DETECÇÃO DE PROTEÍNAS ATRAVÉS DE UM SUBSTRATO ATIVADO POR RESSONÂNCIA DE PLÁSMONS DE SUPERFÍCIE

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1 DETECÇÃO DE PROTEÍNAS ATRAVÉS DE UM SUBSTRATO ATIVADO POR RESSONÂNCIA DE PLÁSMONS DE SUPERFÍCIE Karina Ferreira (IC/Balcão-CNPQ-UEM), Jacqueline Ferreira, Emerson Marcelo Girotto (Orientador), Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Química/Maringá, PR e Palavras-chave: Biosensor, grades de relevo, substrato plasmônico. Resumo: A técnica de ressonância de plásmons de superfície baseia-se nas propriedades ópticas e pode ser empregada para estudos de fenômenos de superfície, monitorando a mudança no índice de refração, devido, por exemplo, a ligação de uma camada orgânica à superfície do metal. Neste trabalho utilizou-se como substrato plasmônico grades de relevo feitas em filmes de azopolímeros, onde foi depositado um filme fino de ouro. A sensibilidade destes substratos plasmônicos foi testada utilizando soluções de glicose com diferentes índices de refração. Verificou-se um deslocamento do mínimo de transmissão para maiores comprimentos de onda a medida que o índice de refração aumentava. Almejando a aplicação destes substratos como biosensores, monitoramos também a imobilização de proteínas na superfície do substrato plasmônico através de medidas de transmissão colinear. Após a imobilização da proteína, observou-se o deslocamento do modo plasmônico para maiores comprimentos de onda devido ao aumento no índice de refração efetivo da amostra. Os resultados mostraram que o substrato plasmônico contendo grades de relevo é viável para a aplicação como biosensor, apresentando sensibilidade de 107 nm.riu -1. Introdução Biosensor é um dispositivo no qual um material de origem biológica, como enzimas, ácidos nucléicos, organelas, anticorpo ou antígeno, é imobilizado junto a um meio transdutor, de onde é possível converter a interação entre as moléculas em algum tipo de resposta elétrica, óptica, etc. 1 A superfície do sensor deve possibilitar a imobilização de um número suficiente de elementos de bio-reconhecimento, evitando ligações não específicas. Além disso, os elementos de bio-reconhecimento devem ser imobilizados na superfície do sensor sem que esta imobilização afete sua atividade biológica. 2 As proteínas representam a classe de moléculas mais comumente usada como elemento de bio-reconhecimento. A adsorção de proteínas sobre a superfície do sensor é um dos fatores mais importantes no desenvolvimento de biosensores para aplicações biológicas e biomédicas.

2 Em biosensores é extremamente importante a obtenção de superfícies com alto nível de organização e que proporcionem um grande número de sítios de ligação para imobilização de elementos de bio-reconhecimento.2,3 Um dos fenômenos explorados no desenvolvimento de biosensores é a ressonância de plasmóns de superfície (SPR). Esta técnica baseia-se nas propriedades ópticas e pode ser empregada em estudos de fenômenos de superfície, monitorando a mudança no índice de refração, devido, por exemplo, a ligação de uma camada orgânica à superfície do metal. 4 O efeito de SPR está associado a uma oscilação da densidade de carga longitudinal, ao longo da interface entre dois meios com constantes dielétricas de sinais opostos, onde um é metal e o outro um dielétrico.4 Através desta técnica, medidas em tempo real podem ser realizadas para se estudar a ligação entre uma molécula imobilizada sobre a superfície do metal com um analito específico presente em solução (e.g. anticorpo-antígeno, AC-AG). A resposta é obtida através de medidas da mudança do índice de refração, que é alterado devido à ligação entre as espécies imobilizadas e o analito.2,5 Materiais e métodos Materiais, Reagentes e Equipamentos Para a fabricação das grades de relevo (surface relief gratings, SRG) utilizou-se lâmina de vidro coberto com filme de ouro de 100 nm de espessura (uma camada de 5 nm de cromo foi previamente depositado sobre o vidro para ajudar na aderência do filme de ouro ao substrato). Albumina de soro bovino (BSA, Sigma-Aldrich), ácido mercaptodecanóico (MUA), N-hidrixisuccinamida (NHS, Sigma-Aldrich), N-etil-N-(3- dietilaminopropil) cardiimida (EDC, Sigma-Aldrich), etanol (Sigma-Aldrich), glicose (Sigma-Aldrich), e água nanopura (18,1 MΩ.cm, Barnstead) foram usados para preparação das soluções e testes. Para experimentos de testes de sensibilidade e imobilização de moléculas sobre os substratos de ouro foi utilizada uma bomba peristáltica Milan (BP200), microscópio metalográfico (Quimis) com lente objetiva de 50X de longa distância de trabalho, acoplada a uma fibra óptica e espectrofotômetro UV-Vis (USB2000), câmera digital Sony e refratômetro portátil (ATAGO, modelo 3850). Resultados e Discussão Os espectros de transmissão foram obtidos com luz branca não polarizada, polarizada em P (pol P) e em S (pol S). A polarização é necessária, pois o plásmon só é gerado quando o vetor campo elétrico está perpendicular à superfície. Quando paralelo sua oscilação anula a separação de carga, não ocorrendo a geração do plásmon de superfície. Considerando-se que a SRG não tenha defeito, espera-se obter SPR apenas para luz polarizada na direção P. Portanto, subtraindo o espectro de transmissão da luz em pol P da luz em pol S, obtêm-se o pico de

