TIPS SENSORES NANOESTURADOS PARA DIAGNÓSTICO DO INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO. Palavras-chave: eletrodos impressos, polipirrol; haloisita

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1 (1) TIPS SENSORES NANOESTURADOS PARA DIAGNÓSTICO DO INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO Silva, B.V.M. (1) ; Landim, V.P.A. (1) ; Dutra, R.F. (1) barbaravmsilva@hotmail.com Laboratório de Engenharia Biomédica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife PE. RESUMO As troponinas cardíacas são proteínas estruturais do complexo contrátil do miocárdio, consideradas atualmente como moléculas padrão-ouro no diagnóstico do infarto. Neste trabalho, sensores impressos portáteis e descartáveis foram desenvolvidos para detecção eletroquímica da troponina T cardíaca humana através da interação antígeno-anticorpo. Um filme condutor nanoestruturado baseado no uso de polipirrol e nanotubos de haloisita foram empregados para imobilização dos anticorpos anti-ctnt. Um filme ótimo de polirrol foi obtido na concentração de 10 mm. As modificações graduais da interface sensora demonstraram eletroquimicamente a contribuição do filme de condutor de polipirrol e nanotubos de haloisita na interface sensora. A curva de calibração do imunossensor proposto apresentou uma boa linearidade (r = 0,992; p<0,0001; n=7). Palavras-chave: eletrodos impressos, polipirrol; haloisita

2 INTRODUÇÃO Os marcadores cardíacos, em especial as troponinas cardíacas, são componentes essenciais utilizados para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio, devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Imunoensaios enzimáticos e quimioluminescentes têm sido empregados na rotina laboratorial para dosagem das troponinas cardíacas (ALPERT et al., 2000; CHRISTENSON & AZZAZY, 2009). Entretanto estes apresentam limitações no diagnóstico à beira do leito de pacientes infartados de modo prático, rápido e seguro. Nesse sentido, os imunossensores eletroquímicos surgem como uma importante ferramenta analítica. Dentre estes, os que empregam a tecnologia de eletrodos impressos (EIs) tem se destacado devido a sua alta sensibilidade, baixo custo, compatibilidade com as tecnologias de miniaturização de sensores e capacidade de produção em massa (METTERS, KADARA & BANKS, 2011). A otimização da interação antígeno-anticorpo na interface sensora é uma das etapas críticas para obtenção de imunossensores mais sensíveis, estáveis e reprodutíveis eletroquimicamente. No intuito de superar estes desafios, diferentes nanomateriais metálicos e carbonáceos têm sido explorados como suporte na confecção para imobilização de biomoléculas, com o objetivo de aumentar a área superficial, e consequentemente à 2

3 densidade de moléculas (HU et al., 2011). Recentemente, a aplicação de nanominerias, tais como nanotubos de haloisita (NTHs), tem se destacado devido a sua excelente biocompatibilidade, alta porosidade e viabilidade econômica. Em associação com os NTHs, à utilização de matrizes poliméricas para construção de plataformas sensoras nanoestruturadas tem gerado novas possibilidades para exploração de superfícies eletródicas com acentuadas propriedades mecânicas e elétricas (ATES & SARAC, 2009). Em particular, polímeros eletrocondutores, como a polianilina e o polipirrol, têm se destacado por apresentarem atividade redox intrínseca combinada a uma fácil deposição eletroquímica e constituição de filmes finos, auxiliando no processo de imobilização de biomoléculas, e ofertando diferentes grupos reativos à superfície sensora. Neste trabalho, um filme condutor nanoestruturado basedo no uso do polímero polipirrol e NTHs serão empregados na construção de tips sensores para detecção eletroquímica da tropinina T cardíaca humana (ctnt), um marcador padrão-ouro no diagnóstico do do infarto agudo do miocárdio. 3

4 MATERIAL E MÉTODOS O EI foi confeccionado através da impressão de um fino filme de tinta de carbono modificado com grafite sobre a superfície moldada do politereftalato de etila. Após o processo de confecção, o EI foi submetido a uma limpeza eletroquímico em KCl (0,1 M) durante 40 voltametrias cíclicas na faixa de potencial de -2 a 2 V, a velocidade de varredura de 100 mv/s (ALONSO-LOMILLO et al., 2011). Após a limpeza, um filme de polipirrol foi obtido através da eletropolimerização da solução do monômero preparada KCl (0.1 M) utilizando a técnica de voltametria cíclica. NTHs foram funcionalizados com grupos aldeídos e em seguida complexados a interface do EI modificada com o filme de polipirrol (Figura 1). Figura 1. Esquema do processo de modificação da interface do tip sensor para imobilização dos anticorpos anti-ctnt. 4

5 Uma alíquota de 10 µl da solução de anti-ctnt ativado foi pipetada sobre a superfície do EI e mantida durante 60 min em câmera úmida à temperatura ambiente. Posteriormente, os sítios livres não específicos na interface sensora foram bloqueados com uma solução de glicina (0,05 M). Os ensaios eletroquímicos foram realizados usando um sistema tri-eletródico, que consistiu em um eletrodo de trabalho impresso (Ø= 4 mm), um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo de Ag/AgCl (KCl Sat.) como referência, acoplados a um potenciostato modelo PGSTAT 12 da marca AUTOLAB (Metrohm Pensalab, Brasil) e controlado pelo software GPES 4.9 (Eco Chemie BV, Holanda). Todas as medidas foram realizadas em K 3 [Fe(CN) 6 ]/K 4 [Fe(CN) 6 ] (0,005 M) preparado em tampão PBS (0,01 M, ph 7,4). As técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial foram utilizadas, respectivamente, para caracterização da interface sensora e detecção eletroquímica da ctnt. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inicialmente para padronização da plataforma sensora um estudo de concentração do filme de polipirrol foi realizado. Diferentes concentrações do monômero pirrol (10, 10, 30 e 40 mm) preparadas em solução de KCl (100 mm) foram eletropolimerizadas durante 20 ciclos voltamétricos na faixa de potencial de -0,8 a 0,8 V, a velocidade de 5

