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1 (11) (21) PI A (22) Data de Depósito: 29/10/2004 (43) Data de Publicação: 26/12/2006 República Federativa do Brasil (RPI 1877) Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial (51) Int. C1 7.: A61 K 39/04 A61 P 37/04 (54) Título: AGENTE IMUNOTERÁPICO ÚTIL PARA O (57) Resumo: "AGENTE IMUNOTERÁPICO ÚTIL PARA O TRATAMENTO COMBINADO DE TUBERCULOSE EM ASSOCIAÇÃO COM OUTRAS TRATAMENTO COMBINADO DE TUBERCULOSE EM DROGAS". Refere-se a presente invenção a um agente imunoterápico ASSOCIAÇÃO COM OUTRAS DROGAS baseado em fragmentos das paredes celulares de linhagens virulentas de Mycobacterium tuberculosis, a um método para a obtenção deste agente (30) Prioridade Unionista: 31/10/2003 ES P imunoterápico, às formulações farmacêuticas que o contém e a sua utilização para a preparação de uma droga para o tratamento combinado (71) Depositante(s): Archivel Farma, S.L. (ES) de tuberculose em associação com outras drogas. (72) Inventor(es): Pere Joan Cardona Iglesias (74) Procurador: Brasil Sul Marcas e Patentes S/C Ltda (86) Pedido Internacional: PCT ES2004/ de 29/10/2004 (87) Publicação Internacional: WO 2005/ de 12/05/2005

2 116,,,,,,.., o,,,,. o.,,, "AGENTE IMUNOTERÁPICO ÚTIL PARA O TRATAMENTO COMBINADO DE TUBERCULOSE EM ASSOCIAÇÃO COM OUTRAS DROGAS" Campo da técnica Refere-se a presente invenção a um método para a preparação de um 5 agente imunoterápico útil para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas. Este se baseia em fragmentos da parede celular de uma linhagem virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis, e no agente imunoterápico obtido através do método mencionado acima. Background da invenção 10 A tuberculose é uma doença crônica infecciosa causada pelos bacilos do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), que inclui atualmente as espécies a seguir: M. tuberculosis, Mbovis, Mmicroti e Mafricanum. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), há novos casos de tuberculose e aproximadamente pessoas 15 morrem todos os anos. Acredita-se que o número de pessoas infectadas no mundo seja de A vacina atualmente utilizada como tratamento preventivo contra a tuberculose está baseada em bactérias da chamada linhagem BCG (bacilo de Calmette-Guérin), uma variação de Mbovis. 20 Por um lado, de acordo com a WO-A , esta é a melhor vacina atualmente disponível para induzir a imunoproteção contra a tuberculose. Contudo, a segurança e a eficácia desta vacina em seres humanos permanece controversa em alguns países porque não protege completamente os adultos contra a tuberculose pulmonar. 25 Por outro lado, WO-A descreve como fato conhecido que o tratamento mais eficaz para lutar contra a tuberculose em indivíduos infectados, tanto aqueles que já desenvolveram como aqueles que não desenvolveram a doença, consiste na administração de diversas drogas, incluindo a isoniazida, por um período de vários meses. 30 Este tratamento prolongado pode induzir o desenvolvimento de

