NATHÁLIA WANDERLEY BUENO

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1 NATHÁLIA WANDERLEY BUENO VARIABILIDADE E DESEMPENHO FORENSE DE MICROSSATÉLITES UTILIZADOS NA VERIFICAÇÃO DE PARENTESCO DO PLANTEL BRASILEIRO DE CAVALO PURO SANGUE INGLÊS (PSI) Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação Strictu Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnolgia. Orientador: Doutor Dario Grattapaglia Co-orientador: Doutor Márcio Elias Ferreira Brasília 2010

2 B928v Bueno, Nathália Wanderley. Variabilidade e desempenho forense de microssatélites utilizados na verificação de parentesco do plantel brasileiro de cavalo puro sangue inglês (PSI) / Nathalia Wanderley Bueno f.: il. ; 30 cm. Dissertação (mestrado) Universidade Católica de Brasília, Orientação: Dario Grattapaglia. Ficha elaborada pela Coordenação de Processamento do Acervo do SIBI UCB.

3 TERMO DE APROVAÇÃO Dissertação de autoria de Nathália Wanderley Bueno, intitulada VARIABILIDADE E DESEMPENHO FORENSE DE MICROSSATÉLITES UTILIZADOS NA VERIFICAÇÃO DE PARENTESCO DO PLANTEL BRASILEIRO DE CAVALO PURO SANGUE INGLÊS (PSI), apresentada como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 24 de Agosto de 2007, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: Prof. Dr. Dario Grattapaglia Orientador Professor do Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia - UCB Prof. Dr. Márcio Elias Ferreira Co-orientador Professor do Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia - UCB Dr. Samuel Rezende Paiva Pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos - Cenargen Prof. Dr. Alexandre Siqueira Guedes Coelho Professor do Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas - UFG Brasília 2010

4 Ao meu pai Eduardo (in memorian), à minha mãe Gilberta e irmão Vinícius pela educação e incentivo Dedico

5 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Dario Grattapaglia pela orientação técnica, disponibilidade e auxílio que me ajudaram na realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Márcio Elias Ferreira pela co-orientação e apoio. Aos amigos da HERÉDITAS/GENOMAX, Mônica, Polys, Claudinha, Carol, Maria, Zilma, Saulo e Ronaldo pelo auxílio na geração dos dados e segurar a barra em momentos de ausência. Ao André, Milítize e Sandra pela organização dos dados cadastrais dos animais. Ao Josias, Tânia e Ellen pela amizade. Ao Adriano pela criação do DNAGRO e geração das simulações. À ABCPCC pela coleta das amostras de sangue e organização de dados dos plantéis de PSI do Brasil. Aos amigos do Cenargen, Eva, Marília e Isabela pela amizade e ajuda quando foi necessário. Aos professores da UCB pelas instruções teóricas necessárias à realização deste trabalho. Aos técnicos de laboratório da UCB André e Willian, pela ajuda na geração de dados. Aos amigos da Pós-Graduação da UCB em especial Túlio, Breno, Érika e André. Ao CNPq pela bolsa de estudos. Aos meus familiares que me apoiaram nos meus projetos, em especial minha mãe Gilberta e meu irmão Vinícius. Ao meu pai Eduardo que com certeza estaria muito orgulhoso de mim. Ao Alexandre pelo estímulo, amizade e amor. Aos amigos, Gui, Pritt, Aline, André, Driano, Marcelo, Rê e as Jaques. À Deus por estar sempre ao meu lado. A todos que de forma direta ou indireta contribuíram de maneira relevante para a elaboração deste trabalho.

6 RESUMO A raça de cavalos Puro Sangue Inglês (PSI) é derivada de uma base genética consideravelmente restrita envolvendo poucos garanhões fundadores apresentando hoje uma diversidade alélica reduzida em comparação a outras raças de cavalos. Animais PSI demandam, entretanto, um rigor elevado no controle genealógico tendo em vista se tratar de uma raça internacional com ampla comercialização de animais, na qual o Brasil tem importante participação. Neste trabalho foi avaliado em detalhe o desempenho forense de uma bateria de 17 locos microssatélites amplamente utilizados, incluindo os nove marcadores recomendados pela International Society of Animal Genetics (ISAG), bem como a bateria de 13 locos TKY recentemente desenvolvida e incluída no exercício de comparação da ISAG de Para a investigação do desempenho das baterias de marcadores, foram analisadas amostras de 597 éguas (PSI 597) e 142 garanhões (PSI 142) utilizados na geração do plantel brasileiro de cavalos PSI nascidos em 2004 e Ambas as baterias apresentaram múltiplos alelos e alta heterozigosidade e alcançaram um Poder de Exclusão (PE) acima de 99,95%. Para os locos TKY foi detectada uma pequena mas significativa redução de heterozigosidade devido a cruzamentos aparentados. O conjunto de nove locos internacionalmente recomendados pela ISAG alcançou um PE bem inferior àquele das baterias mais amplas seja em PSI bem como em outras raças de cavalos brasileiros. Em 23 trios analisados, nos quais duas inconsistências de transmissão alélica foram originalmente observadas, não foram observadas outras exclusões ao se analisar uma bateria adicional de 13 locos TKY o que corroborou as declarações originais de qualificação dos produtos. Estes resultados dão suporte experimental ao procedimento adotado no laboratório de declarar uma qualificação mesmo na presença de duas exclusões isoladas. Resultados de simulações indicam, entretanto, que este procedimento somente pode ser adotado com segurança ao se utilizar baterias mínimas de 15 a 16 locos ISAG e no caso de duos este procedimento é praticamente inviável a menos que baterias super expandidas de microssatélites sejam utilizadas. Recomendações de quais e quantos locos utilizar para a análise genética em raças eqüinas dependem de vários fatores. Simples comparações entre baterias de microssatélites devem ser vistas como procedimentos ad-hoc pois soluções alternativas podem sempre ser apresentadas variando quantos e principalmente quais locos utilizar. Os resultados deste trabalho sugerem que baterias de 13 locos TKY ou baterias de 14 locos selecionados envolvendo os nove locos ISAG obrigatórios, locos complementares e um loco TKY mais informativo, permitem alcançar um PE acima de 99,95%, limite este internacionalmente recomendado pelo ISBC (International Studbook Committee). As análises realizadas neste trabalho indicam por fim que os nove marcadores recomendados internacionalmente pela ISAG são insuficientes para uma adequada exclusão de paternidade em cavalos PSI. Além disso, a bateria de locos TKY constitui uma excelente ferramenta para a resolução de questões mais complexas de parentesco envolvendo supostos garanhões geneticamente relacionados ou quando exclusões isoladas são observadas nos painéis de microssatélites de rotina. Palavras-Chave: Puro Sangue Inglês, microssatélites, desempenho forense.

7 ABSTRACT Thoroughbred horses (TB) is a breed derived from a considerably narrow genetic base involving a few founder stallions, displaying today a reduced allelic diversity when compared to other horse breeds. TB animals, however, demand a very high rigor in the genealogical control in view of its international reputation and ample worldwide trading in which Brazil plays an ever increasing role. In this study the forensic performance of a large set of microsatellite markers was evaluated including the nine ISAG recommended loci, 8 widely used complementary loci and the newly proposed battery of TKY markers validates in the ISAG comparison trials. The forensic performance was evaluated in two samples of Brazilian PSI, one made up of 142 stallions (PSI 142) and the other of 597 mares (PSI 597) that took part in the generation of foals in Markers in both sets showed ample allelic diversity and high heterozygosity and both loci sets reached a Power of Exclusion (PE) greater than 99,95%. For the TKY loci a very small but significant inbreeding was detected. The nine locus set recommended by ISAG as a minimum set reached a significantly lower PE not only in TB but also in other more diverse horse breeds raised in Brazil. In 23 paternity tests involving both parents and foal in which two isolated inconsistencies in allelic transmission were observed no further exclusions were detected after testing the 13 TKY locus set, therefore validating the original conclusion of qualification. These results provide experimental support to the procedure adopted in our lab to declare a foal as positively qualified as progeny of the tested stallion even when two isolated genotype inconsistencies are observed. Results of a simulation study indicate however, that such a procedure can only be adopted in complete trios when minimum sets of 15 ISAG markers are used and that this procedure is not viable when the dam is not tested, unless very large sets of microsatellites, over 30, are used. Recommendations about how many and which markers use in horse parentage testing depend on many factors. Simple comparisons among common sets of microsatellites should be seen as ad-hoc approaches as alternative solutions can always be suggested varying how many and which loci are used. The results of this study also suggest that sets including 13 TKY loci or sets of 14 loci including the nine recommended by ISAG, complementary markers and a highly informative TKY locus can reach a PE above 99.95%, the ISBC (International Studbook Committee) recommended threshold. The analyses carried out also show that the nine ISAG markers are not sufficient for an adequate paternity exclusion in TB horse. Furthermore the TKY set of markers constitutes an excellent tool for the resolution of more complex situations involving genetically related stallions or when isolated exclusions are detected in routine parentage testing. Key words: Thoroughbred, microsatellites, forensic performance

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Os três garanhões fundadores da raça Puro Sangue Inglês, Darley Arabian (à esq.), Goldolphin Arabian (meio), Byrley Turk (à dir.) Figura 2. Exemplar típico de Puro Sangue Inglês Figura 3. Cartão de coleta HEREDITAS/GENOMAX com identificação de código de barras Figura 4. Conjunto de 15 locos TKY distribuídos em três multiplexes de acordo como o arranjo descrito por Tozaki et al. (2001a). Cada multiplex é formado por cinco locos, com diferentes faixas de tamanho de alelos, marcados com uma única fluorescência. Os três multiplexes podem ser carregados e analisados simultaneamente no seqüenciador automático Figura 5. Conjunto de 17 locos (ISAG + complementação) distribuídos em três multiplexes de acordo como o arranjo descrito por Ribeiro et al. (2005) Figura 6. Eletroferogramas de DNA amplificado utilizando a bateria de 15 marcadores TKY, detectados em eletroforese no seqüenciador ABI377XL. Painel superior - Amostra controle do exercício ISAG amplificado com os 15 marcadores TKY. Os locos em azul, verde a amarelo estão marcados respectivamente com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED da Applied Biosystems. Painel inferior Análise de transmissão alélica em trio. Somente os locos marcados em amarelo estão apresentados Figura 7. Eletroferogramas da análise de uma amostra de DNA com os três multiplexes envolvendo a bateria de nove marcadores microssatélites, recomendados pela ISAG, e oito marcadores adicionais, no seqüenciador ABI377XL. Painel A - Multiplex A formado por oito locos (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, HMS6, HTG7 e HMS3). Painel B - Multiplex A formado por oito locos (AHT39, UM011, AHT29, UM010, HMS6, UCDEQ425, HTG7 e UCDEQ405). Painel C - Multiplex C formado por quatro locos (AHT5, HMS6, HTG10 e ASB2). Os locos em azul, verde a amarelo estão marcados com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED da Applied Biosystems Figura 8. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para 17 locos microssatélites utilizados em rotina nas raças eqüinas, Crioulo, Campolina e Puro sangue Inglês (PSI). Duas amostras populacionais da raça PSI estão representadas. As cores dos histogramas correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático Figura 9. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para os 9 locos microssatélites recomendados pela ISAG em planteis de Puro Sangue Inglês no Brasil (PSI 597 e PSI 142), Eslováquia e Coréia. Não foram incluídos na análise os locos AHT4, AHT5 e HTG10 para a população de PSI da Eslováquia pois estes não haviam sido estudados no trabalho de referência. As cores dos histogramas

9 correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático Figura 10. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para os 13 locos microssatélites TKY em planteis de Puro Sangue Inglês no Brasil (PSI 142) e do Japão (PSI JP 250). As cores dos histogramas correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático Figura 11. Distribuição de freqüência de exames em trios completos nos quais o garanhão seria excluído com números crescentes de locos diagnósticos de exclusão ao se utilizar baterias de 11 até 16 marcadores microssatélites ISAG Figura 12. Distribuição de freqüência de exames em duos (sem a participação da genitora) nos quais o garanhão seria excluído com números crescentes de locos diagnósticos de exclusão ao se utilizara baterias de 11 até 16 marcadores microssatélites ISAG Figura 13. Poder de Exclusão de paternidade estimado por simulações, considerando a exigência de observação de pelo menos 3 locos diagnósticos de exclusão ao se testar baterias crescentes de locos no exame em animais PSI. São apresentadas as situações de exames de duo (ausência de um dos genitores) e trio completo....97

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Bateria de 15 marcadores microssatélites TKY. Os multiplexes cujos locos são detectados nas fluorescências azul, verde e amarela são compostos por 5 locos cujos primers diretos são marcados no terminal 5 com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED, respectivamente Tabela 2. Bateria de 17 marcadores microssatélites, incluindo os nove marcadores recomendados pela ISAG indicados com *. (MPX = multiplex; n.d = não disponível) Tabela 3. Número de alelos por loco (A) e distribuição de freqüências alélicas em 13 microssatélites TKY baseados em uma amostra de 142 garanhões do plantel brasileiro de PSI. Os alelos foram identificados por letras alfabéticas de acordo com a nomenclatura recomendada pelo ISAG Tabela 4. Número de alelos por loco (A) e distribuição das freqüências alélicas em 17 microssatélites ISAG, baseados em duas amostras de animais PSI, 142 garanhões (PSI 142) e 597 éguas (PSI 597) Tabela 5. Parâmetros genéticos de desempenho dos 17 microssatélites estudados para a investigação de individualidade genética e de paternidade em duas populações de PSI; estimativas de coeficiente de endocruzamento (Fis) e p valor do teste exato para Equilíbrio de Hardy Weinberg. ( # Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total) Tabela 6. Teste exato de Fisher para equilíbrio de ligação de locos dois a dois. Todos os pares de locos na tabela apresentaram valores significativos com a correção de Bonferroni (α = 0,00036) Tabela 7. Parâmetros genéticos de desempenho forense dos 13 microssatélites TKY estimados na amostra de 142 garanhões PSI brasileiros e comparação com uma amostra populacional de 250 PSI japonês; estimativas de coeficiente de endocruzamento e teste para Equilíbrio de Hardy Weinberg ( # Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total) Tabela 8. Parâmetros de desempenho forense e paternidade de três diferentes baterias de marcadores microssatélites na população PSI Tabela 9. Parâmetros genéticos de desempenho dos 17 microssatélites (ISAG+Complementação) em três raças de eqüinos; estimativas de coeficiente de endocruzamento (Fis) e pvalor do teste para Equilíbrio de Hardy Weinberg (# Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total) Tabela 10. Comparação de parâmetros forenses, heterozigosidades e número de alelos/loco de duas baterias de marcadores microssatélites: 9 locos ISAG (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, HTG10, ASB2) e 17 locos sendo os 9 ISAG + 8 de complementação (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, HMS6, HTG7, HMS3, AHT5, HTG10, ASB2, AHT39, UM011, AHT29, UM011,

11 UCDEQ425, UCDEQ405), em três raças de eqüinos criadas no Brasil (CRI Crioulo; CAM Campolina; PSI Puro Sangue Inglês) Tabela 11. Poder de exclusão de cada loco individualmente e dos locos combinados para os locos 17 ISAG na presença de parentesco entre garanhões testados, estimados com base nas amostras de animais PSI 597 e PSI Tabela 12. Poder de exclusão de cada loco individualmente e dos locos combinados para os locos TKY na presença de parentesco entre garanhões testados, para estimado com base na amostra de 142 garanhões PSI brasileiros Tabela 13. Poder de exclusão de cada loco individualmente e dos locos combinados para a bateria de rotina envolvendo nove locos ISAG, quatro locos complementares e um loco TKY na presença de parentesco entre garanhões testados, para estimado com base na amostra de 142 garanhões PSI brasileiros Tabela 14. Genótipos de 23 trios testados nos quais foram observadas duas inconsistências isoladas de transmissão alélica na bateria de 17 locos testados e em seguida complementados com 13 locos TKY. Os locos nos quais foi detectada uma inconsistência estão destacados em cinza Tabela 15. Comparação das estimativas de Poder de Exclusão de paternidade para 17 locos microssatélites incluindo os locos ISAG

