Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante Viviane Hiromi Uchida Orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria Lima Duarte Natal/RN Dezembro/2014

2 Viviane Hiromi Uchida Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de mestre em Engenharia Química, sob orientação da Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte. Natal/RN Dezembro/2014

3 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / CT / DEQ Biblioteca Setorial Professor Horácio Nícolás Sólimo. Uchida, Viviane Hiromi. Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante / Viviane Hiromi Uchida. - Natal, f.: il. Orientador: Márcia Maria Lima Duarte. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. 1. Pigmentos vegetais - Dissertação. 2. Antocianinas - Dissertação. 3. Antioxidantes - Dissertação. 4. Compostos fenólicos - Dissertação. I. Duarte, Márcia Maria Lima. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF CDU /.276 (043.3)

4 UCHIDA, V. H. Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de concentração: Engenharia Química, Natal, Brasil, Orientadora: Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte Resumo: A Terminalia catappa Linn pertencente à família Combretaceae, popularmente conhecida como castanhola, possui frutos constituídos por uma polpa carnosa, semente arredondada e uma casca muito dura. A pigmentação natural existentes no fruto da castanhola indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencentes ao grupo dos flavonóides, que apresentam atividade antioxidante. A presente pesquisa foi realizada com a castanhola e teve como principal objetivo o estudo de fatores que influenciam a extração de corantes a partir de sua polpa. Os extratos foram obtidos utilizando-se um reator enjaquetado por extração sólido líquido. Os fatores avaliados foram a temperatura, o tempo, a proporção do solvente e o ph de extração. Adotando-se um planejamento fatorial de 2 4, com 4 repetições no ponto central, os efeitos destes fatores sobre o processo de extração foram analisados utilizando-se o software Statistica 7.0. A atividade antioxidante (AA), o teor de compostos fenólicos totais (CFT) e o teor de antocianinas monoméricas totais (AMT) foram avaliadas como variáveis resposta do planejamento. Na análise estatística dos resultados, os efeitos que mais influenciaram a extração foram diferentes para cada uma das respostas (CFT, AMT e AA). No entanto o ph se mostrou significativo para a extração de todos os compostos. O comportamento cinético da extração do corante também foi estudado para os compostos fenólicos totais, antocianinas monoméricas e atividade antioxidante, em que o equilíbrio foi atingido após os 90 minutos de extração. No estudo da estabilidade das antocianinas a temperatura foi o fator que mais influenciou na estabilidade, contudo a concentração e o ph também tiveram influência. Palavras-chave: Terminalia catappa Linn, compostos fenólicos, antocianinas, atividade antioxidante.

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6 UCHIDA, V. H. Extraction of dye from the fruit of castanhola (Terminalia catappa Linn) and studies of its phenolic compounds, anthocyanins and antioxidant activity. Dissertation, UFRN, Graduate Program in Chemical Engineering, Area of Concentration: Chemical Engineering, Natal, Brazil, 2014 Advisor: Dr. Marcia Maria Lima Duarte Abstract: The Terminalia catappa Linn belonging to Combretaceae family, popularly known as castanets, has fruits consists of a fleshy pulp, rounded seed and a very hard shell. The natural pigmentation existing in the fruit of castanet indicates the presence of anthocyanins, phenolic nature components belonging to the group of flavonoids, which have antioxidant activity. This research was conducted with the castanets and aimed to the study of factors influencing the extraction of dyes from its pulp. The extracts were obtained using a reactor enjaquetado by solid-liquid extraction. The factors were evaluated as temperature, time, solvent ratio and ph extraction. Adopting a factorial design of 2 4, with 4 repetitions at the central point, the effects of these factors on the extraction process were analyzed using Statistica 7.0 software. The antioxidant activity (AA), the content of phenolic compounds (CFT) and the total monomeric anthocyanin content (AMT) were evaluated as response variables planning. Statistical analysis of the results, the effects that influenced the extraction were different for each response (CFT, AMT and AA). However, the ph was significant for the extraction of all compounds. The kinetic behavior of the dye extraction was also studied for phenolic compounds, monomeric anthocyanins and antioxidant activity, in which the equilibrium was reached after 90 minutes of extraction. To study the stability of anthocyanins temperature was the factor that most influenced the stability, however the concentration and ph also played a part. Keywords: Terminalia catappa Linn, phenolic compounds, anthocyanins, antioxidant activity.