3 2/16 microorganismos resistentes a estas drogas quando o tratamento não é concluído e, além do mais, as drogas mencionadas acima atuam somente quando o bacilo possui um metabolismo ativo (isto é quando está crescendo). mas não quando apresenta um metabolismo não ativo. Este representa um inconveniente significativo porque 5 durante a tuberculose, os bacilos que provocam a infecção coexistem tanto na fase de metabolismo ativo quanto na fase de metabolismo não ativo. Uma das possibilidades para solucionar estes problemas, como descrito na patente US , consiste na utilização de um agente imunoterápico baseado em células mortas de M.vaccae como um adjuvante no tratamento da 10 tuberculose juntamente com a administração de outras drogas, tais como rifampicina e isoniazida. Entretanto, a patente US afirma que tal agente adjuvante não foi utilizado na vacinação de larga escala em seres humanos contra a tuberculose, e há poucas informações sobre a sua eficácia. 15 Conseqüentemente, há a necessidade de um agente imunoterápico para o tratamento de tuberculose que atue como um coadjuvante para estas drogas, e este agente não deve induzir o desenvolvimento de microorganismos resistentes e também gerar uma resposta imunológica mesmo contra os bacilos que se encontrem em uma fase não ativa. 20 Os autores da presente invenção descobriram um método que permite a preparação de um novo agente imunoterápico útil para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas. Este agente imunoterápico contém fragmentos da parede celular de uma linhagem virulenta de MTB-C que podem aumentar a eficácia das drogas associadas para gerar uma resposta 25 imunológica eficaz contra os bacilos que não estão em um metabolismo ativo, reduzindo desta maneira o risco de resistência. Objetivo da invenção O objetivo da presente invenção é proporcionar um método para a obtenção de um agente imunoterápico que contém fragmentos da parede celular de 30 uma linhagem virulenta de MTB-C, útil para o tratamento combinado de

4 3/16 e e o e. - e e e e e. tuberculose em associação com outras drogas. O agente imunoterápico obtido por meio do método anterior e a utilização deste agente para a preparação de uma droga para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas também está incluído 5 no objetivo da presente invenção. Além disso, um outro objetivo da presente invenção consiste nos compostos farmacêuticos preparados com este agente imunoterápico. Descrição detalhada da invenção Os autores da presente invenção descobriram um método para a 10 obtenção de um agente imunoterápico que contém fragmentos da parede celular de uma linhagem virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C). Este método é caracterizado por incluir as etapas a seguir: - Cultura da linhagem virulenta de MTB-C durante um período de tempo de três semanas ou mais, e 15 - Homogeneização da cultura celular em um composto tensoativo aniônico. A linhagem virulenta pode ser qualquer linhagem virulenta de MTB- C, já que o bacilo da tuberculose é bastante estável e nenhuma mutação foi descrita em compostos imunogênicos. Uma das linhagens mais freqüentemente utilizadas 20 pelos pesquisadores neste campo, e considerada como a linhagem de referência, é a chamada linhagem H37Rv que pode ser livremente obtida, por exemplo, da National Collection of Type Cultures (NCTC), em Londres, Inglaterra (número de depósito NC007416). Através da inoculação, a linhagem virulenta pode ser colocada em um 25 meio de cultura bem conhecido por um especialista neste setor. Este pode ser um meio sólido, como o tipo Agar 7H10 ou 7H11 de Middlebrook, ou um meio líquido, como o meio de cultura de Sauton ou de Proskauer-Beck. Com relação à presente invenção, a cultura deve ser realizada por um período de tempo de três semanas ou mais, preferivelmente entre 3 e 4 semanas. A 30 temperatura da cultura é mantida, de preferência, entre 34 C e 38 C.

5 4/ Depois da conclusão da cultura, se esta tiver sido conduzida em uma fase sólida, as placas são raspadas para a obtenção das colônias enquanto evita-se a extração do meio (ágar). Todavia, se a cultura foi conduzida em uma fase líquida. as células são concentradas e lavadas utilizando-se técnicas convencionais 5 conhecidas por um especialista neste setor (por exemplo, a centrifugação). A homogeneização das linhagens é realizada em meio tamponado com um ph neutro. Na presente invenção, é importante que a homogeneização seja conduzida na presença de um composto tensoativo aniônico que facilite a obtenção de partículas de parede celular finamente divididas e frações lipídicas parcialmente 10 emulsionadas. Através deste método de homogeneização, as células de MTB-C se rompem e pequenos fragmentos de parede celular são obtidos. A homogeneização pode ser realizada utilizando-se a sonicação por ultra-som, ou pequenas esferas com um diâmetro aproximado de 1 mm (por 15 exemplo, de sílica ou de sílica-zircônia) juntamente com um homogeneizador mecânico. Pode ser utilizado um homogeneizador mecânico como o modelo BEADBEATER da empresa Biospec. O meio tamponado é composto, por exemplo, com tampão PBS (solução salina fosfato tamponada). 20 O tipo de composto tensoativo aniônico utilizado não é crucial, embora seja preferível escolher um do grupo alquilfenol etoxilado e os ésteres de sorbitan etoxilados. É preferível que o composto tensoativo aniônico seja selecionado a partir dos compostos octilfenol etoxilado. De preferência, octilfenol etoxilado com 7-8 mol de óxido de etileno são utilizados; estes podem ser 25 encontrados no mercado com o nome de TRITON X-114, por exemplo. A concentração dos compostos tensoativos aniônicos durante a homogeneização varia entre 1 e 5% do peso total homogeneizado. A massa homogeneizada que contém os fragmentos desejados de parede celular é submetido a um tratamento convencional para separar estes 30 fragmentos tanto das células não fragmentadas quanto dos compostos

6 solubilizados. 5/16 i,. e g Por exemplo, depois de separar a sílica ou a sílica-zircônia (se utilizada) por decantação, o produto homogeneizado é centrifugado gentilmente a uma velocidade mais baixa do que rpm para remover as células não 5 fragmentadas como sedimentos. Em seguida, o supernatante resultante é centrifugado a uma velocidade mais alta (por exemplo, maior do que rpm) para remover os elementos solubilizados que estão concentrados no líquido, enquanto os fragmentos de parede celular concentram-se no sedimento. Utilizando técnicas convencionais 10 conhecidas por um especialista neste setor, como a lavagem em tampão PBS e a centrifugação, este método pode ser repetido diversas vezes até que um supernatante totalmente translúcido seja obtido que é, em seguida, refugado. O sedimento obtido que contém fragmentos de parede celular é disperso em tampão PBS e submetido a um método químico (por exemplo, 15 tratamento com formol) ou físico (por exemplo, tratamento em autoclave ou pasteurização) para garantir a inativação total das células MTB-C que poderiam se tornar viáveis após a fragmentação e purificação. Finalmente, a dispersão de fragmentos de parede celular no tampão PBS é distribuída em frascos e liofilizada a uma temperatura entre -15 C e -25 C e 20 vácuo entre 0,1 e 0,5 mbar. Os frascos com os fragmentos de parede celular de MTB-C são, portanto, obtidos para formar o agente imunoterápico da presente invenção, e são mantidos a 70 C. A partir do agente imunoterápico da presente invenção, diversos 25 compostos farmacêuticos podem ser preparados, sendo este também um dos objetivos da presente invenção, estes podem ser formulados como uma emulsão de óleo em água (0/W) ou como lipossomas. As composições farmacêuticas do tipo lipossoma são as preferidas. A formação de lipossomas pode ser realizada utilizando-se técnicas 30 convencionais, bem conhecidas por um especialista neste setor. Por exemplo, os..

7 6/16 11, 4.. I, t i,... "r e.... lipossomas podem ser obtidos por meio da mistura dos fragmentos de parede celular liofilizados e dos lipídios adjuntos em um meio aquoso para formar lipossomas, e da homogeneização da mistura utilizando um método padrão. como um agitador de alta velocidade. 5 Os lipídios adjuntos para a formação de lipossomas são amplamente conhecidos por especialistas neste setor. Em geral, estes incluem fosfolipídios com uma carga líquida neutra e/ou negativa e esteróis. Os fosfolipídios utilizados podem ser, por exemplo, a fosfatidilcolina, a fosfatidilserina e a fosfatidilinositol. 10 Normalmente, o componente mais abundante em lipossomas é a fosfatidilcolina, que pode ser sintetizada ou isolada de fontes naturais. Um produto comercial freqüentemente utilizado é a lecitina de soja. Os esteróis utilizados na preparação de lipossomas podem ser, entre outros, o colesterol e sais de bile. 15 Preferivelmente, os lipossomas são formados utilizando-se uma mistura de lecitina de soja e colato de sódio. Opcionalmente, os lipossomas podem apresentar aditivos para aperfeiçoar a sua estabilidade, com a vitamina E, que atua como um antioxidante lipídico. 20 Os lipossomas obtidos variam de tamanho, e 99,9 % são menores do que 1 mícron. Os lipossomas podem ser submetidos à liofilização para obter o agente imunoterápico que é o objetivo da presente invenção como lipossomas liofilizados. 25 O objetivo da presente invenção também inclui a utilização do agente imunoterápico para preparar uma droga para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas. Preferivelmente, embora não excluindo outras rotas de administração, o agente imunoterápico que é o objetivo da presente invenção é administrado por 30 via parenteral.

8 7/16. e.. Entre as drogas antituberculose conhecidas. as preferidas para o tratamento combinado com ao agente terápico da presente invenção são a isoniazida e a rifampicina. A associação entre o agente imunoterápico da presente invenção e as 5 drogas antituberculose para o tratamento combinado desta doença pode ser realizada simultaneamente ou seqüencialmente, por exemplo, por meio da administração simultânea das drogas e o agente imunoterápico, ou por meio da administração prévia das drogas seguido da administração do agente imunoterápico. 10 Surpreendentemente, descobriu-se que o tratamento combinado de tuberculose através da administração do agente imunoterápico da presente invenção associado com drogas para o tratamento de tuberculose aumenta a eficácia destas drogas porque gera uma resposta imunológica contra bacilos que não se encontram em uma fase metabólica ativa, reduzindo, portanto, o risco de desenvolvimento de 15 resistências. Os exemplos a seguir proporcionam a um especialista neste setor uma descrição detalhada de exemplos de realização específicos dentro da presente invenção. Exemplo 1 - Obtenção do agente imunoterápico 20 Aproximadamente placas de ágar 7H11 de Middlebrook são inoculadas com uma cultura de H37Rv fornecida pela National Collection of Type Cultures (NCTC), em Londres, Inglaterra (número de depósito NC007416). A concentração de unidades formadoras de colônias inoculadas em cada placa é de UFC. As placas são incubadas por 21 dias (3 semanas) a uma temperatura 25 entre 34 C e 38 C. Após a incubação, as colônias são removidas das placas de ágar utilizando-se uma espátula, e tomando-se o cuidado de não remover o meio de cultura. Entre 15 e 18 g de extrato cru são obtidos. O extrato cru é disperso em aproximadamente 20 ml de tampão PBS 30 que contém 4% de peso de TRITON X ml de esferas de sílica-zircônia

9 8/ Re '... : - com 1 mm de diâmetro são adicionados e, em seguida, a homogeneização mecânica é realizada utilizando-se um homogeneizador BEADBEATER fabricado pela Biospec. O método de homogeneização é prosseguido até que uma quantidade 5 menor do que 5 bacilos inteiros sejam detectados após a observação de 100 campos em ampliações de 1000 campos após a coloração com a técnica Ziehl-Neelsen. O produto resultante da homogeneização é separado das esferas de sílica-zircônia por decantação. Este é lavado em uma solução tamponada PBS com 4% de peso de TRITON X-114, e o líquido das diferentes lavagens é coletado com 10 o produto, obtendo assim o volume total aproximado de ml. Em seguida, o produto resultante da homogeneização mais o líquido da lavagem é centrifugado a rpm por 30 minutos em um centrifugador refrigerado a 4 C, para remover células não fragmentadas do sedimento. O supernatante é mantido. 15 Em seguida, o supernatante é centrifugado a rpm (equivalente a g) durante 60 minutos a 4 C, obtendo, deste modo, um sedimento esbranquiçado que contém os fragmentos de parede celular. O sedimento é mantido, e o supernatante amarelado é eliminado. O sedimento é primeiramente lavado em tampão PBS (3 x 3 ml) e, 20 em seguida, redispersado em 3 ml da solução tampão, conduzido para 20 ml com tampão PBS e, sem seguida, centrifugado novamente a rpm por 60 minutos a 4 C. O supernatante obtido é descartado. A lavagem e a centrifugação são repetidas, e o supernatante obtido é 25 completamente translúcido e depois descartado. O sedimento que contém os fragmentos de parede celular is lavado em tampão PBS (3x3 ml) e redispersado em 12 ml de tampão PBS. Após a centrifugação e a lavagem, todo o volume resultante da dispersão de fragmentos de parede celular em tampão PBS é coletado em um 30 recipiente e pasteurizado por tratamento a 65 C por 1 hora.

10 9/16.. e. e 1..4 ii, è e 4# ih.. Em seguida, a mistura é rapidamente resfriada em banho de gelo, e a dispersão de fragmento de parede celular é distribuída em criotubos e uma proporção de 1 ml por criotubo. Os criotubos com os fragmentos de parede celular dispersados são 5 congelados a 70 C e liofilizados a uma temperatura entre 15 C e 22 C e vácuo entre 0,180 e 0,400 mbar. Entre 1 e 1,5 g de agente imunoterápico são obtidos. Exemplo 2 - Obtenção de lipossomas do agente imunoterápico Entre 740 e 770 mg do produto obtido no exemplo 1 é pesado em 10 uma proveta. Em seguida, são adicionados 20 ml de uma dispersão de lecitina de soja com qualidade farmacêutica em etanol (1 kg de lecitina em 1 litro de etanol absoluto) e 7 ml de uma solução de colato de sódio com qualidade farmacêutica em água (200 g de colato de sódio em 1 litro de água bidestilada). O ph é ajustado para um valor entre 7,7 e 8 com uma solução de HC1 15 de 0,997 N. Os lipossomas são preparados por homogeneização utilizando-se um agitador de alta velocidade. A dispersão de lipossomas obtida desta maneira é diluída para 10% em água bidestilada; o ph é ajustado para um valor entre 7,1 e 7,3 com uma 20 solução de HC1 de 0,0997 N. A dispersão de lipossomas é distribuída em criotubos (0,5 ml por tubo) e congelada a 80 C. A seguir, são liofilizadas e o agente imunoterápico (o objetivo da presente invenção) é obtido como lipossomas. 25 Exemplo 3 - Eficácia do agente imunoterápico como adjuvante no tratamento com drogas No modelo de infecção, camundongos fêmeas BALB/c, 129/Sv, C57BL/6 e DBA/2 com idades entre 6 e 8 semanas e livres de patogenia específica foram utilizados. 30 Uma linhagem virulenta de Mycobacterium tuberculosis foi cultivada

11 10/ o g em um meio de Proskauer-Beck até alcançar uma fase logarítmica média e depois foi mantida em frações de 1-mL a 70 C até o seu uso. Os camundongos foram inoculados em um aparelho de inoculação por aerossol de Middlebrook que proporciona inóculos aproximados de bacilos viáveis nos pulmões. A concentração bacilar, isto é, o número de bacilos viáveis, é determinada pela incubação de diluições seriadas de pulmão esquerdo e baço homogeneizado em ágar 7H11 de Middelbrook. As amostras de pulmão esquerdo e baço foram homogeneizadas na presença de 1 ml de tampão PBS. 10 I) Tratamento com uma dose de agente imunoterápico lipossomado simultaneamente com isoniazida grupos: Os camundongos infectados do tipo BALB/c foram divididos em três - Tratados somente com isoniazida a uma dose de 25 mg /kg por dia 15 durante 5 dias por semana durante 6 semanas (Controle), ou - Tratados com isoniazida a uma dose de 25 mg /kg por dia durante 5 dias por semana durante 6 semanas mais uma dose intranasal de 180 gg de agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, ou - Tratados com isoniazida a uma dose de 25 mg /kg por dia durante 5 20 dias por semana durante 6 semanas mais uma dose intraperitoneal 180 gg de agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção O tratamento com o antibiótico isoniazida foi iniciado na semana 9 e prosseguido até a semana 15. Uma dose do agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da 25 presente invenção, foi administrada na semana 13. Na semana 15, os animais foram mortos e a concentração bacilar no pulmão esquerdo e no baço foi determinada. As concentrações bacilares, estabelecidas após o método descrito na introdução da Seção C, foram significativamente mais baixas nos pulmões dos 30 animais vacinados, enquanto os resultados no baço não foram estatisticamente

12 1 1 /1 6 I..... diferentes quando comparadas com o grupo de Controle.. 4. ri,.,,,.. : Os resultados, expressos em UFC/mL, são apresentados na Tabela 1: Grupo camundongos de Pulmão Baço Controle 7,5±2.89 0,75±0,33 Via intranasal < 2+0* 0,4±0,2 Via intraperitoneal < 2±0* 0,52±0,44 * = valor estatisticamente significativo comparado com o grupo de Controle, p<0,05 Pode ser observado que os animais tratados com o agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, administrado por via 5 intranasal e intraperitoneal simultaneamente com isoniazida apresentaram um número de bacilos nos pulmões consideravelmente menor do que os camundongos tratados com o antibiótico isoniazida isolado. Levando -se em consideração que n OmPro de bacilos estabelecidos inclui todos os bacilos, tanto aqueles que estão na fase ativa quanto os que estão em 10 uma fase não ativa, o tratamento com o agente imunoterápico lipossomado permitiria reduzir o tempo de tratamento com o antibiótico, uma vez que ele reduz consideravelmente o número de bacilos que podem mudar com o tempo para uma fase ativa. II) Tratamento com três doses de agente imunoterápico lipossomado 15 após o tratamento com rifampicina e isoniazida grupos: Os camundongos infectados do tipo 129/Sv foram divididos em dois - Tratados com isoniazida a uma dose de 25 mg/kg por dia durante 5 dias por semana durante quatro semanas e rifampicina a uma dose de 10 mg/kg por 20 dia durante 5 dias por semana durante quatro semanas (Controle), e - Também tratados com três doses de 180 lig de agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, administradas subcutaneamente após :.. g.

13 12/16... a. 9 -, '' : 9 g g e o tratamento com rifampicina e isoniazida O tratamento com o antibiótico isoniazida foi iniciado na semana 9 e prosseguido por 4 semanas. Na semana 13. o tratamento com rifampicina foi iniciado e concluído na semana Nas semanas 17, 19 e 21, três doses de agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, foram administrados. Na semana 22, os animais foram mortos e as concentrações bacilares no pulmão esquerdo e no baço foram estabelecidas. A concentração bacilar foi significativamente menor nos pulmões dos 10 animais vacinados quando comparado com o grupo de Controle, enquanto nenhuma diferença significativa foi encontrada no baço entre o grupo de Controle e aqueles que também foram tratados com o agente imunoterápico lipossomado. Os resultados, expressos em log 10 UFC/mL, são apresentados na Tabela 2: Grupo de Pulmão Baço camundongos Controle 2,67±0,83 2,35±1,18 Via subcutânea 1,61+0,58* 1,37±1,02 * = valor estatisticamente significativo comparado com o grupo de Controle, p<0,05 15 Pode ser observado que os camundongos tratados com o agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, administrado subcutaneamente e após o tratamento com os antibióticos isoniazida e rifampicina apresentaram um número de bacilos nos pulmões significativamente mais baixo do que os camundongos tratados com os antibióticos isolados. 20 A mesma conclusão da Seção (I) pode ser aplicada neste caso. III) Tratamento com três doses de agente imunoterápico lipossomado simultaneamente com isoniazida Os camundongos infectados do tipo C57BL/6 foram divididos em dois grupos:

14 13/16.. 4, e... - e. e.. e.. - Tratados com isoniazida isolada a uma dose de 25 mg /kg por dia durante 5 dias por semana durante 8 semanas (Controle), e - Também tratados com três doses de 180 In do agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, administrado por via intranasal. 5 Na semana 9, o tratamento com o antibiótico isoniazida foi iniciado e prosseguido até a semana 17. nas semanas 13, 15 e 17. As doses do agente imunoterápico lipossomado foram administradas Os camundongos foram sacrificados nas semanas 15 e 28 e as 10 concentrações bacilares no pulmão esquerdo e no baço foram estabelecidas. A concentração bacilar foi significativamente mais baixa nos pulmões de animais vacinados após a administração de uma ou três doses (correspondentes às semanas 15 e 28, respectivamente), comparada ao grupo de Controle. Os resultados obtidos para os pulmões após uma dose do agente 15 imunoterápico (semana 15) e após 3 doses (semana 28), expressos em log i o Grupo camundongos de Semana 15 (1 dose) Semana 28 (3 dose) Controle 2,34±0,24 3,86±0,41 Intranasal 1,59±0,61* 3,48±0,18* * = valor estatisticamente significativo comparado com o grupo de Controle, p<0,05 Pode ser observado que os camundongos tratados com apenas uma dose do agente imunoterápico lipossomado administrado por via intranasal, simultaneamente com um tratamento com o antibiótico isoniazida, apresentaram 20 um número de bacilos nos pulmões significativamente mais baixo do que os camundongos tratados com o antibiótico isolado. A mesma conclusão da Seção (I) pode ser aplicada neste caso. Com relação ao baço, a concentração bacilar foi significativamente mais baixa em animais vacinados após a administração das 3 doses (correspondente UFC/mL, são apresentados na Tabela 3:

15 à semana 28), comparado com o grupo de Controle. apresentados na Tabela 4: 14/ Os resultados obtidos para o baço. expressos em log 10 UFC/mL, são Grupo camundongos de Semana 15 Semana 28 Controle 1.47±0,44 3,84±0.48 Intranasal 1,41±0,58 3,43±0,29* * = valor estatisticamente significativo comparado com o grupo de Controle, p<0,05 Pode ser observado que os camundongos tratados com as três doses 5 do agente imunoterápico, o objetivo da presente invenção, administrado por via intranasal simultaneamente ao tratamento com o antibiótico isoniazida apresentaram um número de bacilos nos pulmões significativamente mais baixo do que os camundongos tratados com o antibiótico isolado. A mesma conclusão da Seção (I) pode ser aplicada neste caso. 10 IV) Ensaio comparativo para estudar o efeito dos antibióticos, (in agente imunoterápico lipossomado e das interações entre os dois. Diversos ensaios com camundongos DBA/2 foram conduzidos, seguindo um modelo fatorial 2 2 de acordo com as condições apresentadas na Tabela 5: Ensaio Antibiótico Agente imunoterápico lipossomado 1 Não Não 2 Sim Não 3 Não Sim 4 Sim Sim 15 No ensaio 1, os camundongos infectados foram mantidos sem qualquer tratamento. No ensaio 2, os camundongos infectados receberam o antibiótico isoniazida isolado a uma dose de 25 mg/kg por dia durante 5 dias por semana