12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA História e origem da raça Puro Sangue Inglês Registros genealógicos da raça Puro Sangue Inglês Verificação de parentesco em eqüinos via tipagem sangüínea Marcadores microssatélites em eqüinos Marcadores microssatélites para identificação e parentesco em eqüinos OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS Coleta de amostras e extração de DNA Utilização de multiplexes de locos microssatélites TKY Banco de dados e desempenho forense dos locos TKY Desempenho forense dos locos ISAG e verificação de parentesco em PSI brasileiro Análise genética comparativa do PSI brasileiro com PSI de outros países e outras raças Estimativa do poder de exclusão em situações de parentesco Análise de locos complementares em casos de inconsistências (exclusões) isoladas Estimativa de PE realizado e simulações de exames de exclusão RESULTADOS Banco de dados dos locos microssatélites TKY Banco de dados de freqüências alélicas dos locos ISAG Diversidade genética e desempenho forense dos locos ISAG e TKY e comparações Comparações de PSI brasileiros com PSI de outros países e outras raças criadas no Brasil Estimativa do poder de exclusão em situações de parentesco entre garanhões Análise de locos complementares em casos de inconsistências (exclusões) isoladas Estimativas de PE realizado e simulações de exames de exclusão DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

13 10 1. Introdução A identificação individual e determinação de vínculo genético é rotina nos serviços de registro genealógico de animais domésticos e está sendo aplicada de forma crescente nos programas de melhoramento genético animal em diversos países do mundo. A utilização de marcadores genéticos para a verificação de parentesco foi adotada nos serviços de registro de raças de cavalos nos anos 60 após os trabalhos pioneiros de Stormont e Suzuki (1964, 1965) os quais descreveram a herança e alelismo de 16 fatores sangüíneos identificados em cavalos. Por aproximadamente três décadas, estes sistemas envolvendo grupos sangüíneos e variantes protéicos vêm sendo utilizados com sucesso. Esses testes, embora rápidos e baratos requerem o uso de sangue fresco, apresentam poder de discriminação limitado e demandam a produção de reagentes biológicos in vivo, processo complexo e pouco accessível. Embora ainda estejam sendo utilizados, a transição para a utilização exclusiva de marcadores de DNA é hoje considerada irreversível. Nos últimos 15 anos, metodologias de análise de polimorfismos genéticos baseadas em variações de seqüências no DNA usando a tecnologia da PCR (Polymerase Chain Reaction) forneceram alternativas à tipagem sangüínea em cavalos, particularmente a análise de polimorfismos de microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats) (Bowling et al., 1997). A análise de microssatélites hipervariáveis fornece hoje a mais alta precisão na identificação genética em seres vivos, constituindo uma ferramenta indispensável de certificação de qualidade genealógica de produtos nos programas de registro genealógico. Muitas são as vantagens dos testes de DNA em relação à tipagem sangüínea, entre elas a possibilidade de se utilizar para exame não somente amostras de sangue, mas também sêmen, bulbos de pêlos e outros tecidos, ampliando as possibilidades de verificação de identidade ou parentesco para situações de investigação forense animal. A genotipagem do DNA de animais se baseia na determinação do genótipo multilocal para um conjunto de marcadores co-dominantes microssatélites no DNA analisados em eletroforese de alta

14 11 resolução, tipicamente em seqüenciadores automáticos. Com base nestes genótipos é definido um perfil de DNA único, altamente discriminativo, comumente chamado de impressão digital de DNA. Este perfil genético pode ser utilizado, entre outros, para: (a) Verificação de paternidade e maternidade para registro genealógico de animais; (b) Registro de animais importados cujos pais somente possuem tipagem de DNA; (c) Controle de qualidade de programas de inseminação artificial e transferência de embrião; (d) Determinação de paternidade em sistemas de cruzamento com múltiplos reprodutores; (e) Estimativa de distância genética entre animais para introgressão de nova variabilidade ou planejamento de cruzamentos; (f) Suporte ao melhoramento para estimativas de valor de melhoramento de animais elite; (g) Certificação e controle de qualidade de sêmen. Várias centenas de marcadores microssatélites foram publicados para eqüinos nos últimos 15 anos (ex. Ellegren et al., 1992; Binns et al., 1995; Tozaki et al., 2004). A Sociedade Internacional de Genética Animal (ISAG - International Society of Animal Genetics), no sentido de facilitar o intercâmbio e comparação de resultados de genotipagem entre laboratórios vem recomendando um conjunto básico de nove marcadores microssatélites para raças eqüinas. A definição destes nove marcadores ocorreu de forma ad hoc com base em alguns poucos relatos da literatura (ex. Bowling et al., 1997) e experiência de alguns poucos laboratórios (Veterinary Genetics Laboratory US Davis), procurando atender a esta demanda específica e sem planejamento prévio ou avaliações mais aprofundadas sobre a robustez analítica ou conteúdo informativo dos nove marcadores. No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), ciente da necessidade de evolução e adequação dos Serviços de Registros Genealógicos das diversas associações brasileiras de criadores aos padrões internacionais, deliberou acerca da regulamentação das normas a serem adotadas nos serviços de análise de DNA. O MAPA, através da Instrução Normativa nº 74 de 20 de outubro de 2004 ( que estabelece as normas para credenciamento de laboratórios de tipagem de DNA animal, definiu a utilização de no mínimo nove marcadores microssatélites (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, ASB2 e HTG10) para identificação individual e

15 12 determinação de vínculo genético em eqüinos no Brasil. Estes marcadores são os mesmos recomendados pela ISAG para verificação de paternidade e maternidade em eqüinos ( Alguns marcadores adicionais tais como ASB17, ASB23, LEX33, HMS2, HTG6 e HTG7, vêm também sendo utilizados por diversos laboratórios participantes da ISAG para a complementação de genotipagem em casos especiais. Nos últimos anos, a robustez analítica dos nove marcadores adotados pela ISAG vem sido avaliada em testes comparativos envolvendo dezenas de laboratórios no mundo com um grau considerável de concordância entre os laboratórios. Embora a bateria de nove marcadores forneça um poder de exclusão mais elevado do que a bateria de marcadores de grupos sangüíneos e polimorfismos protéicos tradicionalmente utilizados, ainda assim em raças eqüinas que se caracterizam por elevada consangüinidade, marcadores adicionais freqüentemente se fazem necessários para atingir um poder de exclusão de paternidade (ou maternidade) (PE) efetivo maior do que 99,99%. No caso específico da raça Puro Sangue Inglês (PSI), derivada de uma base genética consideravelmente restrita, um forte efeito fundador de apenas três garanhões no século XVII (veja histórico a seguir), e um sistema de acasalamentos consangüíneos deliberado, a reduzida variabilidade alélica mesmo a locos microssatélites tem sido documentados em algumas publicações recentes (Cunningham et al., 2001; Tozaki et al., 2001a; Lee e Cho, 2006). Conjuntos de marcadores microssatélites relativamente bem estabelecidos vêm sendo utilizados em diversos laboratórios do mundo. Entretanto quais e quantos microssatélites devem ser utilizados ainda é uma questão debatida no âmbito do grupo de trabalho de eqüinos da ISAG. As principais considerações para a seleção de microssatélites são a sua robustez para análise em rotina, o seu poder de exclusão e a estrutura genética e histórico evolutivo da raça em questão. Os resultados disponíveis na literatura sugerem que o número adequado de marcadores deverá ser maior do que os nove recomendados pela ISAG, principalmente para raças com maior nível de consangüinidade. Quais os marcadores a serem utilizados torna-se uma questão mais complexa, pois passa por uma avaliação mais detalhada do nível de diversidade alélica e as freqüências relativas na raça em questão. Um loco

16 13 que é geneticamente mais informativo para uma raça pode não o ser para outra. Outra consideração importante do ponto de vista prático é a possibilidade de se combinar os diferentes locos de forma eficiente em uma mesma reação de PCR com o objetivo de maximizar a geração de dados por unidade de tempo reduzindo o número e reações de PCR e análises eletroforéticas necessárias para concluir a tipagem de um animal. Finalmente, a definição de quais locos utilizar deve ainda respeitar uma recomendação internacional de forma a permitir a comparação de dados entre diferentes laboratórios e a utilização de tipagens feitas em diferentes países para fins de verificação de parentesco. Uma questão relevante ao se realizar exames de paternidade e maternidade em populações subestruturadas ou com forte histórico de cruzamento aparentados é o risco de declaração de falsas inclusões, ou seja, qualificar um determinado produto como sendo filho de um suposto genitor ou genitora quando na verdade o genitor não é o pai ou mãe biológico(a) do produto. Este risco, embora pequeno, se torna maior em situações nas quais o verdadeiro pai biológico é aparentado do suposto pai testado. O poder estatístico de um loco para análise de paternidade é geralmente avaliado pelo poder de exclusão (PE), ou seja, a probabilidade do loco excluir da paternidade um indivíduo tomado ao acaso da população que foi erroneamente apontado como pai (Weir, 1996). A expressão que calcula PE assume que o macho tido como suposto pai foi tomado ao acaso da população e de que outros machos que eventualmente estejam competindo pela paternidade sejam também uma amostra ao acaso de uma população panmítica. No caso de eqüinos de raças consangüíneas, uma fonte importante de subestruturação de população que leva à violação da premissa de panmixia ocorre justamente quando dois ou mais garanhões geneticamente relacionados, irmãos, pai-filho ou mesmo primos, são testados como supostos pais em uma verificação de paternidade. Nestes casos a estimativa de PE para um determinado loco será superestimada, pois nestas circunstâncias o poder de exclusão será consideravelmente menor do que o esperado pela premissa de panmixia (Jeffreys e Pena, 1993). Com isso as estimativas da probabilidade de excluir todos os demais machos com

17 14 exceção do pai verdadeiro hoje existente na literatura para eqüinos devem ser consideradas, em geral, superestimadas. Além disso, a real probabilidade de exclusão é afetada não apenas pela presença de um segundo macho geneticamente relacionado, mas também pelo número total de machos relacionados existentes que competem pela paternidade. Quanto maior o número de machos competindo pela paternidade, maior a probabilidade de um deles ser erroneamente declarado como sendo o verdadeiro pai (Double et al., 1997; Sherman et al., 2004). Um segundo aspecto freqüentemente levantado em exames de parentesco com microssatélites é a ocorrência de exclusões isoladas, isto é, exclusões em apenas um loco do conjunto total de locos analisados. A recomendação internacional nestes casos é a declaração de uma inclusão e a informação da inconsistência alélica encontrada, tendo em vista que eventos desta natureza podem ser explicados por mutações ou ocorrência de alelos nulos devido a mutações que impedem a amplificação de alelos ao loco sob análise (Chakraborty e Stivers, 1996). Ocorrências de inconsistências isoladas foram relatadas em eqüinos, e estimativas de taxa de mutação da ordem de 0,01 a 0,02% por geração foram relatadas para os locos AHT4 e HTG10 (Bowling et al., 1997). Em seres humanos, onde um grande número de exames de paternidade vem sendo realizado no mundo em diversos laboratórios, já foram relatados casos de duas incompatibilidades isoladas em exames nos quais de fato o suposto pai era o pai biológico e as mutações confirmadas (Gunn et al., 1997; Grattapaglia com. pess.). Um estudo em humanos baseado na bateria internacionalmente recomendada de 13 microssatélites e as respectivas taxas de mutação relatadas na literatura, relatou resultados interessantes a este respeito (Calafell, 2000). Em casos de falsa paternidade, exclusões são declaradas, em média, 7,65 locos excludentes dos 13 analisados. A freqüência de casos de falsa paternidade com a observação de apenas uma exclusão foi estimada em 0,0108% ou seja um caso a cada e com duas exclusões em 0,14% ou seja 1 caso a cada 704. Considerando, por outro lado, casos de paternidade verdadeira e a ocorrência de mutações, em 4,85% dos casos foi observada uma exclusão isolada derivada de mutação e em 0,11% ou seja, 1 caso a cada 936 foram observadas duas

18 15 exclusões isoladas oriundas de mutações. Em outras palavras, a probabilidade de ocorrência de duas mutações na análise de 13 marcadores é relativamente alta principalmente se um grande número de exames é realizado. Tomando agora situações nas quais o suposto pai testado era irmão do verdadeiro pai biológico, o número médio de locos excludentes caiu de 7,65 para apenas 3,89 e em 0,98% ou seja, em cerca de 1 caso a cada 100, nenhuma exclusão foi observada (Calafell, 2000). Em eqüinos ainda não foram relatados casos de mais de uma inconsistência alélica isolada em exames de paternidade, embora tendo em vista o grande número de exames realizados atualmente, isso seja possível. A questão que fica em populações endocruzadas de cavalos PSI é como proceder em exames nos quais são observadas apenas duas exclusões isoladas. Tendo em vista o alto nível de endocruzamento em PSI, estimado em 0,13 em uma amostra de 211 cavalos (Cunningham et al., 2001), espera-se que em casos de falsa paternidade poucos locos excludentes sejam observados gerando, portanto, uma situação de dúvida: trata-se de fato de uma real exclusão ou de uma ocorrência de mutações? Bowling et al. (1997) estudando cavalos Quarto de Milha declararam exclusão mesmo observando apenas duas exclusões isoladas. Embora esta em geral tenha sido a prática em laboratórios que realizam exames de paternidade, a ISAG tem recomendado que nestes casos seja analisada uma bateria complementar de locos visando identificar exclusões adicionais e com isso aumentar a confiabilidade da declaração da exclusão (Binns et al., 1995). Mutações em locos comumente utilizados em exames de paternidade de eqüinos têm sido descritos, mas ainda de forma muito incipiente. Eggleston-Stott et al. (1997a) descreveram perda ou baixa eficiência no anelamento do primer HMS7 devido a transversão de C para A, resultando em alelo nulo. Neste caso, o alelo não é detectável no produto da PCR e um aparente homozigoto é observado o qual pode ser erroneamente interpretado como uma transmissão não mendeliana (Callen et al., 1993). Guérin et al. (1994) observaram anteriormente, uma aparente transmissão não mendeliana no loco HMS7 em cavalos quarto de milha, na qual uma égua foi excluída como genitora de dois produtos, baseado no fato de todos os três animais apresentaram genótipos homozigotos para o loco sem o compartilhamento de um

19 16 alelo em comum. Como a égua foi qualificada genitora em outros 20 locos, foi levantada a suspeita de baixo rendimento da detecção do produto da PCR. Achmann et al. (2001) revelou que incorretas exclusões foram interpretadas devido a identificação errônea de alelos em genótipos particulares. Estes erros ocorreram porque os alelos M do marcador HMS3 e L do marcador ASB2 foram fracamente amplificados e assim não pode ser distinguido do stutter do alelo N (HMS3) e M (ASB2), respectivamente. Nestes casos, exclusões baseadas em observações de genótipos homozigotos para diferentes alelos entre produto de suposto genitor devem ser considerados com cautela. Este trabalho teve por objetivo avaliar em detalhe o desempenho de uma ampla bateria de marcadores microssatélites para verificação de parentesco em cavalos Puro Sangue Inglês criados no Brasil. Esta raça possui uma base genética estreita devido a um importante efeito fundador mas ao mesmo tempo demanda um rigor elevado no controle genealógico dos seus animais tendo em vista se tratar de uma raça internacional com ampla comercialização de animais. O estudo visou avaliar o conjunto de locos recomendado pela ISAG, locos complementares de freqüente utilização internacional bem como a bateria de locos TKY recentemente incluída no exercício de comparação da ISAG de e que deverá ser cada vez mais utilizada em análises de rotina no mundo. O estudo visou especificamente avaliar o desempenho forense destes marcadores em populações de animais nascidos no Brasil ano de 2004 bem como no plantel de garanhões mais amplamente utilizados no país procurando avaliar o grau de ancestralidade comum entre os mesmos. Foram realizadas simulações com base no conjunto de animais genotipados visando avaliar o número médio de locos excludentes em casos de falsas paternidades bem como em casos de paternidades verdadeiras. Finalmente foi estimado ainda o poder de exclusão de cada loco e de combinações de locos para situações nas quais o suposto pai testado é parente de primeira ordem do verdadeiro pai biológico do produto, fornecendo assim uma visão mais realista do real poder de exclusão da análise genética com microssatélites na raça de cavalos Puro Sangue Inglês.