6 varredura de 50 mv/s sobre a superfície do EI. Após a modificação, um perfil eletroquímico característico do filme condutor foi observado (EKABUTR, CHAILAPAKUL & SUPAPHOL, 2013). Os valores de corrente dos picos de redução frente às diferentes concentrações de pirrol apresentaram uma resposta máxima a 10 mm (Figura 2). Esta concentração foi adotada para os ensaios subsequentes. As etapas de modificação da superfície sensora podem ser analisadas na Figura 3. Após o procedimento de limpeza do EI, picos de oxidação e redução mais definidos e situados a 0,1 V e 0,36 V, respectivamente, foram observados (Figura 3a e 3b). Estes resultados podem ser associados à remoção de contaminantes orgânicos da interface sensora. Comparando os voltamogramas do EI limpo (Figura 3a) e modificado com polipirrol (Figura 3b), um aumento de corrente foi observado evidenciado após a formação do filme condutor, evidenciando assim, um aumento da transferência de elétrons na interface sensora. A modificação do EI eletropolimerizado com os NTHs (10 mg/ml) apresentou uma redução dos valores de corrente dos picos de oxidação e redução, devido a contribuição semicondutora do nanomaterial (Figura 3d). 6

7 Ipa (µ A) E(V) (vs Ag/AgCl) Figura 2. Curva de concentração do pirrol (5, 10 20, 30 e 40 mm) eletropolimerizado sobre a superfície do eletrodo impresso. Resposta de corrente obtida entre a diferença dos picos de redução dos voltamogramas cíclicos do eletrodo limpo e eletropolimerizado. Análises por voltametria de pulso diferencial foram empregadas para detecção direta da ctnt e obtenção de uma curva de calibração do imunossensor. Para tais ensaios, o EI foi incubado com diferentes concentrações de ctnt (na ordem de ng/ml) e submetido a medidas voltamétricas em K 3 [Fe(CN) 6 ]/K 4 [Fe(CN) 6 ] (5 mm) preparado em tampão PBS (0,005 M; ph 6,5). Os resultados obtidos demonstram uma relação proporcional indireta entre os picos de corrente dos voltamogramas de pulso diferencial e as concentrações de ctnt (0,005-0,01 ng/ml). A curva de calibração do EI apresentou um coeficiente de 7

8 correlação de 0,992 (p<0,001, n= 7), combinado a um baixo erro relativo (<<1%) (c) (d) I (µa) (b) (a) E (V) Figura 3. Voltamogramas cíclicos das etapas de construção da plataforma sensora: (a) EI como fabricado, (b) após o tratamento eletroquímico, (c) eletropolimerizado com um filme de polipirrol (10 mm) e (d) modificado com os NTHs. Medidas realizadas em K 3 Fe(CN) 6 /K 4 Fe(CN) 6 (5 mm) preparado em KCl (0.1 M). CONCLUSÃO Um filme condutor nanoestruturado baseado no uso de polipirrol e nanatubos de haloisita foi obtido para imobilização covalente dos anticorpos anti-ctnt e detecção eletroquímica da ctnt em níveis de relevância clínica; 8

9 Como perspectivas futuras deste trabalho, tem-se a realização de alguns estudos complementares, como testes com amostras de soro e sangue total. REFERÊNCIAS ALONSO-LOMILLO, M.A.; DOMÍNGUEZ-RENEDO, O.; ROMÁN, L.D.T.D.; ARCOS-MARTÍNEZ, M.J Horseradish peroxidase-screen printed biosensors for determination of Ochratoxin A. Analytical Chimica Acta, 688: ALPERT, J.S.; THYGESEN, K.; ANTMAN, E.; BASSAND, J.P Myocardial infarction redefined-a consensus document of The Joint European Society of Cardiology/American College of Cardiology Committee for the redefinition of myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology, 36: ATES, M.; SARAC, A. S. Conducting polymer coated carbon surfaces and biosensor applications. Progress in Organic Coatings, v. 66, n. 4, p , CHRISTENSON, R.H.; AZZAZY, H.M Cardiac point of care testing: a focused review of current National Academy of Clinical Biochemistry guidelines and measurement platforms. Clinical Biochemistry, 42: EKABUTR, P.; CHAILAPAKUL, O.; SUPAPHOL, P. Modification of Disposable Screen-Printed Carbon Electrode Surfaces with Conductive Electrospun Nanofibers for Biosensor Applications. Journal of Applied Polymer Science, v. 130, n. 6, p ,

10 HU, W.; LI, C.M Nanomaterial-based advanced immunoassays. Nanomedicine and Nanobiotechnology, 3: METTERS, J.P.; KADARA, R.O.; BANKS, C.E New directions in screen printed electroanalytical sensors: an overview of recent developments. Analyst, 136: