Avaliação de eletrodos impressos modificados com enzimas AChE imobilizadas com náfion sobre carbono-meldola blue.

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1 Avaliação de eletrodos impressos modificados com enzimas AChE imobilizadas com náfion sobre carbono-meldola blue. Paulo Roberto Brasil de O. Marques 1, Ronaldo Censi Faria 2, João Batista Fernandes 3. 1 Núcleo de Análise em Resíduos de Pesticidas-NARP Universidade Federal do Maranhão, Campus de Codó, MA, Brasil. 2 Laboratório de Bioanalítica, Biossensores, Eletroanalítica e Sensores-LABBES 3 Laboratório de Produtos Naturais. Universidade Federal de São Carlos,São Carlos, SP. Brasil. paulobrasil10@gmail.com Abstract O presente trabalho enfoca a avaliação do substrato eletródico de carbono modificado com mediador eletroanalítico meldola blue na construção de biossensores enzimáticos de enzimas acetilcolinesterases a partir de eletrodos impressos em base de cerâmica. A membrana de náfion foi utilizada com agente de imobilização. Para tanto foram efetuados estudos de caracterização do sensor, estudos espectrofotométricos da reação de catálise enzimática, monitoramento cinético via métodos eletroanalíticos, estudos de repetitividade de sinal e monitoramento eletroanalítico da atividade catalítica frente ao substrato iodeto de acetiltiocolina. O eletrodo impresso da marca comercial DropSens demonstrou ser uma excelente plataforma para construção de biossensores enzimáticos baseados no processo de inibição. Palavras-chave: Acetilcolinesterase; eletrodos impressos, meldola blue, náfion. Introdução Os sensores eletroanalíticos figuram como ferramentas capazes de efetuar análises cada vez mais sensíveis e seletivas, buscando respostas cada vez mais rápidas e confiáveis [1]. Dentre estes, os sistemas conjugados denominados de eletrodos impressos (do inglês, screem printing) vêm apresentando propostas inovadoras em sistemas de monitoramento de distintos analítos. Como vantagens enfatizam-se o baixo custo, a versatilidade, a possibilidade de miniaturização e construção em massa, a facilidade operacional e a real aplicação in situ, fatores relevantes para o desenvolvimento de versões comerciais [2]. A construção faz uso de substratos específicos, como a cerâmica e o PVC, por exemplo, onde são depositadas as tintas condutoras que compõem o sistema de eletrodos [3]. As possibilidades de modificação da superfície dos eletrodos impressos são comparáveis com os convencionais, porém, a regeneração da superfície de trabalho ainda é fator de controle no dispositivos convencionais. Fator este que se faz minimizado com a possibilidade de se trabalhar com um número bem maior de eletrodos com mesmas características, como no caso dos impressos, que podem ser descartáveis [4]. O uso destes eletrodos na construção de sistemas baseados em biossensores eletroanalíticos vem sendo fortemente divulgado na literatura especializada, alcançando lugar de destaque [5-8]. Como agentes biológicos modificadores das superfícies eletródicas merecem destaque as enzimas e os materiais genéticos, tais como o DNA e os oligonucleotídeos, que tem sido imobilizados a partir de distintas metodologias, que conferem ao material ligado no eletrodo um ambiente em que as características biológicas essenciais sejam mantidas [9]. O processo de imobilização propicia vantagens, tais como: controle do meio reacional, diminuição da quantidade de reagente, uso repetitivo da capacidade biológica, entre outros [10]. A enzima colinesterase (ChE) tem sido uma das principais biomoléculas estudadas na construção de biossensores baseados no processo de inibição enzimática, no qual o sinal analítico monitorado é função da diminuição da atividade de catálise. Este processo é efetuado pela exposição da enzima a um inibidor específico, por um determinado tempo, sendo que a porcentagem de inibição sofrida pela enzima está quantitativamente relacionada com a concentração deste agente inibidor. Alguns trabalhos apresentam resultados promissores fazendo uso destas enzimas imobilizadas em

2 suportes impressos, a partir de distintas metodologias e agentes de imobilização [11-14]. A membrana de náfion é um filme polimérico de troca iônica que vem sendo utilizado para imobilização de biomoléculas, funcionando também como uma barreira seletiva para interferentes, visto que o filme é aniônico. Apresenta uma excelente estabilidade e biocompatibilidade [15]. O presente trabalho apresenta uma avaliação das possibilidades de uso de eletrodos impressos de carbono modificados com mediador eletroanalítico meldola blue. A enzima colinesterase foi utilizada como agente biológico na construção do sensor e o náfion, como imobilizador. Materiais e Métodos Para as etapas de avaliação eletroanalítica foi utilizado o potenciostato/galvanostato da marca AUTOLAB. Como eletrodo de trabalho foram selecionados os eletrodos do tipo impresso, em cerâmica, da empresa DropSens (Olviedo, Espanha). Sendo: auxiliar (Pt), referência (Ag) e de trabalho (carbono previamente modificado com meldola blue). As medidas foram efetuadas em volume de 100 µl (gota) de solução. As medidas espectrofotométricas foram efetuadas com espectrofotômetro Hewlett Packard, interfaciado a um computador, empregando cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico. Os reagentes empregados foram: enzima acetilcolinesterase (AChE, EC ) de enguia elétrica (425,94 U/mg) e substrato enzimático iodeto de acetilcolina (AChEI), obtidos da SIGMA, meldola blue (C 16 H 18 ClN 3 S.3H 2 O), fosfato de potássio monobásico (NaH 2 PO4), fosfato de potássio dibásico (Na 2 HPO4), da Merck, ferricianeto de potássio (K 2 Fe(CN) 6 ), da Fluka. Náfion, da Aldrich. Ditiobisnitrobenzoato (DTNB) e Cloreto de sódio (NaCl) da Sigma. As soluções tamponantes foram preparadas com água ultrapura e estocadas em geladeira, a 4 ºC, por no máximo 15 dias, sempre sendo preparadas em valor de ph fisiológico (ph=7,2). Foram efetuados estudos de caracterização do sensor, estudos espectrofotométricos da reação de catálise enzimática, monitoramento cinético via métodos eletroanalíticos, estudos de repetitividade de sinal e monitoramento eletroanalítico da atividade catalítica frente ao substrato iodeto de acetiltiocolina. Primeiramente estes eletrodos foram caracterizados frente ao eletrólito suporte (tampão fosfato ph 7,2) e ao composto ferricianeto de potássio (K 4 Fe(CN) 6 ), em meio de tampão fosfato, pela técnica de voltametría cíclica, objetivando verificar os processos oxidativos do mesmo sobre o material eletródico, sendo posteriormente avaliado o sinal do mediador eletroanaítico em solução, via cronoamperometria. O estudo espectrofotométrico foi efetuado objetivando definir a unidade de concentração enzimática a ser trabalhada na etapa eletroanalítica, através de ensaio da atividade catalítica da AChE frente ao substrato iodeto de acetiltiocolina, pelo método de Ellman [16]. Seguidamente o eletrodo caracterizado foi modificado e avaliado frente ao substrato, em meio de tampão fosfato. O potencial de trabalho foi definido e as diversas etapas de modificação foram avaliadas via voltametria cíclica. A melhor configuração foi definida a partir dos parâmetros cinéticos obtidos do gráfico duplo recíproco obtido em estudo eletroanalítico da cinética de Michaelis-Menten [17] e por estudo de repetitividade de sinal efetuado para todas as condições de modificações dos eletrodos. Seguidamente, foram traçadas curvas analíticas em meio de tampão e as respectivas regiões de linearidade foram selecionadas. Resultados Caracterização dos Eletrodos Impressos O eletrodo impresso de carbono selecionado contendo o composto meldola blue em sua superfície foi avaliado em solução de eletrólito, via voltametria cíclica, como apresentado na Figura 1. 3,0x ,0x ,0x ,6-0,4-0,2 Figura 1. Voltametria cíclica. Perfil voltamétrico do eletrodo impresso de carbono-meldola blue em meio de tampão fosfato ph 7,2. O meldola blue é um corante catiônico (C 18 H 15 ClN 2 O.xZnCl 2 ) de massa molar g/mol. A fórmula estrutural está apresentada na Figura 2.

3 Avaliação Espectrofotométrica. Figura 2. Fórmula estrutural do cátion meldola blue. Foi denotado pico de oxidação em mv relativo ao meldola blue contido na própria superfície do eletrodo de trabalho. O sinal de corrente se manteve estável após vários ciclos sucessivos. A superfície eletródica do sistema carbono-meldola blue apresentou sinal característico do mediador, em valores baixos de corrente, com comportamento eletródico semelhante a um eletrodo convencional de carbono, indicando ser um substrato passível de construção de um biossensor de monitoramento via mediador eletroanalítico, uma vez que o meldola blue apresentou valores de potenciais redox baixos, o que possibilita o monitoramento da atividade catalítica em níveis mínimos de interferentes oxidativos no meio. O meldola atua mediando os processos redox do meio, regenerando o sítio catalítico da enzima imobilizada o que torna o biossensor mais versátil. Na Figura 3 apresenta-se o comportamento voltamétrico do composto padrão ferricianeto de potássio sobre o eletrodo impresso, em meio de tampão fosfato ph 7,2. 8,0x10-5 4,0x ,0x ,0x ,2x ,4-0,2 0,2 0,4 0,6 Figura 3. Voltamograma cíclico do composto ferricianeto de potássio (5 µmoll -1 ) sobre o eletrodo de carbono meldola blue. Observa-se o par redox característico aos processos de oxidação e redução do composto. A razão de pico apresentada (Ipa/Ipc) para o sistema foi de 0,9998, sendo um valor próximo a unidade, indicando processos reversíveis sobre a superfície do eletrodo. Objetivando definir a unidade de concentração de enzima a ser aplicada na etapa eletroanalítica foi efetuado o estudo espectrofotométrico, com base na metodologia de Ellman, onde, a partir da reação entre o DTNB e a tiocolina formada da reação de catálise enzimática, o sinal de absorbância foi monitorado em 412 nm, avaliando-se a formação do composto amarelo. Foram efetuados ensaios em branco, testemunho e enzimático. As atividades ensaiadas foram: 1; 4; 6; 8; 0,10 e 0,20 U por cubeta (3000uL). O substrato foi adicionado por último, para início da reação de catálise. A Tabela 1 apresenta os volumes para o ensaio efetuado. Tabela 1. Volumes (µl) definidos para o ensaio da atividade catalítica via método de Ellman. Ensaio AChE PBS DNTB ATChI NaCl ph7,5 2,5µmol 2,35µmol 0,9% Branco Testemunho Enzimático O gráfico da Figura 4 apresenta as curvas de monitoramento da atividade catalítica da enzima AChE em solução frente ao substrato iodeto de acetiltiocolina, em função do tempo de reação. A estabilidade do sinal de absorbância referente à reação catalítica foi alcançada a partir da concentração 0,2 U de enzima, em tempos próximos de 180 s de catálise. A 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 branco testemunho 0.01 U 0.04 U 0.06 U 0.08 U 0.10 U 0.20 U Tempo / s Figura 4. Monitoramento do sinal de absorbância em função do tempo de reação de catálise enzimática. (AChE), λ=412 nm, L= 1 cm. Na Tabela 2 constam as inclinações das curvas de catálise enzimática em diferentes concentrações de enzima acetilcolinesterase. Estas inclinações representam as velocidades das reações para de formação do produto colorido, que é proporcional ao substrato hidrolisado.

4 Tabela 2. Curvas analíticas para as concentrações enzimáticas trabalhadas. U/cubeta equação R 1 Y= X*0061 0, Y= X*0244 0, Y= X*0408 0, Y= X*0521 0, ,10 Y = X*0688 0, ,20 Y = 0, X*1605 0,99999 Imobilização e Caracterização Eletroquímica. Para modificação do eletrodo de trabalho (carbono-meldola blue) com membrana de náfion foram gotejados 10 µl de solução água/etanol contendo náfion e enzima AChE, sendo o conjunto deixado em geladeira, a 4 C (overnight). Foram investigados biossensores modificados com teores de 1,0; 0,1 e 1% de náfion, com 0,2 unidades enzimáticas em tempos de monitoramento eletroanalítico de 60, 120 e 180 segundos de reação catalítica. O eletrodo foi avaliado frente ao substrato, em meio de tampão fosfato A Figura 5 apresenta a caracterização voltamétrica das etapas de construção do biossensor. -5 carbonomb/náfion/ache + ATChI 2,0x10 carbono + meldola blue carbonomb/náfion 1,0x10-5 carbono + ATChI -1,0x ,0x ,0x10-5 foi efetuado via técnica de cronoamperometria. O sinal analítico de oxidação do meldola blue foi tomado inicialmente para o biossensor em solução tampão fosfato, em ausência de substrato enzimático, sinal este definido como base e posteriormente foi avaliado o sinal em solução trabalho contendo concentração definida de substrato. Como apresentado no gráfico da Figura 6, o melhor potencial a ser aplicado para o biossensor foi de -250 mv, corroborando com os picos definidos na etapa de caracterização voltamétrica (Figura 5). I / µa Figura 6. Estudo do potencial de trabalho cronoamperométrico. Este potencial de trabalho foi suficiente para diferenciar o sinal de corrente entre a solução de tampão e a solução contento o substrato iodeto de acetiltiocolina, como demonstrado na Figura 7. Esta diferença de sinal foi proporcional à concentração de substrato na solução. -4,0x ,5-0,4-0,3-0,2-0,1 E / V vs Ag/AgCl -1,0x10-6 Figura 5. Caracterização voltamétrica das etapas de construção do biossensor amperomátrico. Observa-se ausência de sinal de corrente de pico para o voltamograma relativo ao ensaio efetuado em eletrodo contendo somente carbono. Para a configuração com eletrodo impresso carbono meldola-blue e náfion, sem a presença da enzima, também não foi observado pico característico, sendo que este foi denotado somente quando o conjunto carbono-meldola blue/náfion/ache esteve presente frente ao substrato enzimático em solução. O potencial de trabalho observado para o medidor foi próximo do sinal deste mesmo composto em solução e o sinal analítico foi bastante distinto entre o sinal de base (tampão) e o sinal de monitoramento (substrato enzimático). O monitoramento da reação de catálise da enzima imobilizada sobre o eletrodo de trabalho -2,0x ,0x ,0x ,0x10-6 Tampão fosfato ph 7,2 substrato enzimático Figura 7. Sinal cronoamperométrico de monitoramento catalítico. Para etapa de otimização foram investigados biossensores modificados com teores de 1,0; 0,1 e 1% de náfion, com concentração enzimática fixa (0,2 U), em tempos de monitoramento eletroanalítico de 60, 120 e 180 segundos de reação catalítica. A melhor configuração foi definida a partir dos parâmetros

5 cinéticos obtidos do gráfico duplo recíproco obtido em estudo eletroanalítico da cinética de Michaelis-Menten, para a catálise da hidrólise do substrato e por estudos de repetitividade de sinal efetuados para todas as condições de modificações dos eletrodos. A Figura 8 apresenta as curvas analíticas para o eletrodo de carbono meldola blue modificado com 0,1% de náfion, relativas aos tempos avaliados. 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 Y=0, X R=0,996 Y=0, X R=0,997 Y=0, X R=0,994 60s 120s 180s 0, Tempo / s Figura 8. Curvas analíticas de monitoramento da reação de catálise da hidrolise do iodeto de acetilcolina pelo tempo de reação. Eletrodo carbono-meldola blue/náfion/ache. A partir destes dados foram traçadas as curvas para os gráficos de lineweaver-burk. Levou-se em consideração a corrente obtida como uma medida direta da reação catalítica. De acordo com este gráfico de cinética, a intersecção da reta no eixo Y indica o valor de 1 e o ponto que toca o eixo X,. A I inclinação da reta é K m I. 1 Km 1/ I(µA -1 ) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 60s Y=0, ,6497X R=0, / [ATChI] (µm -1 ) Figura 9. Gráficos de lineweaver-burk para o biossenor com 0,1% de náfion em tempo de 60 s de monitoramento da atividade catalítica. Para complementação da otimização do biossensor amperométrico, um estudo de repetitividade de sinal analítico de corrente foi efetuado com todas as condições de construção do biossensor (n=5). A partir dos estudos cinéticos e de repetitividade, pode se definir a melhor configuração para o biossensor enzimático, sendo: 0,1 % de náfion como solução de imobilização, 0,2 U de unidade de concentração enzimática e 60 s de catálise enzimática. Esta configuração apresentou melhores parâmetros cinéticos analíticos, sendo: K m =100,56 µmol e V = 4,6, bem como 1,7% de coeficiente de variação e maior valor de corrente amperométrica. A Tabela 3 apresenta os dados relativos ao ensaio. A equação que descreve o fenômeno é a seguinte: app 1 1 Km = + I I I C ss Onde, Iss é a corrente estacionária após a adição do substrato, C a concentração do substrato na solução trabalho e I o máximo de corrente medida sobe condições de saturação do substrato (corresponde a V). A Figura 9 apresenta o gráfico de Lineweaver- Burk para obtenção dos parâmetros cinéticos.

6 Tabela 3. Dados numéricos relativos ao ensaio de repetitividade de sinal analítico e do estudo cinético. náfion 1% náfion 0,1% náfion 1% Tempo /s Media de corrente/µa 2,701 2,239 2,117 3,164 2,663 2,512 1,133 1,939 0,999 Desvio Padrão 97 0,118 0, , Coeficiente de Variação/% 3,6 5,3 6,9 1,7 3,2 3,0 9,2 2,9 5,8 Constantes Km/µMol 48,6 57,8 69,1 100,6 75,9 78,0 67,8 50,7 44,0 Conclusão O eletrodo impresso baseado em carbono previamente modificado com meldola blue se constitui uma plataforma versátil para construção de biossensores de acetilcolinesterase, uma vez que o mediador eletroanalítico forneceu um baixo potencial para monitoramento da atividade catalítica da enzima, que manteve de forma satisfatória a sua atividade quando imobilizada em membrana de náfion. O biossensor pode ser utilizado em estudos de inibição de AChE, como nos casos de detecção de pesticidas ou de atividade anticolinesterase em extratos de plantas. Agradecimentos: CNPq. [8] A. J. Cunningham. Introduction to Bioanalytical Sensors. New York: Wiley,1998. [9] K. R. Rogers. Analytica Chimica Acta, Vol, 568, pp , [10] P. R. Mathewson, J. W. Finley- Biosensors Design and Application. Washington: ACS, [11] P. R. B. O. Marques, G, S. Nunes, T. C. R. Santos, S. Andreescu, J. L. Marty. Biosensors and Bioelectronics, Vol. 20, pp , [12] P. R. B. O. Marques, H. Yamanaka. Química Nova. Vol, 31, pp , [13] P. R. B. O. Marques, C. V. V. C. O. Marques, G. S. Nunes. Pesticidas (UFPR), Vol 16, pp.81-92, Referencias [1] J. Janata, M. Josowicz, M. Devaney, Analytical Chemistry. Vol 66, pp , [2] V. B. Nascimento, L. Angnes, Quimica Nova. Vol 21, pp , [3] J. Castillo, et al. Sensors and Actor B. Vol 102, pp , [4] R. O. Kadara, N. Jenkinson, C. E. Banks, Sensors and Actor B. Vol, 138, pp , [5] M. Cortina-Puig, X. Muñoz-Berbel, R. Rouillon, C. Calas-Blanchard, J. L. Marty. Bioelectrochemistry, Vol 76, pp.76 80, [14] A. Galenowska, T. Sikora, G. Istamboulie, M. Trojanowicz, I. Polec, G. S. Nunes, T. Noguer, J. L. Marty. Sensors And Materials. Vol, 20, pp , [15] A. K. Mauritz, R. B. Moor. Chemical Review. Vol, 104, pp , [16] G. L. Ellman, et al. Biochemistry Pharmacology, Vol 7, pp.88-95, [17] C. Fini, A. Floridi, V. N. Finelli, B. Wittman-Liebold, Laboratory Methodology In Biochemistry. Boca Raton: CRC press, [6] A. E. Radia, X. Munoz-Berbel, M. Cortina-Puig, J. L. Marty. Electrochimica Acta, Vol 54, pp , [7] P. G. Edelman, J. Wang. Biosensors & Chemical Sensors. Washington: ACS,1992.