16 15/16. e. 4, , ip 1, durante 4 semanas e rifampicina a uma dose de 10 mg/kg por dia durante 5 dias por semana durante 4 semanas, iniciando-se na semana 9 após a infecção. No ensaio 3, os camundongos infectados foram tratados com três doses de 180 pg de agente imunoterápico lipossomado isolado, administrado 5 subcutaneamente nas semanas 9, 11 e 15 após a infecção. No ensaio 4, o tratamento com o antibiótico isoniazida foi iniciado na semana 9 e administrado durante 4 semanas. Na semana 13, o tratamento com rifampicina foi iniciado e concluído na semana 17. Nas semanas 17, 19 e 21, três doses do agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, 10 foram administradas. Na semana 22, todos os animais foram mortos e as concentrações bacilares no pulmão esquerdo foram estabelecidas. Os resultados obtidos para os pulmões são expressos em log ro UFC/mL e são apresentados na Tabela 6: Ensaio Antibiótico Agente imunoterápico lipossomado log ro UFC/mL 1 Não Não 5,37±0,27 2 Sim Não 3 ; 29+0,8* 3 Não Sim 5,69±0,22 4 Sim Sim 0,69+0** *= valor estatisticamente significativo comparado com os ensaios 1,3 e 4 para p<0,05; **= valor estatisticamente significativo comparado com os ensaios 1,2 e 3 para p<0,05 Pode ser observado que o tratamento combinado dos antibióticos 15 isoniazida e rifampicina com o agente imunoterápico lipossomado, o objetivo da presente invenção, provoca uma redução consideravelmente mais alta no número de bacilos comparado com a redução encontrada com qualquer um dos outros dois fatores (antibióticos e o agente imunoterápico lipossomado) isolados. Levando-se em consideração que o número de bacilos estabelecidos 20 inclui todos os bacilos, tanto aqueles em uma fase ativa quanto aqueles em uma fase não ativa, o tratamento com o agente imunoterápico lipossomado em

17 16/ Ga fo :a. ii, e., e,. g. associação com outras drogas permitiria a redução do tempo de tratamento com estas drogas, uma vez que reduz consideravelmente o número de bacilos que podem mudar com o tempo para uma fase ativa.

18 1/ e,, e... e,,e, I,.. REIVINDICAÇÕES. 1.) Método de obtenção de um agente imunoterápico que contém fragmentos da parede celular de uma linhagem virulenta do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB-C), sendo que tal método é caracterizado por incluir as etapas a 5 seguir: - cultura da linhagem virulenta de MTB-C por um período de três semanas ou mais e, em seguida, - homogeneização da cultura celular na presença de um composto tensoativo aniônico ) Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo período de cultura variar entre 3 a 4 semanas. 3.) Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo composto tensoativo aniônico ser selecionado entre o grupo alquilfenol etoxilado e os ésteres de sorbitan etoxilados ) Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo composto tensoativo aniônico ser selecionado entre os compostos octilfenol etoxilado. 5.) Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo composto tensoativo aniônico ser selecionado entre o octilfenol etoxilado com 7-8 mol de óxido de etileno ) Método, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pela homogeneização ser realizada em um meio tampão com um ph neutro. 7.) Método, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por incluir ainda as etapas a seguir: - separação das células não fragmentadas e dos compostos solubilizados por 25 centrifugação, - tratamento químico e físico da fração dos fragmentos de parede celular para desativar todas as possíveis células remanescentes da linhagem virulenta, e - dissecação do agente imunoterápico obtido por meio de liofilização. 8.) Agente imunoterápico obtido através de um método que está de acordo com 30 qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.

19 2/2.... ;.... g.. `. é 9.) Composição farmacêutica que contém o agente imunoterápico da reivindicação ) Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, que compreende o agente imunoterápico sob a forma de lipossomas ) Uso do agente imunoterápico da reivindicação 8 para preparar uma droga para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas. 12.) Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelas drogas utilizadas serem a isoniazida e/ou a rifampicina.

20 1/1 RESUMO , 4, "AGENTE IMUNOTERÁPICO ÚTIL PARA O TRATAMENTO COMBINADO DE TUBERCULOSE EM ASSOCIAÇÃO COM OUTRAS DROGAS", refere-se a presente invenção a um agente imunoterápico baseado em fragmentos das paredes 5 celulares de linhagens virulentas de Mycobacterium tuberculosis, a um método para a obtenção deste agente imunoterápico, às formulações farmacêuticas que o contém e a sua utilização para a preparação de uma droga para o tratamento combinado de tuberculose em associação com outras drogas.