7 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente aos meu pais que tanto me ajudaram na realização de meus estudos. Ás professoras Márcia Maria e Ana Lúcia pela orientação, paciência e transmissão de conhecimento que muito contribuíram para a minha formação. Aos meus colegas do Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Glenda, Mayara, Isadora, Camila, Thaise, professora Fátima e especialmente a Thais pela amizade, companheirismo e por todas as sugestões para o desenvolvimento deste trabalho. Não poderia esquecer dos meus amigos Suzara, Emyliane, Indira, Paula e Pedro pelos momentos ótimos e por sempre estarem ao meu lado. Ao meu namorado Marcelo pela ajuda que me forneceu no mestrado e principalmente amor e paciência durante tantos anos. As minhas amigas queridas de longa data, Dalva e Sabrina que tanto me incentivaram nos estudos. Por fim, agradeço à CAPES e à UFRN pelo apoio financeiro deste projeto.

8 SUMÁRIO 1 - INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Castanhola (Terminalia catappa Linn) Composição nutricional da castanhola Compostos fenólicos Flavonóides Antocianinas Estabilidade das antocianinas Copigmentação ph Temperatura Luz Ação antioxidante Extração sólido-líquido por imersão Solvente Metodologia da superfície de resposta Análise da variância MATERIAIS E MÉTODOS Matéria-prima Obtenção do corante por extração sólido-líquido Seleção do fruto e obtenção da polpa Secagem e moagem e análise granulométrica Planejamento Experimental Extração sólido-líquido por imersão Análises do extrato Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT) Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT) Estudo cinético do processo de extração Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos RESULTADOS E DISCUSSÕES Extração do corante e avaliação do planejamento... 38

9 4.3 - Análise da superfície de resposta Atividade antioxidante Compostos Fenólicos Totais Antocianinas monoméricas totais Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante Estudo Cinético do processo de extração Análise do comportamento cinético ESTUDOS DA ESTABILIDADE DE ANTOCIANINAS PRESENTES NO EXTRATO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICE I. CURVAS DE CALIBRAÇÃO... 76

10 LISTA DE FIGURAS Figura Ávore de castanhola... 5 Figura Fruto da castanhola... 6 Figura Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%)... 7 Figura Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas Figura Biossintese dos Flavonoides Figura Estruturas químicas dos principais flavonóides Figura Forma básica das antocianinas Figura Estrutura química das antocianinas Figura Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do ph Figura Fluxograma do processo de extração do corante Figura Pó da castanhola pronta para a extração Figura Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático Figura Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de KH 2 PO 4 (ph = 6) e KCl (ph = 3) Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade antioxidante Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos Fenólicos Totais Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas Monomérica Totais Figura Diagrama de Pareto para AA Figura Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o ph (2by4) para a extração da atividade antioxidante Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o ph (1by4) para a extração da atividade antioxidante Figura Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos Figura Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o ph(1by4) para a extração de compostos fenólicos Figura Diagrama de Pareto para as antocianinas... 49

11 Figura Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3) para a extração de antocianinas Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a extração de antocianinas Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o ph (1by4) para a extração de antocianinas Figura Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com antocianinas com r = 0, Figura Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com a atividade antioxidante com r = 0, Figura Correlação entre a extração das antocianinas com a atividade antioxidante com r = 0, Figura Concentração dos compostos fenólicos em função do tempo nas condições de 50 C, 50% de etanol e ph igual a 3, Figura Concentração de antocianinas em função do tempo nas condições de 50 C, 75% de etanol e ph igual a 3, Figura Concentração de atividade antioxidante em função do tempo nas condições de 50 C, 75% de etanol e ph igual a 3, Figura Gráfico da porcentagem de degradação em função das temperaturas a, ph e a porcentagem da concentração em cada um dos ensaios Figura Curva de calibração para CFT Figura Curva de calibração de AA... 76

12 LISTA DE TABELAS Tabela Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais Tabela Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola Tabela Parâmetros físicos da castanhola Tabela Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de operação para a recuperação de compostos bioativos naturais Tabela Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela ANOVA Tabela Planejamento experimental 2 4 (4 fatores e 2 níveis) Tabela Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (x i ) da massa retida em cada peneira Tabela Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e antocianinas da polpa do fruto de castanhola Tabela Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT Tabela Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT Tabela Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT respectivamente Tabela Concentrações de CFT, AMT e AA com o tempo de extração Tabela porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 25 C Tabela Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 60 C... 59

13 LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES AA Atividade antioxidante CFT Compostos fenólicos totais AMT Antocianinas monoméricas totais DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (C 18 H 12 N 5 O 6 ) Ci-3-gli Cianidina-3-glicosídeo GAE Equivalentes em ácido gálico %SRL Porcentagem do radical livre ANOVA Análise da variância

14 CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO

15 Capítulo 1 - Introdução 1- Introdução Terminalia catappa Linn (da família Combretaceae), popularmente conhecida como castanhola, cresce em regiões tropicais e subtropicais, particularmente localizadas em áreas costeiras (RODRIGUES, 2012). Ela é nativa de áreas próximas a regiões costeiras do Oceano Índico. Os frutos da castanhola possuem uma polpa carnosa, contendo em seu interior uma semente arredondada e rica em óleo, envolvida por uma casca muito dura (LIMA, 2012). A coloração do fruto é verde passando ao amarelo e vermelho quando maduros. Eles são comestíveis, fonte de proteínas e lipídios e são utilizados como alimentos, aves e outros animais (MARQUES et al., 2013). A pigmentação natural presente no fruto da castanhola indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencente ao grupo dos flavonóides, que apresentam atividade antioxidante. Os corantes são adicionados aos alimentos por várias razões, que incluem as perdas ou alterações da cor natural que ocorrem durante o processamento e estocagem, ou ainda por problemas de matérias-primas de origens diferentes (AZEREDO, 2012). Além disso, se espera ver nos alimentos, principalmente naqueles processados, uma aparência natural que os torna atraentes. Tem havido uma tendência crescente para substituir os tradicionais corantes artificiais, empregados em alimentos industrializados, pelos corantes naturais, em virtude dos efeitos nocivos, tal como alergias, apresentados por alguns corantes artificiais (OLIVEIRA, 2005). Os corantes naturais estão espalhados pela natureza, geralmente nos frutos, nos vegetais, nas sementes e nas raízes. Estes pigmentos apresentam propriedades físicas e químicas muito distintas, são sensíveis à oxidação, as mudanças de ph, à luz e apresentando uma estabilidade muito inferior a dos corantes sintéticos (MEINICKE, 2008). Muitos dos pigmentos naturais utilizados, inicialmente, com o objetivo de colorir os alimentos, são fotoquímicos com um elevado poder antioxidante (PEREIRA et al., 2008; SOUSA et al., 2011). O fato que as reações de oxidação podem estar relacionadas com o aparecimento de diversas doenças, impulsiona o desenvolvimento de métodos de extração de corantes naturais e inúmeros investimentos na sua aplicação industrial. Um grupo de antioxidante bastante estudado é o das antocianinas, pertencentes a um dos maiores grupos de pigmentos solúveis em água. Esses pigmentos naturais são encontrados em diversas plantas e, em elevada quantidade, em diversos frutos. Estes compostos são potentes antioxidantes e apresentam uma forte atividade bioquímica e farmacológica, que 2

16 Capítulo 1 - Introdução inclui efeitos anticarcinogênicos, anti-inflamatórios e antimicrobianos (SALES, 2013). As antocianinas que são extraídas de certas plantas e frutos comestíveis são utilizadas como corantes alimentares. Estas constituem uma das subclasses dos flavonoides, compostos polifenólicos constituídos por dois anéis de benzeno e um anel central heterocíclico contendo oxigênio. A extração dos produtos naturais depende de uma série de fatores, tais como suas propriedades físico-químicas e a finalidade a que se destina. Por isso existem vários fatores que influenciam a extração de corantes como: Tamanho da partícula, solvente, temperatura e ph. Este trabalho propõe o estudo do processo de extração do corante do fruto da castanhola (Terminalia catappa Linn) e, o estabelecimento das melhores condições para o processo de extração do corante, caracterizando o extrato obtido em suas principais potencialidades. O estudo propõe realizar extrações sólido-líquido por imersão mediante o controle de parâmetros por planejamento, para se conhecer a influência dos parâmetros no processo de extração: relação do solvente, temperatura, tempo e ph. Propõe-se ainda descrever a curva cinética dos compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante no processo de extração em estudo baseado nas condições de operação ótimas do sistema. Finalmente o presente trabalho teve por objetivo o estudo da estabilidade do corante visando o seu armazenamento e a utilização em alimentos. 3

17 CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

18 Capítulo 2 Revisão bibliográfica 2 - Revisão bibliográfica Castanhola (Terminalia catappa Linn) A castanhola existe em grande quantidade na região Nordeste. A amendoeira-da-praia (Terminalia catappa Linn) com origem na Índia e Malásia, também chamada de castanhola, é uma árvore de grandes dimensões que pode atingir 35 metros de altura. Foi introduzida no Brasil pelos Portugueses no período de colonização do país e se adaptou em diversos climas. Esta árvore (Figura 2.1) foi bastante cultivada ao longo do litoral brasileiro. Como é muito resistente à salinidade e aos efeitos do vento, desenvolve-se bem na areia das praias. Figura Ávore de castanhola O fruto da castanhola (Figura 2.2) apresenta uma coloração entre o verde intenso e o vermelho rubro. Embora seja abundante em algumas regiões, seu consumo in natura é moderado. As cascas da castanhola são usadas como diurético e as folhas agem como sudorífico e contra a dor de cabeça (PAWAR et al., 2002). 5

19 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Figura Fruto da castanhola Composição nutricional da castanhola Alimentos de origem vegetal contêm quantidades significativas de compostos bioativos, que fornecem benefícios à saúde e são desejáveis além da nutrição básica (CARTEA et al., 2011). O consumo de frutas está recebendo uma maior atenção, devido principalmente ao fato destas apresentarem propriedades funcionais serem reconhecidas como fontes de vitaminas, minerais e fibras, logo são alimentos nutricionalmente importantes da dieta (MELO et al., 2008). Segundo Kuskoski et al. (2006), o consumo de frutas tropicais tem aumentado com o passar do tempo devido ao valor nutritivo e aos efeitos terapêuticos. Vizzotto (2013) relata que frutas vermelhas, possuem diferentes grupos de fitoquímicos e que podem trazer benefícios para a saúde humana quando consumidos como parte da dieta habitual. Têm sido desenvolvidas pesquisas envolvendo compostos antioxidantes provenientes de fontes naturais, devido a sua importância na prevenção de reações oxidativas, já que os antioxidantes podem agir retardando ou prevenindo a oxidação do substrato envolvido nos processos oxidativos e, portanto impedindo a formação de radicais livres (BROINIZI et al. 2007). Segundo Cartea et al. (2011) os efeitos benéficos do Brássicas (família de hortaliças) para a melhoria da saúde têm sido, em parte, atribuídos à fitoquímicos que possuem atividade antioxidante. Estudos anteriores têm demonstrado que as frutas são ricas em muitos nutrientes e compostos antioxidantes, e que esses constituintes se concentram em sua grande maioria nas cascas e sementes (COSTA et al., 2000; MELO et al., 2008; ABRAHÃO et al., 2010 apud SOUSA et al., 2011). A maior parte do efeito antioxidante das frutas é devido, principalmente, à presença de compostos fenólicos, que têm sido associados com características de sabor e cor dos frutos e legumes (CARTEA et al., 2011). 6

20 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Existe diferença nos teores de compostos bioativos em espécies de diferentes frutas vermelhas (VIZZOTTO et al., 2013). Segundo Broinizi et al. (2007) frutas e outros vegetais contêm substâncias antioxidantes distintas. Melo et al. (2008) estudaram a habilidade de sequestrar o radical estável 1,1-difenil-2- picrilhidrazil (DPPH), em diversas frutas tropicais (Figura 2.3), com extratos aquosos e acetônicos. Foi constatado que todas as frutas estudadas apresentaram capacidade antioxidante, entretanto a intensidade desta ação foi diferenciada entre elas. Figura Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%). Fonte: (MELO et al., 2008) Sousa et al. (2011) disseram que as frutas não são fontes de proteínas, entretanto esse macronutriente é predominantemente nas cascas e sementes. Os compostos fenólicos presentes nas plantas estão relacionados, principalmente, com a proteção, conferindo alta resistência a microrganismos e pragas (ROCHA et al., 2011). Nos alimentos, estes compostos podem influenciar o valor nutricional e a qualidade sensorial, conferindo atributos como cor, textura, amargor e adstringência. Na maioria dos vegetais, os compostos fenólicos constituem os antioxidantes mais abundantes (EVERETTE et al., 2010). 7

