico neste ponto foi de 1, 1 1 NMP/mL. Analisando as curvas de contorno (Figuras, 3 e 4), verifica-se, que as regiões de otimização, apresentam as seguintes faixas de concentrações de lactose 3 a 4 g/l, inóculo de 1, a 1,4 g/l e ph de 4, a 6,5.

4 ph 9, 8,5 8, 7,5 7, 6,5 6, 5,5 5, 4,5 4, lactose(g/l) Figura - Curva de contorno da variável ph em função da concentração de lactose. inóculo (g/l) 1,8 1,6 1,4 1, 1,,8,6,4, 4, 4,5 5, 5,5 6, 6,5 7, 7,5 8, 8,5 9, Figura 3 - Curva de contorno da variável concentração de inóculo em função do ph. inóculo (g/l) 1,8 1,6 1,4 1, 1,,8,6,4 ph, lactose(g/l) Figura 4 - Curva de contorno da variável inóculo em função da concentração de lactose. Estudo da Reprodutibilidade Visando avaliar a reprodutibilidade dos resultados obtidos no PCC foram realizados experimentos na condição otimizada aplicando o 8E9 E9 -E9 8E9 E9 -E9 E9 -E E9 algoritmo do software Maple (X 1 = 35,8 g/l, X = 6, e X 3 = 1,3 g/l), obtendo como resposta 1,1 ± 1, 1 1 NMP/mL. Como as variáveis concentração de inoculo e ph são de baixo custo e visando avaliar o crescimento celular em menor concentração de lactose, dentro da região de otimização, sem prejudicar o crescimento celular foi realizado também um experimento na concentração de lactose de 3 g/l, inóculo de 1,3 g/l e ph de 6, obtendo 1,1 ±,3 1 9 NMP/mL. Outro ponto avaliado foi na concentração de lactose de 33 g/l, inoculo 1,3 g/l e ph 6,. Este ponto é interessante porque análises de concentração de lactose e medidas de ph no soro de queijo mussarela in natura apresentaram valores próximos a este, o resultado foi de 1,7 ± 1,6 1 1 NMP/mL. Verifica-se que dentro da região de otimização os valores obtidos para a concentração micro-organismos foram da ordem de 1 1 NMP/mL e no ponto em que a concentração de lactose foi de 3 g/l a concentração da biomassa em massa seca foi de 5 g/l. Os valores obtido foram superiores aos encontrados por Tari et al. (9) que obteve valores de 4,35 g/l na temperatura de 35 o C. Coutinho Filho et al. (7) avaliando a concentração de célula em um produto probiótico comercial obteve 1 1 células/g. CONCLUSÃO Os testes preliminares mostraram que o melhor tempo de processo foi de 48 horas. Utilizando a superfície de resposta foi possível determinar a região de otimização das variáveis estudadas. Os testes de reprodutibilidade mostraram que para a concentração de lactose entre 3 a 35,8 g/l, concentração de inoculo de 1,3 g/l e ph 6, a concentração de micro-organismos foi da ordem de 1 1 NMP/mL. A utilização de soro de queijo para produção de Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp e Streptococcus thermophilus, mostrou-se bastante promissora. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANVISA, 8. Alimentos com alegações de propriedades funcionais e ou de saúde, novos alimentos/ingredientes, substâncias brotativas e probióticos. alimentos/comissões/tecno-lista-alega.html, acessado em julho de 8. BALCÁZAR, J.L., BLAS, I., RUIZ-ZARZUELA, I., CUNNINGHAM, D., VENDRELL, D., MÚZQUIZ, J.L., 6. The role of probiotics in aquaculture, Veterinary Microbiology, 114 (3-4), BRADBURY, J.F., Genus Xanthomonas. In: Krieng, N.R., Holt, J.G. (Ed.), Bergey S

5 Manual of Systematic bacteriology, v. 1, Williams & Wilkins, London. COLLINS, M.D., GIBSON, G.R., Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut, American Journal of Clinical Nutrition, 69 (5), 15S-157S. COUTINHO FILHO, U., SANTOS, A.B., CARDOSO, V.L., 7. Estudo da desativação térmica de simbiótico de uso veterinário. Anais do XVI Simpósio Nacional de Bioprocessos - Sinaferm 7, Curitiba. GUEIMONDE, M., JALONEN, L., HE, F., HIRAMATSU, M., SALMINEN, S., 6. Adhesion and competitive inhibition and displacement of humanenteropathogens by selected lactobacilli, Food Research International, 39 (4), HAULY, M.C.O., FUCUS, R.H.B., FERREIRA, S.H.P., 5. Suplementação de iogurte de soja com frutooligossacarídeos: características probióticas e aceitabilidade, Revista de Nutrição, 18 (5), MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Analytical Chemistry, 31 (3), RIBEIRO, H.S.,. Obtenção e aplicação de concentrados protéicos de soro de leite bovino em produtos cárneos. Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP, Campinas SP. (Tese de doutorado). TARI, C., USTOK, F.I., HARSA, S., 9. Optimization of the associative growth of novel yoghurt cultures in the production of biomass, β-galactosidase and lactic acid using response surface methodology, Internacional Dairy Journal, 19 (4), AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro da FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais), do CNPq e da CAPES Brasil.