20 17 2. Revisão bibliográfica 2.1 História e origem da raça Puro Sangue Inglês (PSI) Por volta de 1500, as corridas de cavalos se constituíam em um divertimento dos senhores das terras aos quais, as atividades de suas fazendas não lhes permitiam grandes perspectivas de passarem os domingos e feriados de maneira mais alegre. Assim, faziam correr seus animais pesados e carentes de velocidade. Foi este pequeno grupo de criadores que nos séculos XVI e XVII começaram com o cruzamento de cavalos nativos em éguas importadas da Espanha, Turquia e Itália. É possível determinar quando a raça de cavalo Puro Sangue Inglês - PSI (em inglês Thoroughbred - TB) desenvolveu-se. Relatos históricos indicam que por volta de 1600 a 1750, cerca de 174 reprodutores orientais, árabes, berberes e turcos, foram importados, com o propósito de incrementar a velocidade dos cavalos utilizados para o popular esporte de corridas. Destes, três garanhões fundadores tornaram-se famosos pela sua contribuição na formação da raça cuja ancestralidade remonta essencialmente a Darley Arabian, Godolphin Arabian e Byerly Turk (Figura 1), batizados por seus respectivos proprietários Thomas Darley, Lord Godolphin e Captain Robert Byerly. Estes três garanhões foram cruzados com os cavalos nativos ingleses mais fortes, porém menos precoces. O resultado foi um animal que podia carregar peso com velocidade constante por grandes distâncias, qualidades estas que trouxeram uma nova perspectiva para o esporte aristocrata e em franco crescimento na época que era o da corrida de cavalos. A incorporação destes garanhões na reprodução em diferentes épocas, mediante intensa consangüinidade, produziu, em última instância, o moderno cavalo Puro Sangue Inglês, de forma que cada um dos vários milhões de animais atuais de Puro Sangue Inglês, ao redor do mundo remonta a este restrito grupo de fundadores (

21 18 Figura 1. Os três garanhões fundadores da raça Puro Sangue Inglês, Darley Arabian (à esq.), Goldolphin Arabian (meio), Byerley Turk (à dir.). O primeiro reprodutor a chegar, foi o turco, Byerley nascido em Seu proprietário era um coronel que o havia arrebatado aos turcos durante a batalha de Buda (Hungria). Ao longo de vários anos se serviu daquele animal como seu cavalo de guerra, e mais tarde, quando se retirou da vida militar em 1690, o destinou à reprodução. Os potros nascidos de Byerley alcançaram pouco renome, mas seu bisneto, Herod, embora não tivesse se destacado como um grande corredor, projetou-se como um dos principais progenitores da raça PSI e gerou outros ganhadores de 1042 corridas. Darley Arabian nasceu em 1700 na Síria e foi importado para Inglaterra, onde teve a primeira geração de descendentes, dentre eles descatou-se o Flying Childers, o primeiro grande cavalo de corridas. Através de seu outro filho, Bartlett's Childers, tornou-se tataravô de Eclipse, possivelmente o cavalo de corrida mais famoso de todos os tempos. Eclipse gerou 344 ganhadores de dele resultaram linhagens de grande importância no desenvolvimento da raça PSI. A origem do terceiro garanhão fundador da raça PSI, o árabe/berbere Godolphin Arabian é ainda incerta. Godolphin nasceu em 1724 e integrava um grupo de oito cavalos presenteados ao rei da França Luís XIV em Sua história possui três versões, uma conta que aos cinco anos foi levado da França para Inglaterra, por Edward Coke, que o encontrou puxando uma carroça de água nas ruas de Paris. Outra se refere que foi comprado por três libras de um carroceiro em Paris e presenteado ao Lord Godolphin passando a servir em seu haras. A última história relata que o cavalo teria sido roubado por alguém, levado a Inglaterra e alojado no haras do Lord Godolphin. Godolphin Arabian, produziu

22 19 notáveis cavalos, entre eles o Lath e o famoso Cade (1734) pai de Matchem, que como Eclipse e Herod, havia de fundar uma destacada estirpe do PSI. A história da criação de cavalo de corrida no Brasil teve início em 1874, ano em que ocorreu o nascimento do potro Brasil na Província de Minas Gerais, que viria a ser o primeiro garanhão nacional Puro Sangue. O genitor e genitora de Brasil são os cavalos ingleses Zephyro e Hierogliph, respectivamente, descendentes do conceituado alazão Eclipse (Brotto, 1979). A aparência dos cavalos PSI revela uma ancestralidade árabe. Eles caracterizam-se por apresentarem muita finura, beleza e grande classe. Apresentam uma altura média de 1,60 m, linda cabeça, perfil reto ou levemente ondulado, fronte ampla, olhos grandes, narinas elípticas e dilatadas, orelhas médias, pele fina, cernelha destacada e musculosa, dorso reto comprido e lombo curto, garupa inclinada, peito estreito e tórax profundo. Possuem espáduas inclinadas, membros fortes, joelhos baixos e canelas curtas. A pelagem em geral é uniforme e pode variar em cor sendo as principais categorias castanho, alazão, preto e tordilho. Marcas brancas na face e pernas são freqüentemente observadas e são importantes descritores morfológicos na resenha do animal (Figura 2) (Brotto, 1979). O cavalo PSI é um dos cavalos mais brilhantes e versáteis criados no mundo hoje. Sua principal característica se refere à sua capacidade de carregar peso por longas distâncias, ou seja, a combinação entre velocidade e resistência. Em função disso o cavalo PSI é popular não apenas para corridas, mas também em outras disciplinas tais como caça, saltos e pólo. O cavalo PSI tem tido ainda papel de destaque na criação de novas raças de cavalos e para o melhoramento genético de raças existentes (Brotto, 1979).

23 20 Figura 2. Exemplar típico de Puro Sangue Inglês. 2.2 Registros genealógicos da raça Puro Sangue Inglês Desde o século XVII, com a criação da raça PSI, começou um processo de seleção direcional que vem acontecendo por mais de 300 anos sempre intercruzando os melhores garanhões com as melhores éguas, sendo que a prova de superioridade e excelência é estabelecida de forma objetiva na pista de corrida. Um aspecto chave para o sucesso deste programa contínuo de melhoramento genético baseado em forte consangüinidade tem sido a integridade dos registros genealógicos desta raça. Antigamente, os registros de pedigrees eram desconexos e freqüentemente incompletos mesmo porque era costume batizar cavalos somente após o mesmo comprovar uma capacidade de destaque nas pistas de corrida. Foi somente com o Sir James Weatherby, com seus recursos próprios e pesquisa pessoal que foi possível a consolidação de um grande número de registros genealógicos privados que resultou na publicação do primeiro livro de registros o General Stud Book. Ele completou isso em 1791, listando os pedigrees de 387 éguas, todas elas que podiam ser relacionadas por ancestria à Eclipse, um cavalo descendente de Darley Arabian; Matchem, um neto de Godolphin Arabian e Herod, cujo bisavô era

24 21 Byerly Turk. Este livro geral de registros, o General Stud Book ainda é publicado na Inglaterra pela Weatherby e Sons, secretários do Jockey Club ( Muitos anos depois, com a proliferação de corridas de cavalo no continente norte americano, a necessidade de um serviço de registros genealógicos de cavalos PSI nascidos nos EUA, nos moldes do General Stud Book, se tornou aparente. O Coronel Sanders D. Bruce, morador de Kentucky publicou o primeiro volume do American Studbook em 1873 e até 1896 produziu mais seis volumes do registro quando então o projeto foi assumido pelo Jockey Club dos EUA ( Este mesmo procedimento foi adotado por outros países nos últimos 50 a 100 anos. No Brasil o Serviço de Registro Genealógico do Cavalo de Corrida, denominado "Stud Book Brasileiro", tem por finalidade a manutenção do controle genealógico do cavalo da raça Puro Sangue de corrida e seus mestiços. Este serviço funciona na dependência da Associação Brasileira de Criadores e Proprietários do Cavalo de Corrida (ABCPCC) e é por esta administrado em todo o território nacional, por delegação expressa do órgão competente do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA), com fundamento na Lei nº de 29 de junho de O objetivo essencial do Stud Book Brasileiro é a manutenção dos registros genealógicos e de identidade dos cavalos Puro Sangue de Corrida, zelando pelo aprimoramento e pureza da raça. Este serviço mantém estreito e permanente relacionamento com Stud Books de outros países, exercendo o controle e fiscalização da procriação, gestação, nascimento, identificação e filiação, inscrição de animais importados, outorga de certificados de exportação, de identidade, de propriedade e qualquer outra documentação relacionada com tais atividades ( A integridade de um serviço de Stud Book é a fundação sobre a qual todo o sistema de criação, comercialização, melhoramento e seleção de cavalos de corrida se baseia hoje. Além dos aspectos de registro de dados cadastrais dos animais, é peça chave neste sistema a integridade e certeza dos parentescos declarados entre os animais. Um passo importante na certificação da integridade deste sistema em nível mundial ocorreu a partir de 1977 quando foi iniciado um extensivo

25 22 programa de verificação de parentesco de animais pelo sistema de tipagem sangüínea desenvolvido no início da década de 60 (Stormont e Suzuki, 1964; 1965). Nos EUA desde o final da década de 70 até 2000 todo animal PSI nascido e registrado no American Stud Book bem como ambos os seus pais foram tipados para um conjunto de grupos sangüíneos para verificação do parentesco declarado. Recentemente, o Comitê Internacional do Stud Book (ISBC International Stud Book Comittee) tem requerido um poder de exclusão mais elevado que o alcançado por tipagem sangüínea. Conseqüentemente, o Jockey Club americano substituiu o sistema de tipagem sangüínea pela análise de marcadores microssatélites no DNA aumentando a precisão de 97% (Bowling et al,. 1985) para 99,9% (Bowling et al., 1997), respectivamente, começando com os produtos nascidos em No Brasil, a verificação de paternidade por tipagem sangüínea passou a ser requerida para cavalos PSI para todas as crias nascidas após 1 de janeiro de Em 2005, o Stud Book Brasileiro com o intuito de cumprir as exigências nacionais e internacionais e manter a criação nacional rigorosamente dentro dos padrões exigidos mundialmente, iniciou o programa de verificação de parentesco com base na análise de DNA. A colheita de amostras para realização do exame teve início em 17/10/2005 visando à verificação dos produtos nascidos no ano de Para a realização das verificações foram também colhidas amostras do plantel de garanhões e éguas ( 2.3 Verificação de parentesco em eqüinos via tipagem sanguínea Pelos últimos 20 a 30 anos, os programas de verificação de parentesco de cavalos PSI bem como de diversas outras raças se basearam na tipagem sangüínea, i.e. grupos sangüíneos e polimorfismos protéicos. Esta tecnologia se baseia em uma série de rotinas confiáveis, tecnicamente simples e de baixo custo ainda hoje oferecidas por vários laboratórios no mundo, embora sendo rapidamente substituídas pela análise de DNA. A tipagem sangüínea consiste no reconhecimento de fatores sangüíneos (antígenos) presentes na superfície das células vermelhas do animal, com os anticorpos presentes nos reagentes utilizados no teste. Nos exames sorológicos são lidas e

26 23 interpretadas reações de hemólise e/ou aglutinação das hemácias do animal, quando submetidas à presença de anticorpos específicos para os diversos fatores sangüíneos. Os anticorpos podem ser ocasionalmente coletados de éguas imunizadas pelo seu próprio sangue. Esses anticorpos naturais produzem uma fraca reação hemolítica significativa in vivo dificultando a interpretação dos resultados. O descobrimento de variabilidade em fatores sangüíneos em eqüinos foi relatado originalmente em uma série de estudos por Podliachouk (1958) na França, o qual descreveu a existência de dez fatores sangüíneos peculiares a cavalos e mulas. Logo em seguida, nos Estados Unidos, Franks (1962) descreveu onze fatores sangüíneos. Estes estudos, entretanto, não haviam estabelecido relações de alelismo entre estes fatores e apenas citavam associações entre fatores atribuindo a ligação gênica. A ausência de uma interpretação mendeliana correta da herança destes fatores de certa forma limitava a devida interpretação para estudos de parentesco. Foi somente com os estudos de Stormont e Suzuki (1964) que estabeleceram a relação de alelismo e demonstraram a herança destes fatores sangüíneos que se iniciou a utilização sistemática de grupos sangüíneos para verificação de parentesco em eqüinos. Neste trabalho pioneiro foram descritos 16 fatores sangüíneos, demonstrada a sua herança mendeliana em 639 cruzamentos envolvendo 103 garanhões de diferentes raças e estimadas as suas freqüências alélicas em duas raças com 391 animais da raça de Ponies Shetland e 276 Puro Sangue Inglês (Thoroughbred). Este trabalho definiu de forma clara a existência de oito locos responsáveis pela produção dos 16 fatores sangüíneos e conseqüentemente pelo controle dos grupos sangüíneos em cavalos. Do ponto de vista prático, pouco mudou desde estes estudos pioneiros e embora nenhum novo grupo sangüíneo foi descoberto, o poder de resolução da tecnologia foi ampliado pela introdução de variantes protéicos. Testes bioquímicos analisam as principais variantes protéicas presentes nas hemácias ou no plasma dos animais através de técnicas de eletroforese em gel de amido. Os oito sistemas usualmente detectados em testes com hemácias e plasma são: albumina, erastase, vitamina D (binding protein), alpha hemoglobina, fosfoglucomutase, inibidor de protease, transferrina e A1B

27 24 glicoproteína. Hoje, são regularmente testados 7 sistemas de grupos sangüíneos, compreendendo 34 fatores sangüíneos diferentes e complementados por 6 variantes protéicas distintas. Bowling e Clark (1985) estimaram as freqüências alélicas para 20 grupos sangüíneos e locos protéicos polimórficos (A, C, D, K, P, Q, U, Al, Tf, Pi, Xk, Es, Gc, PGD, CA, Cat, PGM, AP, Hb e PHI) em sete raças de cavalos nos Estados Unidos (Puro Sangue Inglês, Árabe, Standardbred, Morgan, Quarto de Milha, Paso Fino e Peruvian Paso). Os dados demonstraram que esta bateria de marcadores apresentava uma probabilidade de exclusão de falsa paternidade de pelo menos 96% em Puro Sangue Inglês chegando a 99% em Quarto de Milha. Bernoco et al. (1997), em sua revisão, cita estudos não publicados nos quais, ao se utilizar 5 sistemas de grupos sangüíneos e 4 sistemas de variantes protéicas, foi estimada uma PE (Probabilidade de Exclusão de Paternidade) para as raças Apaloosa, Árabe, Quarto de Milha e Puro Sangue Inglês, de 97,4%, 94,4%, 98,2% e 91,5 % respectivamente. Vinocur et al. (2003) analisaram, a partir de sete sistemas de grupos sangüíneos e oito sistemas protéicos, a variabilidade genética de seis populações de cavalos Crioulos criados no sul do Brasil. A heterozigosidade média observada dos 15 locos analisados juntamente foi de 0,4631 e foram observados no total 87 alelos. A probabilidade de exclusão de um indivíduo indicado nos 15 locos variou de 95,5% a 98,3%. Bowling e colaboradores (1997), considerando sete sistemas de grupos sangüíneos e mais oito sistemas de variantes protéicas, calcularam a PE de 97,3% para a raça Quarto de Milha. Embora estes testes têm sido eficientes para solucionar questões de paternidade e maternidade resolvendo dúvidas de troca de produtos entre éguas ou paternidade quando mais de um garanhão poderia ter gerado o produto, algumas limitações ocasionalmente geraram frustrações para criadores e serviços de registro. A primeira é o fato dos exames dependerem da disponibilidade de sangue fresco e devidamente conservado, excluindo assim a possibilidade de utilizar outros tipos de amostras inclusive amostras forenses de animais falecidos. Em segundo lugar a coleta de sangue requer muitas vezes a assistência de um veterinário e condições refrigeradas de manipulação e envio de amostras o que dificulta, por exemplo, o envio internacional. Em terceiro lugar, em situações nas

28 25 quais dois garanhões geneticamente relacionados cobriram a mesma égua, a tipagem sangüínea freqüentemente não permite a exclusão conclusiva de paternidade de um deles em função do limitado poder de resolução do sistema. No caso específico de Puro Sangue Inglês a situação fica mais complexa ainda uma vez que as estimativas de PE são sistematicamente as menores em comparação às outras raças provavelmente como resultado da reduzida diversidade alélica oriunda do forte efeito fundador que ocorreu na formação da raça. Além disso, em função da natureza do material biológico analisado na tipagem sangüínea, há casos em que esse metodologia não é suficiente, como no relato feito por Bowling et al. (1993b), em que uma égua portadora de quimerismo sangüíneo era excluída como mãe de um potro pelo exame de tipagem sangüínea. Após testar o DNA extraído do sangue desta fêmea com cinco microssatélites persistiu a exclusão. No entanto, ao testar-se o DNA extraído de bulbo capilar nenhuma exclusão foi observada. Assim, verificou-se que a égua era uma quimera, possuindo duas linhagens celulares distintas, sendo uma proveniente de seu irmão gêmeo (mostrada em seu sangue) e outra própria (evidenciada nos bulbos capilares). 2.4 Marcadores microssatélites em eqüinos Marcadores microssatélites são baseados na amplificação de seqüências de DNA compostas por um número variável de nucleotídeos, normalmente de 1 a 7 pares de bases, repetidos várias vezes e encontradas no genoma de eucariotos (Hamada et al., 1982; Tautz e Renz, 1984; Litt e Luty, 1989; Weber e May, 1989). Embora o polimorfismo presente nestas regiões tenha sido explorado inicialmente na área humana (Edwards et al., 1991) locos baseados em microssatélites foram posteriormente descritos para várias espécies de animais incluindo eqüinos (Ellegren et al., 1992; Bowling et al., 1993b; Bowling et al., 1997), bovinos (Glowatzki-Mullis et al., 1995) e caninos (Fredholm e Winterø, 1996).

29 26 Os microssatélites são abundantes e encontram-se regularmente distribuídos no genoma de mamíferos (Tautz e Renz, 1984; Lagercrantz et al., 1993). Além disso, apresentam multialelismo e alto nível de polimorfismo resultante da alta incidência de escorregamento na replicação. Todas estas características, aliadas ao padrão de segregação co-dominante, têm feito dos microssatélites o marcador mais apropriado para o desenvolvimento de fingerprints genéticos únicos de espécies de plantas e animais. Marcadores microssatélites são detectados através da técnica de reação de polimerase em cadeia (PCR) com primers correspondentes a DNA de seqüência única que flanqueia as repetições em tandem. Regiões contendo seqüências simples repetidas são amplificadas individualmente através de PCR utilizando-se um par de iniciadores específicos (primers) (de 20 a 30 bases) complementares às seqüências únicas que flanqueiam o microssatélite. Segmentos amplificados a partir destes sítios quase que invariavelmente apresentam um polimorfismo extensivo resultante da presença de diferentes números de elementos simples repetidos. Assim, cada microssatélite, independente do elemento repetido, constitui um loco genético altamente variável, multialélico e de grande conteúdo informativo. Cada segmento amplificado de tamanho diferente (geralmente de várias dezenas até algumas centenas de pares de bases) representa um alelo diferente do mesmo loco. A detecção de seqüências microssatélites via PCR é feita em gel de eletroforese utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta resolução, uma vez que é necessário um gel adequado para a separação de produtos de PCR que diferem por poucos pares de base, dependendo do número de nucleotídeos do elemento repetido no microssatélite (Ferreira e Grattapaglia, 1998). A eletroforese para a detecção destes marcadores moleculares deve ser realizada em padrões tais que permitam distinguir bandas que diferem em apenas uma base e, por este motivo, são utilizadas condições de eletroforese de alta resolução usadas para seqüenciamento de DNA. Cada loco de microssatélite é analisado individualmente ao se utilizar o par de primers desenhados e sintetizados especificamente para a sua amplificação. Mais do que um loco pode ser

30 27 analisado de cada vez quando os alelos de cada loco têm tamanhos suficientemente diferentes e migram para zonas separadas no gel. Nestes métodos de genotipagem denominados "multiplex", mais do que um par de primers específicos é utilizado simultaneamente na mesma reação de PCR (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Por possuírem distribuição abundante dentro do genoma, e terem um elevado grau de polimorfismo, os marcadores microssatélites se tornaram uma ferramenta muito valiosa na genética de eqüinos seja no mapeamento de genomas, estudos populacionais e na identificação individual e estudos de parentesco. Em comparação com as populações humanas, entretanto, cavalos com pedigree apresentam níveis mais elevados de homogeneidade genética. Isto é resultado principalmente do forte efeito fundador principalmente em raças como o PSI bem como de acasalamentos consangüíneos utilizados para manter o tipo e as características individuais das diferentes raças, bem como a baixa freqüência ou mesmo ausência de fluxo gênico entre raças devido às barreiras impostas pelos sistemas de pedigree. Mesmo nestas condições, devido à ampla hipervariabilidade, marcadores microssatélites têm sido úteis para o mapeamento genético de eqüinos (Shiue et al., 1999; Guérin et al., 2003), verificação da extensão do desequilíbrio de ligação (DL) (Tozaki et al., 2005), estudos de evolução, caracterização e diferenciação entre populações e raças (Kruger et al., 2003; Aberle et al., 2004; Achmann et al., 2004; Bjørnstad e Røed, 2001; Zabek et al., 2005), e aplicações na verificação de parentesco (Binns et al., 1995; Bowling et al., 1997; Tozaki et al., 2001a; Lee e Cho, 2006). Nos últimos 12 anos, com o avanço da automação e reagentes para análise molecular, o uso de marcadores moleculares baseados em microssatélites para fins de genotipagem individual evoluiu para o desenvolvimento de sistemas de análise multiloco semi-automatizada (Levitt et al., 1994; Kimpton et al., 1993). Estes sistemas foram desenvolvidos inicialmente para estudos de genética humana (Fregeau et al., 1993; Gill et al., 1995). Eles baseiam-se na amplificação via PCR de um ou mais locos microssatélites, simultaneamente, utilizando iniciadores marcados com fluorocromos, e separação e visualização dos fragmentos em máquinas que permitam a detecção de fluorescência.

31 28 Recentemente, sistemas semelhantes foram desenvolvidos para análise de espécies animais de importância econômica. O objetivo tem sido estabelecer sistemas universais e altamente robustos de identificação genética para fins de exames de vínculo genético, estudos de variabilidade em populações e estimativas de distância genética. Entre as vantagens destes sistemas estão: (1) rapidez e acurácia na geração de dados; (2) avaliação simultânea de vários locos microssatélites em uma única pista do gel, reduzindo o número de análises necessárias em relação às técnicas convencionais; (3) aquisição e armazenamento dos dados (computadorizados) em tempo real, reduzindo a manipulação manual da informação; (4) possibilidade de exportação direta dos dados para programas de análise genética e (5) transferibilidade imediata do sistema para outros laboratórios, permitindo a padronização dos locos do genoma amostrados e a comparação e compartilhamento de resultados. No caso de eqüinos, várias centenas de microssatélites foram desenvolvidos por diversos grupos de pesquisa no mundo e publicados ao longo dos últimos 12 anos (ex. Ellegren et al., 1992; Marklund et al., 1994; van Haeringen et al., 1994; 1998; Guérin et al., 1994; Binns et al., 1995; Mickelson et al., 2003; Tozaki et al., 2000a, 2000b, 2001b, 2004; Wagner et al., 2004). A primeira geração de mapas de ligação de eqüinos foi publicada em 2000 (Swinburne et al., 2000a) com 31 grupos de ligação utilizando uma família de irmãos completos. Desde então, outros mapas de ligação de eqüinos usando famílias de meios irmãos (Guérin et al., 2003) e híbridos de radiação (Chowdhary et al., 2003) vem sendo publicados. Os mapas de ligação têm sido usados para identificar a base genética de características hereditárias associadas com o desempenho e saúde do animal. Tozaki e colaboradores (2005) utilizaram a característica da cor da cobertura de cavalos como um modelo para verificar a extensão do desequilíbrio de ligação, chegando a uma janela de 7cM. As informações sobre microssatélites mapeados, as seqüências dos seus primers e as respectivas características dos locos foram organizadas em um banco de dados mantido pelo Roslin Institute no endereço Atualmente este banco conta com 1470 locos dos quais 897 são microssatélites. Os mapas genéticos contam com um total de 688 locos mapeados, a

32 29 grande maioria microssatélites mapeados utilizando mapeamento em uma coleção de linhagens celulares de híbridos de radiação. Recentemente, consolidando dados de quatro fontes de segregação de marcadores foi publicado um mapa mais atualizado com 766 marcadores distribuídos pelos 31 cromossomos cobrindo cm com uma distância média entre marcadores de 6,3 cm (Penedo et al. 2005). 2.5 Marcadores microssatélites para identificação e parentesco em eqüinos Com a evolução das tecnologias do DNA recombinante, o descobrimento de seqüência simples repetitivas no genoma de eucariotos e o desenvolvimento da PCR, a partir de meados da década de 90 foi iniciada a transição de tecnologia de verificação de parentesco em eqüinos, passando de tipagem sangüínea para a tipagem de marcadores moleculares baseados na variação observada em seqüências de DNA. O trabalho de Bowling et al. (1993a) é o pioneiro descrevendo, durante um congresso mundial de identificação humana, a introdução da tipagem de DNA para a verificação de parentesco em bovinos e eqüinos. Em seguida Binns et al. (1995) utilizaram uma bateria de 8 marcadores microssatélites em cavalos PSI. Eles analisaram oito casos de dupla cobertura, ou seja, com dois supostos garanhões, que não puderam ser resolvidos pela tipagem sangüínea e em cinco dos oito casos eles identificaram exclusões claras de paternidade. Eles concluem o trabalho afirmando que a análise de DNA é um adjunto útil à tipagem sangüínea e que, provavelmente no futuro, iria substituíla. Hoje, 2007, a transição de tipagem sangüínea para tipagem de microssatélites ainda está de certa forma ocorrendo uma vez que muitos laboratórios e associações possuem um grande número de animais genotipados via tipagem sangüínea e ficam, portanto, resistentes a mudar de tecnologia e com isso ter que re-genotipar todos estes animais. Entretanto esta mudança tecnológica é irreversível principalmente devido à pressão do comércio mundial de animais com destaque para animais Puro Sangue Inglês, que vem demandando a verificação de parentesco pela análise de DNA.

33 30 Várias são as vantagens da análise de marcadores microssatélites. Com a análise de DNA, não são necessárias amostras de sangue fresco, bastando sangue imobilizado sobre papel filtro e sem necessidade de refrigeração. Alternativamente podem ainda ser usados bulbos capilares de pêlos de crina ou mesmo tecidos e ossos nos casos de animais falecidos. Além destas vantagens práticas, marcadores de DNA fornecem um poder mais elevado de discriminação individual e de exclusão de paternidade e maternidade mesmo em casos de forte consangüinidade. A análise de DNA permite ainda a utilização de um grande número de marcadores adicionais para solucionar casos complexos de verificação de parentesco nos casos das baterias padrão de marcadores não conseguirem fornecer um resultado conclusivo. Baterias de marcadores microssatélites para eqüinos têm sido propostas e otimizadas em alguns sistemas multiplex nos últimos anos visando atender situações de dificuldade de discriminação com base em tipagem sangüínea principalmente em situações nas quais garanhões aparentados são testados frente a um mesmo produto na qualidade de supostos pais. Bowling et al. (1997) validaram uma bateria de 11 microssatélites que inclui os nove recomendados pela ISAG. Para avaliar esta bateria de marcadores, eles compararam o desempenho forense destes marcadores com 15 locos de grupos sangüíneos e polimorfismos protéicos em 4803 cavalos da raça Quarto de Milha que, embora endogâmica, apresenta um histórico de base genética mais ampla do que cavalos PSI. Eles relataram que os 26 locos juntamente apresentaram uma efetividade teórica de 99,999% na detecção de paternidade incorreta. Apesar de relativamente poucos locos, a tipagem de DNA foi mais efetiva que a tipagem sangüínea alcançando um PE de 99,9%. Alguns trabalhos otimizaram baterias de marcadores microssatélites para a genotipagem de eqüinos em sistemas multiplex nos últimos anos. Marklund et al. (1994) otimizaram uma bateria de 8 marcadores microssatélites (HTG3, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 15) para a genotipagem de quatro raças de eqüinos em sistemas multiplex. O PE combinado estimado para esse conjunto de marcadores foi de 98%, 98%, 96% e 99%, para as raças Árabe, Standardbred, PSI e Swedish Halbred, respectivamente.

34 31 Tozaki et al. (2001a) propuseram uma nova bateria de microssatélites desenvolvida no Japão a partir de um amplo trabalho de desenvolvimento de novos microssatélites para eqüinos, batizados com o código TKY. Uma bateria de 15 marcadores TKY aplicada em 250 eqüinos não relacionados da raça PSI, forneceu um poder combinado de exclusão de 99,998%, significativamente superior à bateria hoje em utilização recomendada pela ISAG. Lee e Cho (2006) utilizaram uma bateria de 14 microssatélites que inclui os nove marcadores recomendados pela ISAG e mais 5 adicionais comumente utilizados internacionalmente (ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX33), atingindo uma PE de 99,98% com base em uma amostra de 1285 cavalos PSI. Jakabová et al. (2002) avaliaram o poder individual e combinado de seis microssatélites (ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, VHL20) em uma amostra de 352 cavalos PSI na República Eslovaca e estimaram um poder combinado de exclusão de 98,88%. Foi observado que com apenas cinco marcadores microssatélites com maior PE individual, foi alcançada uma probabilidade de exclusão combinada de 98,45%. Luis et al. (2002) utilizaram seis microssatélites (ASB2, HMS3, HMS7, HTG4, HTG10, e VHL20) em três raças portuguesas autóctones de cavalos alcançando um poder de exclusão combinado de 99,6%, 99,5% e 88,5% para as raças Lusitano, Garrano e Sorraia, respectivamente. Esta última raça é caracterizada por um histórico de forte endocruzamento. Dimsoski (2003) otimizou uma bateria de 17 microssatélites que inclui os nove recomendados pela ISAG (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, ASB2 e HTG10) e mais oito marcadores também freqüentemente usados (ASB17, LEX3, HMS1, CA425, HTG7, HTG6, HMS2 e ASB23), constituindo um kit comercializado pela Applied Biosystems. Embora este trabalho não especifique o poder de exclusão atingido pela bateria de marcadores, certamente deverá estar acima de 99,99%. Ribeiro et al. (2005) avaliaram o desempenho forense de uma bateria de 17 microssatélites (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, HMS6, UCDEQ425, HTG7, HMS3, AHT39, UM011, AHT29, UM010, UCDEQ405 AHT5, ASB2 e HTG10) amplificados em três sistemas multiplex de PCR em duas raças eqüinas brasileiras, Crioulo e Campolina. O poder de exclusão de paternidade foi estimado em

35 32 99,9996 % para Crioulo e 99,9939% para Campolina o que confirmou o elevado poder de discriminação destes marcadores para testes de paternidade e maternidade com eficiência significativamente maior do que tipagem sangüínea. 3. Objetivos 1. Utilizar sistemas multiplex de co-amplificação de locos microssatélites recomendados pela ISAG e locos TKY para a investigação de vínculo genético em cavalos Puro Sangue Inglês (PSI) criados no Brasil; 2. Genotipar um conjunto de 639 animais, sendo 142 garanhões e 597 éguas com o conjunto de microssatélites recomendados pela ISAG, locos complementares e, especificamente para o grupo de garanhões, locos TKY, visando a construção de um banco de dados de freqüências alélicas com finalidades de investigação de vínculo genético em cavalos Puro Sangue Inglês (PSI) criados no Brasil; 3. Avaliar e comparar os parâmetros de desempenho forense para a investigação de parentesco e identificação individual dos locos ISAG e TKY seja individualmente bem como em baterias específicas de locos analisados em rotina em sistemas multiplex no plantel de garanhões PSI criados no Brasil; 4. Analisar a diversidade genética do plantel de cavalos PSI brasileiros e comparar com planteis PSI de outros países e planteis de outras raças de eqüinos criadas no Brasil; 5. Avaliar o poder efetivo de exclusão de paternidade e maternidade de locos microssatélites em situações de parentesco entre o garanhão verdadeiro e um segundo suposto garanhão no plantel brasileiro de cavalos PSI;

36 33 6. Validar a qualificação de produtos em trios na presença de inconsistências alélicas (exclusões isoladas) oriundas de possíveis mutações nos microssatélites ISAG de rotina pela análise de locos complementares; 7. Estimar o Poder de Exclusão efetivamente realizado e da distribuição do número de locos diagnósticos de exclusão utilizando um processo de simulação de falsos trios e duos de animais PSI; 8. Gerar recomendações sobre conjuntos de microssatélites para utilização em rotina visando atingir um poder de exclusão efetivo de 99,95% na verificação de paternidade e maternidade no plantel brasileiro da raça de cavalos Puro Sangue Inglês. 4. Material e métodos 4.1 Coleta de amostras e extração de DNA O trabalho de genotipagem fez parte da prestação de serviços de genotipagem de eqüinos da equipe de analistas da empresa HERÉDITAS/GENOMAX da qual a autora desta dissertação faz parte, à ABCPCC (Associação Brasileira de Criadores e Proprietários de Cavalos de Corrida) localizada no Jockey Club Brasileiro sediado em São Paulo, capital. Para este estudo foram utilizadas amostras de sangue coletadas a partir de 142 garanhões e 597 éguas durante a época de inspeção dos produtos nascidos em 2004, i.e. nos meses de novembro e dezembro 2005 e janeiro a março de A amostra dos garanhões engloba os garanhões amplamente utilizados nos programas de cruzamento de cavalos PSI no Brasil responsáveis por cerca de 90% dos produtos gerados naquele ano. As amostras de sangue foram coletadas pela equipe de veterinários da ABCPCC de animais oriundos de diversos haras em todo o território nacional com destaque para a região Sul e Sudeste. Amostras de aproximadamente 2,0 ml de sangue periférico foram coletadas através de uma pequena incisão com agulha de seringa descartável diretamente na jugular do animal e o sangue foi imediatamente

37 34 absorvido em papel conservante fixado em cartões de coleta (Figura 3). Todas as amostras foram identificadas pelo nome do animal e código de barras em cartão de coleta próprio desenvolvido pela HEREDITAS/GENOMAX. As amostras de sangue foram secas ao ar e os cartões armazenados a temperatura ambiente em local seco sob silica gel. Figura 3. Cartão de coleta HEREDITAS/GENOMAX com identificação de código de barras. A extração do DNA genômico a partir do suporte de papel conservante seguiu o protocolo padrão de lise alcalina descrito por Rudbeck e Dissing (1998) otimizado pela equipe da GENOMAX para a retirada de inibidores de PCR. O pellet de leucócitos obtido após centrifugação foi lisado com 300 µl de NaOH a 0,5 M, incubado a 100ºC por cinco minutos e neutralizado com Tris HCl 1 M. Diluições específicas do lisado alcançando estimados 2 a 10 ng/ul foram utilizadas diretamente na PCR de microssatélites. 4.2 Utilização de multiplexes de locos microssatélites TKY A análise de uma bateria de microssatélites com acrônimo TKY descrita por Tozaki et al. (2001a) foi otimizada nas condições laboratoriais visando a genotipagem de cavalos PSI do plantel brasileiro. Um painel de 12 animais sendo quatro trios completos (quatro garanhões, quatro éguas e quatro produtos) previamente qualificados pela análise de parentesco a partir dos locos recomendados pela ISAG foi utilizado para testes de otimização de concentração de primers, interpretação de alelos, desenvolvimento de macros específicas no software Genotyper e análise. Também foram incluídas nas

38 35 otimizações, duas amostras de DNA oriundas do exercício ISAG 2005/2006 para as quais se tinha conhecimento dos genótipos consensuados internacionalmente. As informações dos locos TKY tais como, seqüência de primers, marcação com fluorocromo, faixa de tamanho de alelos, cromossomo, número de acesso no GenBank estão descritas na Tabela 1. Tabela 1. Bateria de 15 marcadores microssatélites TKY. Os multiplexes cujos locos são detectados nas fluorescências azul, verde e amarela são compostos por 5 locos cujos primers diretos são marcados no terminal 5 com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED, respectivamente. Loco Fluoresc. Tamanho dos alelos (pb) Cromossomo Seqüências dos Primers (5 3 ) GeneBank Ref. Bibliog. TKY344 6-FAM GTGTCCATCAATGGATGAAG AB Tozaki et al. (2001b) CTTAAGGCTAAATAATATCCC TKY279 6-FAM AATGAATGAGACTTGAACCC AB TCTGCTGTTTTAGGCTCGG TKY343 6-FAM TAGTCCCTATTTCTCCTGAG AB AAACCCACAGATACTCTAAG TKY321 6-FAM TTGTTGGGTTTAGGTATGAAGG AB GTGTCAATGTGACTTCAAGAAC TKY287 6-FAM ATCAGAGAACACCAAGAAGG AB TCTCTGCTATAGGTAAGGTC TKY312 HEX AACCTGGGTTTCTGTTGTTG AB GATCCTTCTTTTTATGGCTG TKY301 HEX AATGGTGGCTAATCAATGGG AB GTGTATGATGCCCTCATCTC TKY337 HEX AGCAGGGTTTAATTACCGAG AB TAGATGCTAATGCAGCACAG TKY374 HEX CTGGTCCCTCTGGATGGAAG AB TCCCAAGAGGGAGTACAATC TKY297 HEX GTCTTTTTGTGCCTCTGGTG AB TCAGGGGACAGTGGCAGCAG TKY333 NED CCTTCACTAGCCTTCAAATG AB TTGTGTTTAGACAGTGCTGC Tozaki et al. (2000a) Tozaki et al. (2001b) Tozaki et al. (2000b) Tozaki et al. (2000a) Tozaki et al. (2000b) Tozaki et al. (2000b) Tozaki et al. (2001b) Tozaki et al. (2001b) Tozaki et al. (2000b) Tozaki et al. (2001b)

39 36 Tabela 1 (Continuação) Tamanho Loco Fluoresc. dos alelos (pb) Cromossomo Seqüências dos Primers (5 3 ) GeneBank Ref. Bibliog. TKY341 NED TATCCAGTCACCCATTTTAC AB Tozaki et al. (2001b) TTGTGTCAGTACACTCTATG TKY325 NED GGATGGAGTGAGATAATACC AB TGGATGAACCATGAAATGTG TKY294 NED GATCTATGTGCTAGCAAACAC AB CTAGTGTTTCAGATAGCCTC TKY394 NED GCATCATCGCCTTGAAGTTG AB CCTTTCTGGTTGGTATCCTG Tozaki et al. (2001b) Tozaki et al. (2000b) Tozaki et al. (2001b) Os primers diretos de cinco microssatélites (TKY344, TKY279, TKY343, TKY321, TKY287) foram marcados com o fluorocromo 6-FAM; cinco (TKY312, TKY301, TKY337, TKY374, TKY297) foram marcados com o fluorocromo HEX e cinco (TKY333, TKY341, TKY325, TKY294, TKY394) foram marcados com o fluorocromo NED de acordo como o arranjo de multiplex descrito por Tozaki et al. (2001a) (Figura 4). Os 15 marcadores microssatélites foram amplificados separadamente em três sistemas multiplex de PCR sendo um para cada cor de fluorescência e em seguida combinados para carregamento simultâneo no seqüenciador automático de DNA ABI Prism 377 XL. Para os multiplexes marcados com 6-FAM e NED, foi ainda co-amplificado o loco HMS6 (marcado com o fluorocromo HEX) em comum com sistemas de microssatélites ISAG anteriormente genotipados nestas amostras fornecendo assim um loco de conferência da identidade correta da amostra genotipada.

40 37 Fonte: Tozaki et al. (2001a) Figura 4. Conjunto de 15 locos TKY distribuídos em três multiplexes de acordo como o arranjo descrito por Tozaki et al. (2001a). Cada multiplex é formado por cinco locos, com diferentes faixas de tamanho de alelos, marcados com uma única fluorescência. Os três multiplexes podem ser carregados e analisados simultaneamente no seqüenciador automático. A reação de amplificação dos microssatélites foi realizada em placas de 96 poços, num volume de reação de 13 µl contendo ~ 2 a 10 ng de DNA genômico, 0,2 mm de dntp, 1,5 µg de BSA, 1,3 µl de tampão de PCR 10x (Phoneutria), 2,0 mm de MgCl2, e concentrações variáveis dos primers de cada loco (veja a seguir) e 1,5 u de enzima Taq polimerase (Phoneutria). O programa no termociclador ABI 9700 utilizado para a PCR foi: 95ºC por 15 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação (95ºC por 30 segundos), anelamento (60ºC por 30 segundos) e extensão (72ºC por 1 minuto). As concentrações de primers testadas de acordo com a recomendação de Tozaki et al. (2001a) variaram de 0,3 µm para os primers TKY301, 312, 321 e 325 e de 0,6 µm para TKY279, 287, 297, 333, 343, 344. Foi ainda testado o programa de termociclagem sugerido no artigo com uma desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos, 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 55ºC e 72ºC. A extensão final seguiu a 72ºC por 60 minutos. A partir dos resultados obtidos, foram testadas novas concentrações de primers variando de 0,25 a 1,0 µm para os primers TKY344 e TKY279, respectivamente. Adicionou-se 2 μl de produto de PCR de cada multiplex a 1μL de padrão de controle interno, i.e. uma escada de fragmentos de DNA de tamanho conhecido, marcados com o fluorocromo ROX, (Grattapaglia, não publicado), seguido de desnaturação a 95ºC por cinco minutos e carregamento de uma alíquota de 1,5 μl da mistura no gel de poliacrilamida instalado no seqüenciador. A análise dos

41 38 produtos de PCR foi realizada no seqüenciador automático de DNA ABI Prism 377 XL de acordo com as especificações do fornecedor. Os picos dos eletroferogramas revelados em cada loco foram analisados através dos softwares GeneScan Analysis v.2.1 e Genotyper v.2.0 (Applied Biosystems, EUA), possibilitando a estimativa precisa em pares de base de cada alelo nos locos analisados, utilizando como referência valores do exercício de 2005/2006 da International Society of Animal Genetics (ISAG) realizado pelo laboratório HERÉDITAS/GENOMAX. Os alelos foram em seguida convertidos, através de macros, para a nomenclatura de letras alfabéticas internacionalmente utilizadas e recomendadas pela ISAG. Os alelos foram organizados em ordem alfabética do menor para o maior alelo, baseado no alelo de tamanho mediano que foi designado pela letra M. 4.3 Banco de dados e desempenho forense dos locos TKY Para a construção do banco de dados, foram utilizadas amostras de DNA de 142 garanhões constituindo assim uma amostra representativa do plantel de reprodutores de animais PSI do Brasil. Os 142 animais foram genotipados para os 15 locos TKY utilizando os sistemas multiplex de PCR descritos acima. Estimativas de freqüências alélicas para cada loco foram obtidas diretamente dos dados genotípicos observados. A heterozigosidade observada foi determinada por contagem direta e a heterozigosidade esperada foi calculada a partir das freqüências alélicas assumindo equilíbrio de HW. Também foi estimado o coeficiente de endocruzamento (Fis). Este índice mede a redução de heterozigosidade em relação àquela esperada em uma população panmítica como resultado do endocruzamento dentro da população. i.e. cruzamentos aparentados (não casualizados) mais freqüentes do que devido simplesmente ao acaso. Um intervalo de confiança a 95% foi construído sobre esta estimativa pelo método de reamostragem bootstrap, usando 1000 repetições, visando testar a hipótese nula de que Fis = zero. Testes exatos de Fisher para cada loco individualmente (teste para conformidade da distribuição genotípica às expectativas de HW) e para conformidade à hipótese de equilíbrio de ligação gamética (EL) de locos dois a dois foram realizados. Para cada teste foi estimado

42 39 um p valor (p value) por permutação dos alelos independentemente em cada loco estimando. Estas análises foram realizadas utilizando o software GDA (Lewis e Zaykin, 2001). Para aplicar um nível de significância experimental de 0,05 (experimentwise) foi utilizada uma correção de Bonferroni dividindo 0,05 pelo número total de testes realizados o que corresponde ao número de locos. Por exemplo, para o teste para EHW de 17 locos o nível de significância usado foi α = 0,05/17 = 0,003. Para o teste de EL dos 17 locos foram feitos 136 combinações e com isso o α = 0,05/136 = 0, O desempenho forense esperado de cada loco e da bateria combinada para análises genéticas forenses e de paternidade nas raças eqüinas foi avaliado através das seguintes estimativas de parâmetros forenses: (1) Probabilidade de identidade ou matching probability (probabilidade de selecionar genótipos idênticos dentro de uma população.) PI = pi 4 + (2pipj) 2, onde pi e pj são as freqüências dos alelos i e j, respectivamente (Paetkau et al., 1995); (2) Poder de discriminação individual (probabilidade de discriminar dois indivíduos utilizando uma bateria de marcadores.) Poder de discriminação = 1 PI (Jones, 1972 e Brenner & Morris, 1990); (3) PIC Conteúdo de informação polimórfica ou Polymorphism Information Content (permite a avaliação da contribuição de cada loco na análise de segregação.) PIC = 1 - ( pi 2 ) - 2pi 2 pj 2, onde pi e pj são as freqüências dos alelos i e j, respectivamente (Botstein et al., 1980); (4) PE Poder de exclusão de paternidade (probabilidade de excluir um indivíduo escolhido aleatóriamente em uma população como o potencial pai de uma amostra.) PE = h 2 (1 2hH 2 ), onde h é a freqüência de heretozigotos no loco e H é a freqüência de homozigotos; (5) IP Índice de paternidade típico (indica quantas vezes a mais o pai biológico da amostra testada é declarada como pai comparado com um indivíduo selecionado randomicamente.) IP = 1 / 2H, onde H é a freqüência de homozigotos. A planilha PowerStat v.1.2 (Promega) foi utilizada para realizar estes cálculos. Foram realizadas ainda comparações do poder de exclusão efetivo da bateria de locos TKY com a bateria mínima de nove locos recomendados pela ISAG, bem como baterias expandidas utilizadas internacionalmente para verificação de parentesco em eqüinos.

43 Desempenho forense dos locos ISAG e verificação de parentesco em PSI brasileiro Um total de 639 amostras, sendo 142 garanhões anteriormente utilizados para a construção do banco de dados para os locos TKY e 597 éguas foram genotipadas utilizando o conjunto de nove microssatélites recomendados pela ISAG, VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, ASB2 e HTG10, bem como os locos adicionais AHT39, UM011, AHT29, HTG6, UM010, UCDEQ425, HTG7, UCDEQ405 em três sistemas multiplex de PCR conforme descrito por Ribeiro et al. (2005) (Tabela 2). As análises foram conduzidas em separado nas duas amostras de PSI (PSI 142 e PSI 597) para possibilitar a devida comparação com o desempenho forense dos locos TKY para os quais haviam sido analisados os 142 garanhões. Tabela 2. Bateria de 17 marcadores microssatélites, incluindo os nove marcadores recomendados pela ISAG indicados com *. (MPX = multiplex; n.d = não disponível) Locos Fluoresc. Tamanho (pb) Crom. MPX Seqüência do Primer (5 3 ) Genbank Ref. Bibliog. VHL20* 6-FAM A CAAGTCCTCTTACTTGAAGACTAG X75970 van Haeringen et al. (1994) AACTCAGGGAGAATCTTCCTCAG HTG4* 6-FAM A CTATCTCAGTCTTGATTGCAGGAC AF Ellegren et al. (1992) CTCCCTCCCTCCCTCTGTTCTC AHT4* 6-FAM A AACCGCCTGAGCAAGGAAGT n.d. Binns et al. (1995) GCTCCCAGAGAGTTTACCCT HMS7* 6-FAM A CAGGAAACTCATGTTGATACCATC X74636 Guérin et al. (1994) TGTTGTTGAAACATACCTTGACTGT HTG6 HEX A CCTGCTTGGAGGCTGTGATAAGAT AF Marklund et al. (1994) GTTCACTGAATGTCAAATTCTGCT HMS6* 1 HEX A, B, C GAAGCTGCCAGTATTCAACCATTG X74635 Guérin et al. (1994) CTCCATCTTGTGAAGTGTAACTCA HTG7 1 NED A, B CCTGAAGCAGAACATCCCTCCTTG AF Marklund et al. (1994) ATAAAGTGTCTGGGCAGAGCTGCT HMS3* NED A CCAACTCTTTGTCACATAACAAGA X74632 Guérin et al. (1994) CCATCCTCACTTTTTCACTTTGTT AHT39 6-FAM B CCATTTTCTCATCACAAGCG AJ Swinburne et al. (2000b) TGAATCCCTGCTGCTTCC UM011 6-FAM B TGAAAGTAGAAAGGGATGTGG AF Meyer et al. (2000) TCTCAGAGCAGAAGTCCCTG AHT29 6-FAM B ACTCATTCATTCACAAATCCCC AJ Swinburne et al. (2000 ) AGAAAATTCCCTCCTGTCCC 1 Locos de conferência entre multiplexes.

44 41 Tabela 2 (Continuação) Locos Fluoresc. Tamanho (pb) Crom. MPX Seqüência do Primer (5 3 ) Genbank Ref. Bibliog. UM010 HEX B TACAGCCATTGGAAATCTAC AF Meyer et al. (2000) CACCATTACATTTTCCCAG UCDEQ425 HEX B AGCTGCCTCGTTAATTCA U67406 Eggleston-Stott et al. (1997b) CTCATGTCCGCTTGTCTC UCDEQ405 NED B ACCTCGTCTGGCTGTTGTAAG AF Eggleston-Stott et al. (1997b) ACTTGCTGTGCGACTCTG AHT5* 6-FAM C ACGGACACATCCCTGCCTGC n.d. Binns et al. (1995) GCAGGCTA AGGGGGCTCAGC HTG10* NED C CAATTCCCGCCCCACCCCCGGCA AF Marklund et al. (1994) TTTTTATTCTG ATCTGTCACATTT ASB2* NED C CCTTCCTGTAGTTTAAGCTTCTG X93516 Breen et al. (1997) CACAACTGAGTTCTCTGATAGG Os 17 marcadores microssatélites foram combinados em três sistemas multiplex (A, B e C) utilizando dois locos de conferência de identidade da amostra (HMS6 marcado em HEX e HTG7 marcado em NED) e analisados no seqüenciador automático de DNA ABI Prism 377 XL (Applied Biosystems, EUA) (Figura 5). A PCR foi realizada nas mesmas condições descritas anteriormente com a concentração de primers variando entre 0,25 a 1,0 μm. O programa no termociclador ABI 9700 utilizado para todos os três multiplexes foi: 95ºC por 15 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação (95ºC por 30 segundos), anelamento (60ºC por 30 segundos) e extensão (72ºC por 1 minuto). O carregamento das amostras com o padrão de controle interno e a análise dos dados no seqüenciador ABI Prism 377 XL, seguiram os mesmos procedimentos anteriormente descritos para os locos TKY utilizando amostras controle de genótipo consensuado do exercício de comparação da ISAG de 2005/2006.

45 42 Figura 5. Conjunto de 17 locos (ISAG + complementação) distribuídos em três multiplexes de acordo como o arranjo descrito por Ribeiro et al. (2005) com modificações. Para a avaliação do poder de exclusão realizado foi utilizado um conjunto de 259 garanhões e ~3600 pares de éguas e seus respectivos produtos nascidos em 2004 genotipados em trabalhos de rotina com os locos ISAG + locos de complementação. Análises de verificação de maternidade e paternidade foram realizadas utilizando o software proprietário da HERÉDITAS/GENOMAX denominado DNAGRO (Ferreira e Bolzon, não publicado) com base nos princípios básicos de transmissão alélica Mendeliana. Produtos foram qualificados ou não qualificados com base no compartilhamento de alelos com a suposta genitora e suposto genitor. Seguindo as recomendações internacionais, produtos para os quais até duas inconsistências alélicas isoladas foram observadas em um mínimo de 12 locos testados, foram declarados qualificados, ou seja, descendentes daquele genitor, partindo da premissa de que a inconsistência isolada se enquadraria em mutação, dropout alélico ou eventualmente desvio de declaração de alelo durante a genotipagem. O desempenho

46 43 forense dos locos ISAG e locos adicionais foi avaliado para a raça PSI com base na análise dos dados genotípicos dos mesmos 142 garanhões analisados para a construção do banco de dados para os locos TKY seguindo os procedimentos analíticos descritos anteriormente. Também foram analisados os dados da amostra de PSI 597 éguas para fins de comparação do efeito de maior tamanho amostral. 4.5 Análise genética comparativa do PSI brasileiro com PSI de outros países e outras raças Comparações gráficas das distribuições de freqüências alélicas do PSI brasileiro com PSI de outros países foi realizada com amostras de animais PSI do Japão para os locos TKY (Tozaki et al. 2001a) e para os locos ISAG com os estudos de Lee e Cho (2006) e Jakabová et al. (2002) para populações de PSI da Coréia e República Eslovaca, respectivamente. Comparações também foram realizadas das distribuições de freqüências alélicas e das estimativas de desempenho forense para os locos ISAG com planteis de eqüinos de outras raças criadas no Brasil tais como Crioulo e Campolina (Ribeiro et al., 2005). 4.6 Estimativa do poder de exclusão em situações de parentesco Para as diferentes baterias de locos estudadas foi estimado o Poder de Exclusão (PE) no caso de violação da premissa de panmixia quando dois ou mais garanhões geneticamente relacionados, irmãos, meios irmãos ou primos, são testados como supostos pais de um mesmo produto em uma verificação de paternidade. A estimativa de PErel foi obtida para cada loco e para diferentes tipos de parentesco com base na formula PErel = PE (1-r) de acordo com a metodologia descrita por Double et al. (1997), onde r = coeficiente de relacionamento entre parentes (coefficient of relationship). Por sua vez r = 2FIJ onde FIJ = coeficiente de ancestralidade entre dois indivíduos I e J isto é a probabilidade de dois alelos (genes) ao mesmo loco em dois indivíduos serem idênticos por descendência devido ao ancestral comum. Fx corresponde ainda ao coeficiente de endocruzamento de um indivíduo X derivado do cruzamento entre I e J (assumindo que I e J têm endocruzamento igual a zero). Para irmãos

47 44 germanos ou pai-filho, por exemplo, FIJ = 0,25, r = 0,5 e PErel = 0,5 PE, ou seja o poder de exclusão de um loco para excluir um irmão germano de ser o pai biológico é a metade do poder de exclusão no caso de panmixia, ou seja dos dois garanhões serem geneticamente não relacionados. Para meiosirmãos, FIJ = 0,125, r = 0,25 e PErel = 0,75 PE e para primos FIJ = 0,0625, r = 0,125 e PErel = 0,875 PE. Uma estimativa de PE utilizando o coeficiente de endocruzamento Fis global estimado na análise dos 142 garanhões foi também obtida para fornecer uma estimativa corrigida pelo Fis do poder de exclusão esperado para cada loco e bateria de locos na população PSI do Brasil. 4.7 Análise de locos complementares em casos de inconsistências (exclusões) isoladas Foram utilizados dados de cerca de 3600 exames de paternidade realizados com os animais PSI nascidos em 2004 derivados de análises de rotina na HEREDITAS/GENOMAX. Foram amostrados 23 casos nos quais foram observadas duas inconsistências isoladas (exclusões isoladas) e declarados como não exclusões, i.e. os produtos são qualificados como sendo corretamente descendentes da genitora e genitor testados. Para estes 23 trios foram genotipados 13 locos TKY com o objetivo de validar as declarações de não exclusão. As exclusões isoladas foram interpretadas como sendo mutações ou não amplificações de alelos (dropout). O objetivo foi verificar se de fato tratavam-se de situações de ocorrência de mutações ou dropouts ou se um número adicional de locos diagnósticos de exclusão seria detectado o que indicaria uma não qualificação do produto. 4.8 Estimativas de PE realizado e simulações de exames de exclusão Foi realizado um trabalho de simulação com base no conjunto de todos os animais genotipados referente aos produtos nascidos em 2004 separando inicialmente os grupos de garanhões, éguas e produtos. A simulação consistiu em gerar milhares de trios tomando pares verdadeiros de genitora com seu respectivo produto e testando este par frente aos 259 garanhões disponíveis no banco de dados com exceção do garanhão que havia sido indicado como suposto pai e devidamente qualificado como

48 45 tal nas análises de paternidade. Ou seja, foram gerados cerca de 3600 pares de égua+produto versus (259-1) garanhões totalizando exames envolvendo falsos trios. Também foram realizadas simulações tomando apenas os produtos sem as respectivas genitoras, ou seja, análises de duos. Vale ressaltar que nem todos os locos haviam sido genotipados em todos os animais envolvidos nestes exames simulados, mas que pelo menos 12 locos sempre puderam ser comparados entre os três animais. Estes trios de exclusão foram utilizados para fornecer as seguintes estimativas: (a) o Poder de Exclusão efetivamente realizado de cada loco microssatélite, i.e. a proporção de exames nos quais o loco corretamente excluiu o suposto garanhão testado; (b) a freqüência de exames nos quais o garanhão seria excluído com números crescentes de locos diagnósticos de exclusão ao se utilizar baterias crescentes de marcadores; (c) o Poder de Exclusão de baterias crescentes de microssatélites com as quais falsos garanhões seriam corretamente excluídos como genitores dos produtos com base em mais de dois locos diagnósticos de exclusão. 5. Resultados 5.1 Banco de dados dos locos microssatélites TKY As 12 amostras de eqüinos testadas (quatro trios completos) bem como as duas amostras controle do exercício ISAG 2005/2006, foram amplificadas com sucesso com o protocolo desenvolvido no laboratório e com o programa de termocilagem sugerido por Tozaki et al. (2001a) (Figura 6). Os locos TKY279 e TKY297 foram excluídos das análises subseqüentes e construção de banco de frequências alélicas, por não apresentarem uma amplificação consistente em sistema multiplex (valores de intensidade de fluorescência abaixo de 100 rfu relative fluorescence units) para as amostras em condições de rotina, apenas para as amostras controle ISAG. Otimizações posteriores serão necessárias para eventualmente incluir estes dois locos nos sistemas multiplex de rotina.

49 46 Figura 6. Eletroferogramas de DNA amplificado utilizando a bateria de 15 marcadores TKY, detectados em eletroforese no seqüenciador ABI377XL. Painel superior - Amostra controle do exercício ISAG amplificado com os 15 marcadores TKY. Os locos em azul, verde a amarelo estão marcados respectivamente com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED da Applied Biosystems. Painel inferior Análise de transmissão alélica em trio. Somente os locos marcados em amarelo estão apresentados. O número de alelos por loco observados nos 13 microssatélites TKY analisados e as respectivas freqüências alélicas na amostra de garanhões PSI 142 estão apresentados na Tabela 3. Em todos os locos foram observados um ou mais alelos relativamente freqüentes com freqüência na faixa de 25 a 35%. O número total de alelos por loco variou de quatro a oito para os locos TKY337 e TKY321 respectivamente, e a média do número de alelos nesta amostra foi de 6,2. Os alelos

50 47 corresponderam de forma consistente e regular a uma série de repetições de dois pares de bases. Não foram observadas evidências de alelos microvariantes, ou seja, alelos cujos tamanhos diferiram em um par de base.

51 48 Tabela 3. Número de alelos por loco (A) e distribuição de freqüências alélicas em 13 microssatélites TKY baseados em uma amostra de 142 garanhões do plantel brasileiro de PSI. Os alelos foram identificados por letras alfabéticas de acordo com a nomenclatura recomendada pelo ISAG. Loco A Freqüência Alélica F G I J K L M N O P Q R S T U TKY ,032 0,094 0,201 0,137 0,169 0,367 TKY ,403 0,129 0,007 0,004 0,133 0,324 TKY ,379 0,004 0,201 0,106 0,011 0,117 0,073 0,109 TKY ,008 0,245 0,198 0,126 0,011 0,412 TKY ,075 0,234 0,373 0,187 0,004 0,095 0,032 TKY ,070 0,065 0,187 0,270 0,313 0,095 TKY ,315 0,277 0,248 0,160 TKY ,062 0,062 0,104 0,313 0,438 0,021 TKY ,095 0,076 0,134 0,134 0,263 0,290 0,008 TKY ,012 0,178 0,236 0,004 0,492 0,074 0,004 TKY ,031 0,165 0,119 0,035 0,015 0,250 0,385 TKY ,298 0,190 0,278 0,016 0,218 TKY ,242 0,066 0,210 0,263 0,149 0,070

52 Banco de dados de freqüências alélicas dos locos ISAG Os três sistemas multiplex utilizados em rotina envolvendo os nove locos ISAG e oito locos complementares permitiram a genotipagem eficiente das amostras com uma taxa de repetição da ordem de ~5 %. Eletroferogramas dos três sistemas multiplex são apresentados na Figura 7. A B C Figura 7. Eletroferogramas da análise de uma amostra de DNA com os três multiplexes envolvendo a bateria de nove marcadores microssatélites, recomendados pela ISAG, e oito marcadores adicionais, no seqüenciador ABI377XL. Painel A - Multiplex A formado por oito locos (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7,

53 50 HTG6, HMS6, HTG7 e HMS3). Painel B - Multiplex A formado por oito locos (AHT39, UM011, AHT29, UM010, HMS6, UCDEQ425, HTG7 e UCDEQ405). Painel C - Multiplex C formado por quatro locos (AHT5, HMS6, HTG10 e ASB2). Os locos em azul, verde a amarelo estão marcados com os fluorocromos 6-FAM, HEX e NED da Applied Biosystems. Foi gerado um banco de freqüências alélicas da bateria de 17 locos para uma amostra de 142 garanhões (PSI 142) e 597 éguas selecionadas aleatoriamente (PSI 597) (Tabela 4). O número total de alelos variou de um mínimo de três para o loco AHT29 nas duas populações estudadas, até um máximo de 9 e 8 para o loco ASB2 em PSI 142 e PSI 597 respectivamente. Médias de 5,29 e 5,88 alelos por loco foram observadas no conjunto de 142 garanhões e 597 indivíduos PSI, respectivamente. Para os locos VHL20, AHT4, HTG6, AHT5, AHT39, UM011, UCDEQ425, UCDEQ405, foram observados um menor número de alelos na população PSI 142 que na população PSI 597. Para os locos AHT4, AHT39, UCDEQ425, UCDEQ405, foram observados maior número de alelos na população PSI 142 que na população PSI 597. Os demais locos apresentaram o mesmo número de alelos nas duas populações. Tabela 4. Número de alelos por loco (A) e distribuição das freqüências alélicas em 17 microssatélites ISAG, baseados em duas amostras de animais PSI, 142 garanhões (PSI 142) e 597 éguas (PSI 597). Loco Amostra A Alelo (Freqüência) VHL20 PSI I (0,243) L (0,224) M (0,283) N (0,232) O (0,018) PSI I (0,205) K (0,001) L (0,224) M (0,341) N (0,218) O (0,011) HTG4 PSI K (0,631) L (0,004) M (0,311) N (0,029) P (0,025) PSI K (0,552) L (0,001) M (0,386) N (0,035) P (0,026) AHT4 PSI H (0,198) J (0,223) K (0,245) O (0,334) PSI H (0,146) I (0,001) J (0,214) K (0,254) L (0,001) O (0,384) HMS7 PSI J (0,097) K (0,004) L (0,141) M (0,254) N (0,215) O (0,289) PSI J (0,101) K (0,002) L (0,179) M (0,231) N (0,215) O (0,272) HTG6 PSI G (0,348) J (0,521) O (0,109) P (0,004) R (0,018) PSI G (0,302) J (0,554) M (0,007) O (0,111) P (0,003) R (0,023) HMS6 PSI K (0,113) L (0,039) M (0,324) O (0,010) P (0,514) PSI K (0,104) L (0,026) M (0,349) O (0,005) P (0,516) HTG7 PSI K (0,160) M (0,007) N (0,425) O (0,408) PSI K (0,124) M (0,007) N (0,371) O (0,498)

54 51 Tabela 4. (Continuação) Loco Amostra A Alelo (Freqüência) HMS3 PSI I (0,496) M (0,162) N (0,013) O (0,101) P (0,206) R (0,022) PSI I (0,431) M (0,188) N (0,053) O (0,121) P (0,184) R (0,023) AHT5 PSI J (0,167) K (0,455) M (0,269) N (0,072) O (0,0379) PSI J (0,178) K (0,437) L (0,003) M (0,217) N (0,108) O (0,057) ASB2 PSI A (0,017) J (0,011) K (0,146) M (0,152) N (0,185) O (0,062) P (0,017) Q (0,241) R (0,169) PSI A (0,017) J (0,017) K (0,178) M (0,178) N (0,186) O (0,051) Q (0,153) R (0,220) HTG10 PSI I (0,348) K (0,065) M (0,153) O (0,217) R (0,217) PSI I (0,394) K (0,136) M (0,167) O (0,197) R (0,106) AHT39 PSI (0,563) 86 (0,007) 88 (0,197) 90 (0,039) 92 (0,004) 94 (0,190) PSI (0,004) 78 (0,591) 80 (0,003) 88 (0,145) 90 (0,086) 92 (0,062) 94 (0,109) UM011 PSI (0,206) 166 (0,294) 168 (0,191) 170 (0,158) 172 (0,063) 174 (0,037) 178 (0,051) PSI (0,202) 166 (0,309) 168 (0,140) 170 (0,205) 172 (0,049) 174 (0,048) 176 (0,001) 178 (0,046) AHT29 PSI (0,405) 285 (0,072) 287 (0,523) PSI (0,332) 285 (0,164) 287 (0,504) UM010 PSI (0,175) 107 (0,366) 111 (0,008) 117 (0,097) 119 (0,35) 121 (0,004) PSI (0,164) 107 (0,380) 111 (0,016) 117 (0,061) 119 (0,379) UCDEQ425 PSI (0,024) 238 (0,155) 244 (0,012) 246 (0,726) 248 (0,083) PSI (0,039) 238 (0,158) 240 (0,004) 242 (0,02) 244 (0,029) 246 (0,628) 248 (0,120) 250 (0,002) UCDEQ405 PSI (0,010) 269 (0,250) 273 (0,014) 275 (0,726) PSI (0,006) 265 (0,022) 269 (0,231) 271 (0,001) 273 (0,017) 275 (0,723) 5.3 Diversidade genética e desempenho forense dos locos ISAG e TKY e comparações Os parâmetros de desempenho forense, os parâmetros de paternidade e proporções genotípicas para as amostras populacionais PSI 142 e PSI 597 para os locos ISAG e os locos complementares estão listados na Tabela 5. De maneira geral não foram observadas diferenças substanciais nas estimativas para as amostras populacionais de PSI brasileiro estudadas. Conforme esperado um número médio de alelos ligeiramente maior (5,882) foi estimado a partir da amostra de 597 éguas em comparação com a amostra de 142 garanhões (5,294). Entretanto as estimativas combinadas de desempenho forense foram ligeiramente melhores para o grupo de garanhões mesmo sendo a amostra menor, provavelmente em função de algum nível de consangüinidade mais elevado no grupo das 597 éguas em comparação com os 142 garanhões. Estas ligeiras diferenças podem também ser devido a efeitos de amostragem e, do ponto de vista prático, são irrelevantes.

55 52 A heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) variou de 0,396 a 0,831 (média de 0,647) e 0,411 a 0,805 (média de 0,655), respectivamente, para a população PSI 142 (Tabela 5). Apenas o loco AHT29 apresentou desvios das proporções genotípicas esperadas pelo EHW em PSI 142 (p<0,003). Para a população PSI 597, a heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) variou de 0,419 a 0,792 (média de 0,643) e 0,424 a 0,834 (média de 0,665), respectivamente. Os locos HMS3 e AHT29 e AHT39 apresentaram desvios das proporções esperadas pelo EHW (p<0,003). O intervalo de confiança a sobre a estimativa de Fis foi de -0,013 a 0,040 para PSI 142 e -0,0008 a 0,068 para PSI 597 indicando não existir redução de heterozigosidade significativa devido a cruzamentos entre parentes no plantel de PSI brasileiro.

56 53 Tabela 5. Parâmetros genéticos de desempenho dos 17 microssatélites estudados para a investigação de individualidade genética e de paternidade em duas populações de PSI; estimativas de coeficiente de endocruzamento (Fis) e p valor do teste exato para Equilíbrio de Hardy Weinberg. ( # Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total). Pop VHL20 HTG4 AHT4 HMS7 HTG6 HMS6 HTG7 HMS3 AHT5 HTG10 ASB2 AHT39 UM011 AHT29 UM010 UCDEQ425 UCDEQ405 Parâm. forenses Combinado Probabilidade de identidade PSI 142 0,113 0,315 0,117 0,088 0,255 0,209 0,230 0,163 0,152 0,104 0,055 0,205 0,066 0,308 0,154 0,359 0,412 5,96E-14 PSI 597 0,117 0,289 0,127 0,082 0,245 0,237 0,251 0,113 0,138 0,113 0,064 0,198 0,071 0,260 0,154 0,227 0,389 2,60E-14 Expresso em 1 em... PSI 142 8,833 3,179 8,545 11,409 3,920 4,790 4,347 6,153 6,590 9,618 18,126 4,868 15,161 3,252 6,474 2,782 2,428 - PSI 597 8,578 3,465 7,884 12,168 4,086 4,220 3,987 8,861 7,264 8,854 15,610 5,052 14,029 3,852 6,490 4,414 2,570 - Poder de discrim. individual PSI 142 0,887 0,685 0,883 0,912 0,745 0,791 0,770 0,837 0,848 0,896 0,945 0,795 0,934 0,692 0,846 0,641 0,588 0, PSI 597 0,880 0,710 0,870 0,920 0,760 0,760 0,750 0,690 0,860 0,890 0,940 0,800 0,930 0,740 0,850 0,770 0,610 0, PIC PSI 142 0,713 0,424 0,692 0,740 0,519 0,550 0,549 0,632 0,637 0,718 0,808 0,554 0,774 0,463 0,650 0,407 0,344 - PSI 597 0,700 0,450 0,670 0,750 0,520 0,530 0,520 0,690 0,670 0,710 0,800 0,570 0,770 0,530 0,620 0,530 0,370 - Parâm. de paternidade Combinado Poder de exclusão PSI 142 0,567 0,153 0,482 0,565 0,333 0,306 0,349 0,473 0,424 0,422 0,659 0,234 0,548 0,194 0,479 0,132 0,116 0,99983 PSI 597 0,540 0,190 0,460 0,590 0,320 0,280 0,310 0,390 0,540 0,420 0,560 0,200 0,570 0,160 0,360 0,250 0,130 0,99976 Índice de Paternidade típico PSI 142 2,300 0,921 1,878 2,286 1,365 1,291 1,410 1,839 1,650 1,643 2,967 1,109 2,194 1,015 1,864 0,875 0, ,509 PSI 597 2,140 1,010 1,790 2,410 1,330 1,220 1,300 1,520 2,170 1,650 2,270 1,030 2,340 0,940 1,450 1,150 0, ,439 Proporções genotípicas Média Ho PSI 142 0,783 0,460 0,734 0,787 0,634 0,613 0,645 0,734 0,697 0,696 0,831 0,543 0,772 0,508 0,729 0,429 0,396 0,647 PSI 597 0,766 0,503 0,720 0,792 0,625 0,589 0,617 0,672 0,769 0,697 0,780 0,515 0,787 0,467 0,654 0,565 0,419 0,643 He PSI 142 0,759 0,506 0,742 0,779 0,597 0,619 0,629 0,681 0,689 0,774 0,834 0,601 0,805 0,559 0,705 0,446 0,411 0,655 PSI 597 0,744 0,545 0,722 0,785 0,589 0,600 0,599 0,729 0,718 0,760 0,834 0,607 0,796 0,609 0,681 0,564 0,424 0,665 N de alelos PSI ,294 PSI ,882 Fis PSI 142-0,031 0,091 0,011-0,010-0,062 0,010 0,026-0,079-0,011 0,103 0,004 0,097 0,041 0,093-0,035 0,040 0,036 0,013 PSI 597-0,030 0,076 0,003-0,009-0,061 0,018-0,030 0,078-0,072 0,084 0,066 0,152 0,012 0,233 0,040-0,003 0,012 0,033 Pvalor Teste de EHW PSI 142 0,419 0,071 0,920 0,872 0,067 0,931 0,853 0,525 0,904 0,689 0,894 0,103 0,943 0,0001 0,605 0,482 0,595-0,013 a 0,040 # PSI 597 0,119 0,017 0,144 0,783 0,426 0,606 0,189 0,0001 0,471 0,278 0,159 0,0001 0,069 0,0001 0,773 0,210 0,230-0,0008 a 0,068 #

57 54 Um teste exato de Fisher para equilíbrio de ligação de locos dois a dois da bateria de 17 locos (ISAG + complementação) revelou vinte e oito pares de locos em desequilíbrio ( = 0, com correção de Bonferroni) (Tabela 6). Todos os pares em desequilíbrio de ligação envolveram os locos que apresentaram desvios no EHW (HMS3, AHT39 e AHT29). As estimativas de probabilidade de identidade (matching probability) baseadas na utilização dos 17 locos, ou seja, a probabilidade de dois animais apresentarem o mesmo perfil genético nesta bateria de microssatélites variou do loco mais informativo 5,5% (ASB2) até o loco menos informativo 41,2% (UCDEQ405) na população PSI 142 e de 6% (ASB2) a 39% (UCDEQ405) na população PSI 597. O poder de discriminação alcançado variou de 58,8% (UCDEQ405) a 94,5% (ASB2) para população PSI 142 e de 61% (UCDEQ405) a 94% (ASB2) para PSI 597. O loco mais polimórfico em ambas populações foi ASB2 e o menos polimórfico foi UCDEQ405. Consistente com o seu maior conteúdo informativo, um elevado poder de exclusão de paternidade foi também observado no loco ASB2 (65,9%) e HMS7 (59%) nas populações PSI 142 e PSI 597, respectivamente. A probabilidade de exclusão de paternidade combinada para os 17 locos para PSI 142 e PSI 597 foi de 99,983 % e 99,976%, respectivamente (Tabela 5). Tabela 6. Resultados do teste exato de Fisher para equilíbrio de ligação de locos microssatélites dois a dois. Todos os pares de locos na tabela apresentaram p valores significativos após a correção de Bonferroni (α = 0,00036). Combinação de locos P valor VHL20/AHT VHL20/AHT HTG4/HMS HTG4/AHT HTG4/AHT AHT4/HMS AHT4/AHT AHT4/AHT HMS7/AHT HMS7/AHT

58 55 Tabela 6 (Continuação) Combinação de locos P valor HTG6/HMS HTG6/AHT HTG6/AHT HMS6/AHT HMS6/AHT HTG7/AHT HTG7/AHT HMS3/AHT HMS3/AHT AHT39/UM AHT39/AHT AHT39/UM AHT39/UCDEQ AHT39/UCDEQ UM011/AHT AHT29/UM AHT29/UCDEQ AHT29/UCDEQ Estimativas de freqüências alélicas a partir da amostra de 142 garanhões PSI brasileiros foram utilizadas para calcular os diversos parâmetros de desempenho forense dos locos TKY. Estas estimativas foram comparadas com aquelas obtidas a partir de uma amostra de 250 indivíduos PSI não relacionados do plantel PSI do Japão, dados extraídos de Tozaki et al. (2001a) (Tabela 7). O número de alelos na população PSI 142 variou de um mínimo de quatro para o loco TKY337, até um máximo de nove para os locos TKY321 e TKY325. Uma média de 6,385 alelos/loco foi observada. A heterozigosidade média observada foi de 0,722 e a heterozigosidade média esperada foi de 0,752. Apenas o loco TKY287 apresentou desvio das proporções esperadas pelo EHW e todos os pares de locos estavam em equilíbrio de ligação. O coeficiente de endocruzamento (Fis) dos 13 locos combinados foi estimado em 0,039 com um intervalo de confiança de 0,007 a 0,072 sugerindo a existência de uma pequena mas significativa redução de heterozigosidade devido a cruzamentos aparentados. No plantel de cavalos PSI do Japão, o número de alelos por loco variou de cinco a nove

59 56 para os locos TKY337 e TKY325, respectivamente. A heterozigosidade média observada foi de 0,745 e a heterozigosidade média esperada foi de 0,755. Uma vez que não é possível o acesso aos dados genotípicos do estudo de Tozaki et al. (2001a) não foi possível o teste de EHW com esta população. A variação do poder de exclusão (PE) individual de 24,8% a 67,5% (PSI 142) e 43,7% a 62,1% (PSI JP 250) para TKY374 e 333, TKY287 e 321, respectivamente. O PE combinado para 13 locos comparados no plantel de PSI do Brasil e do Japão foi de 99,983% e 99,996%, respectivamente. De maneira geral não foram observadas diferenças substanciais nas estimativas de PE seja de locos individuais bem como dos locos combinados para a população de PSI brasileiro e PSI japonês.

60 57 Tabela 7. Parâmetros genéticos de desempenho forense dos 13 microssatélites TKY estimados na amostra de 142 garanhões PSI brasileiros e comparação com uma amostra populacional de 250 PSI japonês; estimativas de coeficiente de endocruzamento e teste para Equilíbrio de Hardy Weinberg ( # Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total). População TKY344 TKY343 TKY321 TKY287 TKY312 TKY301 TKY337 TKY374 TKY333 TKY341 TKY325 TKY294 TKY394 Parâmetros forenses PIC (Cont. de Inf. Polimór.) PSI 142 0,735 0,645 0,745 0,668 0,719 0,742 0,688 0,643 0,767 0,615 0,708 0,705 0,766 - PSI JP 250 0,732 0,663 0,745 0,668 0,719 0,71 0,685 0,729 0,743 0,672 0,698 0,694 0,764 - Parâmetros de paternidade Combinado Poder de exclusão PSI 142 0,610 0,403 0,551 0,408 0,617 0,510 0,412 0,248 0,675 0,401 0,477 0,438 0,417 0,99983 PSI JP 250 0,577 0,428 0,599 0,513 0,460 0,541 0,473 0,513 0,486 0,369 0,527 0,434 0,621 0,99996 Índice de Paternidade típico PSI 142 2,574 1,580 2,210 1,598 2,65 2,000 1,609 1,143 3,119 1,573 1,857 1,703 1, ,167 PSI JP 250 2,358 1,667 2,500 2,016 1,786 2,155 1,838 2,016 1,894 1,471 2,083 1,689 2, ,497 Proporções genotípicas Média Ho PSI 142 0,806 0,683 0,773 0,656 0,728 0,759 0,689 0,643 0,840 0,682 0,731 0,706 0,693 0,722 PSI JP 250 0,788 0,700 0,800 0,752 0,720 0,768 0,728 0,752 0,736 0,66 0,76 0,704 0,812 0,745 He PSI 142 0,771 0,701 0,778 0,718 0,761 0,776 0,741 0,758 0,799 0,667 0,748 0,753 0,799 0,752 PSI JP 250 0,773 0,712 0,806 0,767 0,745 0,752 0,735 0,763 0,775 0,712 0,739 0,739 0,795 0,755 N de alelos PSI ,385 PSI JP Fis PSI 142-0,046 0,025 0,006 0,086 0,044 0,022 0,069 0,155-0,051-0,023 0,024 0,062 0,133 0,039 PSI JP 250-0,019 0,017 0,007 0,02 0,034-0,021 0,01 0,014 0,05 0,073-0,028 0,047-0,021 0,014 Pvalor Teste de EHW PSI 142 0,383 0,449 0,290 0,001 0,509 0,855 0,672 0,024 0,560 0,702 0,325 0,310 0,133 0,007 a 0,072 #

61 58 A comparação do poder de exclusão combinado para três diferentes baterias de marcadores microssatélites (nove locos ISAG; 17 locos incluindo os nove recomendados pela ISAG; 13 locos TKY) na amostra populacional de 142 garanhões PSI brasileiros estão apresentados na Tabela 8. Conforme esperado, o menor PE combinado foi observado no conjunto de nove locos ISAG (99,66%), seguido de TKY (99,98%) e os locos ISAG+complementação (99,98%). Os índices de paternidade típicos estimados também seguem esta tendência embora os locos TKY forneçam um índice de paternidade médio maior. Tabela 8. Parâmetros de desempenho forense e paternidade de três diferentes baterias de marcadores microssatélites na população PSI 142. Parâmetros forenses Probabilidade de identidade Poder de discrim. 9 locos ISAG 17 locos (9 ISAG + 8 locos complementares) 13 locos TKY 1,079E-08 6,030E-14 2,408E-13 0, , , individual Parâmetros de paternidade Poder de exclusão 0,9966 0,9998 0,9998 Índice de Paternidade típico 173, , ,167 ISAG Locos recomendados pela ISAG (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, HTG10, ASB2). ISAG + Compl. Nove locos recomendados pela ISAG mais oito locos adicionais (HTG6, HTG7, AHT39, UM011, AHT29, UM010, UCDEQ425, UCDEQ405). TKY 13 locos TKY (TKY344, TKY343, TKY321, TKY287, TKY312, TKY301, TKY337, TKY374, TKY333, TKY341, TKY325, TKY294, TKY394). 5.4 Comparações de PSI brasileiros com PSI de outros países e outras raças criadas no Brasil. A distribuição comparativa de freqüências alélicas de duas populações do plantel brasileiro de PSI (PSI 142 e PSI 597) e uma população do plantel da raça Crioulo (n=710) e Campolina (n=174) criados no Brasil está representada na Figura 8.