3 ressonância do substrato plasmônico. Com base nestas informações, os resultados apresentados estão relacionados com a diferença entre pol P e pol S. Sensibilidade A Figura 1 mostra o espectro de transmissão de luz através das grades de relevo com periodicidade de 410 nm e profundidade de nm (410_1.200), adquiridos durante o fluxo de soluções de glicose com diferentes índices de refração. Durante estas medidas utilizou-se uma célula de fluxo. Através do teste de sensibilidade observou-se um deslocamento do mínimo de transmissão para maiores comprimentos de onda à medida que o índice de refração aumenta, estando de acordo com o observado em outros substratos plasmônicos. 6 Inte nsidade / u ni. arb S 1 = 1 06,7 5 ± 3,3 2 R = 0, A B0) ,3 35 1, ,34 5 1,3 50 1,355 1,36 0 1, ,37 0 Indice de re fraçao / nm Figura 1 a) Espectro de transmissão da SRG 5(410_1.200) em soluções de glicose com diferentes índices de refração. b) Curva de calibração e sensibilidade da SRG 5. A determinação quantitativa da sensibilidade da amostra foi feita através de um gráfico do mínimo de transmissão em função do índice de refração (Figura 1b). A sensibilidade da amostra é obtida pela inclinação da curva. A sensibilidade da amostra foi calculada como sendo ca.107 nm.riu -1 (RIU = unidade de índice de refração). Detecção de proteínas sobre a grade de relevo A SRG 5 foi utilizada para medidas de biosensibilidade. A amostra foi imersa por 24h em solução etanólica de MUA para obter-se uma camada automontada. Em seguida a amostra foi limpa com etanol e incubada em uma solução 1:1 de 0,1 mol.l -1 NHS e 0,1 mol.l -1 de EDC por 12h. Posteriormente, a amostra foi imersa em BSA por 1h30min. A Figura 2 mostra o deslocamento de um mínimo de transmissão para maiores comprimentos de onda quando a BSA é imobilizada.

4 S R G 5_4 1 0_ Inte nsidade / u ni. arb. p -s M U A _NH S _B S A p -s M U A _NH S λ / n m B S A Figura 2 Espectro de transmissão da SRG 5 (410_1.200) depois da modificação com monocamada de MUA e imobilização de BSA. Espectro coletado em ar. Gráfico de coluna mostando o deslocamento para o vermelho, obtidos para o pico de ressonância em 655 nm, respectivamente. Através do gráfico obtido na Figura 2 pode-se observar com maior clareza o deslocamento do modo plasmônico para maiores comprimentos de onda devido ao aumento no índice de refração efetivo da amostra.6 Conclusões A SRG apresentou um comportamento linear do deslocamento do mínimo de transmissão em função do índice de refração, apresentando sensibilidade de aproximadamente 107 nm.riu -1. A eficiência da SRG 5 em detectar a imobilização da BSA sobre a monocamada de alcanotiol, mostra a viabilidade de aplicação de grades de relevo como biosensores para marcadores tumorais. Agradecimentos Ao CNPq pela bolsa. Ao professor Paul Rochon Royal MilitaryCollege of Canadá, pelos substratos fornecidos. Á Universidade Estadual de Maringá. Referências

5 1 Santos R. C. dos S.; Costa P. I. De; Yamanaka H. Química Nova, 25, Ferreira J. Tese de Doutorado, Maringá, Lofas S.; Johnsson B.; Edstron A.; Hensson A.; LindquistT G.; Muller Hillgren R. M. e Stigh L. Biosens. Bioelectron, 1995, 10, Carvalho R. M. de; Rath S. e Kubota L. T. SPR Química Nova, vol. 26. São Paulo, Englebienne P.; Hoonacker A. V. e Verhas M. Spectroscopy, 2003, 17, Ferreira J.; Santos M. J. L.; Rahman M. M.; Brolo A.G.; Gordon R.; Sinton D., Girotto E. M. Journal of the American Chemical Society, , 131, 2009.