62 Frequência Alélica Frequência Alélica 59 VHL20 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 I J K L M N O P Q R S Alelo HTG4 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 K L M N O P Alelo

63 Frequência Alélica Frequência Alélica 60 Figura 8 (Continuação) AHT4 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 H I J K L M N O P Alelo HMS7 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 J K L M N O P Q Alelo

64 Frequência Alélica Frequência Alélica 61 Figura 8 (Continuação) HTG6 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 G I J M N O P R Alelo HMS6 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 K L M N O P Q Alelo

65 Frequência Alélica Frequência Alélica 62 Figura 8 (Continuação) HTG7 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 K M N O P Alelo HMS3 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I M N O P Q R S Alelo

66 Frequência Alélica Frequência Alélica 63 Figura 8 (Continuação) AHT5 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 I J K L M N O Q Alelo ASB2 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 A J I K L M N O P Q R Alelo

67 Frequência Alélica Frequência Alélica 64 Figura 8 (Continuação) HTG10 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I K L M N O P Q R S Alelo AHT39 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo

68 Frequência alélica Frequência Alélica 65 Figura 8 (Continuação) UM011 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo AHT29 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo

69 Frequência Alélica Frequência Alélica 66 Figura 8 (Continuação) UM010 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo UCDEQ425 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo

70 Frequência alélica 67 Figura 8 (Continuação) UCDEQ405 CRIOULO CAMPOLINA PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Alelo Figura 8. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para 17 locos microssatélites utilizados em rotina nas raças eqüinas, Crioulo, Campolina e Puro sangue Inglês (PSI). Duas amostras populacionais da raça PSI estão representadas. As cores dos histogramas correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático. De maneira geral, as raças Crioulo e Campolina apresentaram maior diversidade alélica, ou seja, maior número de alelos em comparação com a raça PSI (Tabela 9). Na análise comparativa dos marcadores recomendados pela ISAG e bateria complementar, foram detectados alelos exclusivos para as três raças estudadas. Dois alelos exclusivos foram observados na raça PSI (ASB2 A e P), quatro alelos na raça Campolina (VHL20 S; HMS7 P; AHT5 I e UCDEQ ) e 15 alelos exclusivos na raça Crioulo (VHL20 J e K; HMS7 Q; HTG6 N; HMS3 S; ASB2 I e L; HTG10 S; AHT e 104; UM ; AHT29 281; UM e 127; UCDEQ ).

71 68 Nas três raças a maioria dos locos apresentou elevadas estimativas de conteúdo informativo para identificação individual e determinação de paternidade. Foi observado um comportamento relativamente homogêneo entre as raças dos locos quanto ao desempenho forense. Por exemplo, nas três raças os locos HTG7 e AHT29 apresentaram o menor ou um dos menores PE. Da mesma forma os locos VHL20 e HMS7 são os mais ou um dos mais informativos nas três raças. Houve também uma concordância entre as três raças no que se refere aos locos que apresentaram desvio do EHW. Os locos AHT29 e HMS3 apresentaram desvio do EHW nas três raças e o loco AHT39 em duas das três raças sugerindo que de fato estes locos apresentam potenciais problemas de alelos nulos inflando de forma artefactual a proporção relativa de homozigotos. Consistente com esta hipótese, particularmente no loco AHT29 a estimativa de Fis é muito alta, variando de 0,233 para PSI até 0,599 para CAM. O menor PE combinado na bateria de 17 locos foi observado na raça PSI (99,976%), seguido de Campolina (99,994%) e Crioulo (99,999%) (Tabela 9). A análise comparativa de duas baterias de locos microssatélites, nove locos ISAG e nove locos ISAG + oito locos complementares, revelou, conforme esperado, uma maior eficiência de exclusão com a bateria expandida de 17 locos nas três raças de eqüinos analisadas (Tabela 10).

72 69 Tabela 9. Parâmetros genéticos de desempenho dos 17 microssatélites (ISAG+Complementação) em três raças de eqüinos; estimativas de coeficiente de endocruzamento (Fis) e pvalor do teste para Equilíbrio de Hardy Weinberg (# Intervalo de confiança a 95% sobre a estimativa de Fis total). Pop. VHL20 HTG4 AHT4 HMS7 HTG6 HMS6 HTG7 HMS3 AHT5 HTG10 ASB2 AHT39 UM011 AHT29 UM010 UCDEQ425 UCDEQ405 Parâmetros forenses Combinado Probabilidade de identidade CRI 0,083 0,131 0,060 0,079 0,160 0,130 0,243 0,081 0,078 0,095 0,078 0,059 0,089 0,235 0,071 0,100 0,049 5,31E-18 CAM 0,035 0,141 0,070 0,089 0,206 0,227 0,397 0,240 0,099 0,100 0,105 0,131 0,071 0,325 0,186 0,152 0,170 2,08E-15 PSI 597 0,117 0,289 0,127 0,082 0,245 0,237 0,251 0,113 0,138 0,113 0,064 0,198 0,071 0,260 0,154 0,227 0,389 2,85E-14 Expresso em 1 em... CRI 12,000 7,655 16,619 12,589 6,235 7,683 4,100 12,285 12,797 10,503 12,867 16,888 11,266 4,256 14,008 10,000 20,551 - CAM 28,190 7,104 14,214 11,289 4,863 4,413 2,519 4,165 10,097 10,000 9,528 7,653 14,108 3,073 5,383 6,583 5,887 - PSI 597 8,578 3,465 7,884 12,168 4,086 4,220 3,987 8,861 7,264 8,854 15,610 5,052 14,029 3,852 6,490 4,414 2,570 - Poder de discrim. individual CRI 0,917 0,869 0,940 0,921 0,840 0,870 0,757 0,919 0,922 0,905 0,922 0,941 0,911 0,765 0,929 0,900 0,951 0, CAM 0,965 0,859 0,930 0,911 0,794 0,773 0,603 0,760 0,901 0,900 0,895 0,869 0,929 0,675 0,814 0,848 0,830 0, PSI 597 0,883 0,711 0,873 0,918 0,755 0,763 0,749 0,887 0,862 0,887 0,936 0,802 0,929 0,740 0,846 0,773 0,611 0, PIC CRI 0,750 0,663 0,792 0,757 0,617 0,664 0,510 0,742 0,755 0,757 0,754 0,794 0,724 0,583 0,773 0,720 0,812 - CAM 0,855 0,660 0,775 0,758 0,570 0,557 0,353 0,523 0,714 0,723 0,727 0,659 0,776 0,509 0,584 0,628 0,613 - PSI 597 0,713 0,424 0,692 0,740 0,519 0,550 0,549 0,632 0,637 0,718 0,808 0,554 0,774 0,463 0,650 0,407 0,344 - Parâmetros de paternidade Combinado Poder de exclusão CRI 0,602 0,436 0,655 0,622 0,364 0,428 0,287 0,362 0,586 0,668 0,546 0,595 0,480 0,103 0,644 0,535 0,616 0, CAM 0,673 0,412 0,597 0,608 0,347 0,395 0,123 0,128 0,461 0,646 0,488 0,354 0,555 0,041 0,310 0,395 0,411 0, PSI 597 0,538 0,191 0,460 0,585 0,322 0,279 0,311 0,384 0,543 0,424 0,562 0,201 0,575 0,160 0,361 0,251 0,126 0, Índice de Paternidade típico CRI 2,520 1,696 2,929 2,661 1,455 1,667 1,240 1,450 2,413 3,058 2,182 2,474 1,867 0,808 2,836 2,120 2, ,125 CAM 3,107 1,611 2,486 2,559 1,403 1,554 0,853 0,865 1,792 2,857 1,900 1,426 2,231 0,657 1,300 1,553 1, ,662 PSI 597 2,140 1,008 1,787 2,411 1,334 1,219 1,303 1,518 2,167 1,650 2,269 1,030 2,344 0,938 1,447 1,150 0, ,106 Proporções genotípicas Média Ho CRI 0,794 0,694 0,837 0,806 0,663 0,702 0,593 0,645 0,797 0,836 0,773 0,798 0,719 0,374 0,815 0,765 0,824 0,731 CAM 0,839 0,690 0,799 0,805 0,644 0,678 0,414 0,422 0,721 0,825 0,737 0,649 0,776 0,239 0,615 0,678 0,689 0,660 PSI 597 0,766 0,503 0,720 0,792 0,625 0,589 0,617 0,672 0,769 0,697 0,780 0,515 0,787 0,467 0,654 0,565 0,419 0,643 He CRI 0,780 0,702 0,811 0,785 0,662 0,703 0,561 0,773 0,789 0,787 0,786 0,818 0,735 0,654 0,802 0,754 0,838 0,749 CAM 0,871 0,702 0,805 0,792 0,640 0,626 0,374 0,586 0,751 0,766 0,771 0,708 0,806 0,593 0,617 0,676 0,659 0,691 PSI 597 0,744 0,545 0,722 0,785 0,589 0,600 0,599 0,729 0,718 0,760 0,834 0,607 0,796 0,609 0,681 0,564 0,424 0,665 N de alelos CRI ,353 CAM ,235 PSI ,882 Fis CRI -0,017 0,011-0,032-0,027-0,001 0,002-0,056 0,165-0,009-0,063 0,017 0,024 0,022 0,429-0,016-0,014 0,017 0,024 CAM 0,037 0,018 0,008-0,015-0,006-0,083-0,107 0,280 0,041-0,077 0,045 0,083 0,038 0,599 0,003-0,003-0,044 0,045 PSI 597-0,030 0,076 0,003-0,009-0,061 0,018-0,030 0,078-0,072 0,084 0,066 0,152 0,012 0,233 0,040-0,003 0,012 0,033 Pvalor Teste de EHW CRI 0,215 0,091 0,487 0,317 0,919 0,035 0,285 0,000 0,111 0,142 0,149 0,000 0,067 0,000 0,115 0,0003 0,118-0,014 a 0,078 # CAM 0,220 0,003 0,124 0,207 0,689 0,608 0,612 0,000 0,411 0,975 0,260 0,070 0,393 0,000 0,054 0,901 0,523-0,009 a 0,123 # PSI 597 0,119 0,017 0,144 0,783 0,426 0,606 0,189 0,000 0,471 0,278 0,159 0,000 0,069 0,000 0,773 0,210 0,230-0,0008 a 0,068 #

73 70 Tabela 10. Comparação de parâmetros forenses, heterozigosidades e número de alelos/loco de duas baterias de marcadores microssatélites: nove locos ISAG (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HMS6, HMS3, AHT5, HTG10, ASB2) e 17 locos sendo os nove ISAG + oito de complementação (VHL20, HTG4, AHT4, HMS7, HTG6, HMS6, HTG7, HMS3, AHT5, HTG10, ASB2, AHT39, UM011, AHT29, UM011, UCDEQ425, UCDEQ405), em três raças de eqüinos criadas no Brasil (CRI Crioulo; CAM Campolina; PSI Puro Sangue Inglês). População ISAG 9 locos ISAG + COMPL 17 locos Parâmetros forenses Probabilidade de identidade CRI 3,18E-10 5,31E-18 CAM 1,76E-09 2,08E-15 PSI 597 9,34E-09 2,85E-14 Poder de discrim. individual CRI 0, , CAM 0, , PSI 597 0, , Parâmetros de paternidade Poder de exclusão CRI 0, , CAM 0, , PSI 597 0, , Índice de Paternidade típico CRI 1295, ,125 CAM 416, ,662 PSI , ,106 Proporções genotípicas Ho CRI 0,765 0,731 CAM 0,724 0,660 PSI 597 0,699 0,643 He CRI 0,768 0,749 CAM 0,741 0,691 PSI 597 0,715 0,665 N médio de alelos por loco CRI 8,333 8,353 CAM 7,444 7,235 PSI 597 5,889 5,882 A distribuição de freqüências alélicas de cada loco ISAG foi semelhante nas populações PSI 597, PSI 142 e PSI de outros estudos como Coréia (Lee e Cho, 2006) e Eslováquia (Jakabová et al. 2002) (Figura 9). Os microssatélites AHT4, AHT5 e HTG10 não foram utilizados na população de PSI da Eslováquia, portanto esses locos foram comparados somente entre as demais populações. No

74 Frequência Alélica Frequência Alélica 71 plantel de PSI da Eslováquia foram detectados alelos exclusivos com freqüência inferior a 3,8% em todos os seis locos comparados. Na população de eqüinos da Coréia foram observados dois alelos exclusivos no loco HTG10 e no plantel brasileiro foi observado apenas um alelo do loco AHT5 que não está presente nos plantéis dos outros países comparados. VHL20 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 H I J K L M N O P Q Alelo HTG4 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 J K L M N O P Alelo Figura 8 (continuação)

75 Frequência Alélica Frequência Alélica 72 AHT4 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Alelo H I J K L M N O HMS7 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 H I J K L M N O P Alelo Figura 9 (continuação)

76 Frequência Alélica Frequência Alélica 73 HMS6 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 Alelo J K L M N O P Q HMS3 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 H I J K L M N O P Q R S Alelo Figura 9 (continuação)

77 Frequência Alélica Frequência Alélica 74 AHT5 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 I J K L M N O Q Alelo ASB2 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,35 0,25 0,15 0,05-0,05 A J I K L M N O P Q R S Alelo Figura 9 (continuação)

78 Frequência Alélica 75 HTG10 PSI Eslováquia PSI Coréia PSI 597 PSI 142 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I K L M N O P Q R S Alelo Figura 9. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para os 9 locos microssatélites recomendados pela ISAG em planteis de Puro Sangue Inglês no Brasil (PSI 597 e PSI 142), Eslováquia e Coréia. Não foram incluídos na análise os locos AHT4, AHT5 e HTG10 para a população de PSI da Eslováquia, pois estes não haviam sido estudados no trabalho de referência. As cores dos histogramas correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático. As freqüências alélicas dos 13 locos TKY também apresentaram uma distribuição semelhante entre o plantel de PSI do Brasil (PSI 142) e do Japão (PSI JP 250) (Figura 10), com exceção do loco TKY374 que apresentou diferenças marcantes de freqüência nos alelos L e M. Foram observados alelos exclusivos para a população PSI JP 250 (nove locos) e PSI 142 (quatro locos) com freqüência inferior a 4,3% e 10%, respectivamente.

79 Frequência alélica Frequência alélica 76 TKY344 PSI (JP) PSI 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I K M O P Q Alelo TKY343 PSI (JP) PSI 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 J M N O Q S T U V Alelo

80 Frequência alélica Frequência alélica 77 Figura 10 (Continuação) TKY321 PSI (JP) PSI 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 I J L M O Q R S Alelo TKY287 PSI (JP) PSI 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 I J K Alelo N O P Q R S

81 Frequência alélica Frequência alélica 78 Figura 10 (Continuação) TKY312 PSI (JP) PSI 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 G I M N O P Q R Alelo TKY301 PSI (JP) PSI 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 K L M N O P S Alelo

82 Frequência alélica Frequência alélica 79 Figura 10 (Continuação) TKY337 PSI (JP) PSI 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 L M O P Q Alelo TKY374 PSI (JP) PSI 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 J K L M O P Q Alelo

83 Frequência alélica Frequência alélica 80 Figura 10 (Continuação) TKY333 PSI (JP) PSI 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 J K Q R S T U Alelo TKY341 PSI (JP) PSI 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 I J K L M N O Q Alelo

84 Frequência alélica Frequência alélica 81 Figura 10 (Continuação) TKY325 PSI (JP) PSI 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 F I J L M O P Q R Alelo TKY294 PSI (JP) PSI 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10 J M N O P Q Alelo

85 Frequência alélica 82 Figura 10 (Continuação) TKY394 PSI (JP) PSI 0,35 0,25 0,15 0,05-0,05 J K L M O P Alelo Figura 10. Histogramas de distribuição de freqüências alélicas para os 13 locos microssatélites TKY em planteis de Puro Sangue Inglês no Brasil (PSI 142) e do Japão (PSI JP 250). As cores dos histogramas correspondem às cores das fluorescências utilizadas para detecção dos locos no seqüenciador automático.