21 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Tabela Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais. Fonte: Sousa, et al. (2011) Resíduo Umidade% Cinzas% Proteína% Lipídios% Carboidratos Calorias totais% (100g) Goiaba 65,54 ±0,32a 0,72 ±0,02a 2,82 ±0,19a 2,94 ±0,01c 27, Acerola 83,45 ±0,06b 0,55 ±0,03a 1,65 ±0,26b 3,59 ±0,15d 10,76 82 Abacaxi 88,19 ±0,80b 0,53 ±0,04a 1,05 ±0,01b 0,69 ±0,03a 9,54 49 Graviola 83,16 ±0,83b 0,48 ±0,04a 1,09 ±0,07b,c 2,28 ±0,13b 12,99 77 Bacuri 85,81 ±0,13b 0,65 ±0,28a 0,56 ±0,03b,c 3,84 ±0,02e 9,14 74 Cupuaçu 93,86 ±0,08b 0,20 ±0,12a 1,65 ±0,38c 3,69 ±0,02d 0,6 42 a,b,c,d,e médias, na mesma coluna, seguidas de letras diferentes, diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A composição nutricional dos frutos pode variar em função das condições climáticas, do solo e do manuseio (Augusta, 2011). A castanhola possui um teor de umidade bem abaixo em relação às frutas apresentadas na Tabela 2.1. De acordo com a Tabela 2.2 pode-se observar que a castanhola possui uma quantidade mais elevada de carboidratos e calorias em relação a outras frutas apresentadas na Tabela 2.1. Tabela Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola. Fonte Marques et al. (2013) Nutrientes Castanhola Umidade 17,2 ± 1,13 Lipídios 2,79 ± 0,58 Proteínas 2,30 ± 0,00 Carboidratos 76,88 ± 0,58 Vitamina C (mg.100 g -1 ) 0,22 ± 0,00 Valor energético total (TEV) (kcal.100 g -1 ) 341,83 8

22 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Tabela Parâmetros físicos da castanhola. Fonte Marques et al. (2013) Parâmetros Valores obtidos Numero de frutos 20 Média do peso dos frutos (g) 19,60 ± 0,00 Polpa (g) 11,24 ± 2,35 Casca (g) 1,08 ± 0,00 Semente (g) 7,28 ± 0,59 Rendimento da polpa (%) 57,34 Porcentagem da casca 5,51 Porcentagem da semente 97,14 Altura (cm) 4,32 ± 0,00 Largura (cm) 3,16 ± 0,00 Espessura (cm) 2,57 ± 0,00 Sólidos solúveis (ºBrix) 8 ± 0,00 De acordo com Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a quantidade de flavonóides em alimentos são determinados geneticamente, entretanto fatores como estação do ano, clima, composição do solo, estágio de maturação, preparo, processamento e estocagem dos alimentos podem influenciam nestas concentrações (HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA, 2008). Vizzotto (2013) afirma que existe diferença nos teores de compostos bioativos em diferentes espécies de frutas vermelhas. Nos frutos de castanhola existem diferentes quantidades de compostos bioativos dependendo da maturação ou em condições climáticas e de solos diferentes. Embora os frutos da castanhola não sejam explorados comercialmente, segundo Marques et al. (2013), estes possuem um elevado teor calórico e podem ser usados como uma fonte de hidratos de carbono, sendo uma fonte de compostos fenólicos com propriedades antioxidantes. 9

23 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Compostos fenólicos Os compostos fenólicos são substâncias bastante distribuídas na natureza que estão presentes em vegetais. Estes estão presentes nos alimentos como ácidos fenólicos, flavonóides, lignanas, estilbenos, coumarinas, e taninos (BERTOLD, 2006). Segundo Shahidi e Naczk (2004a), os compostos fenólicos também podem agir como antibióticos, pesticidas naturais, agentes de proteção contra radiação ultravioleta (UV), materiais isolantes para fazer as paredes das células impermeáveis à água e gás como materiais estruturais para dar estabilidade plantas. Desses compostos fazem parte os pigmentos que dão a aparência colorida aos alimentos, sabor e adstringência, sendo produtos do metabolismo secundário, derivando de reações de defesa das plantas contra agressões do ambiente (SILVA et al., 2010; SOTO et al. 2011). Segundo Ignat et al. (2011), estes compostos são de grande importância fisiológica e morfológica em plantas. Os compostos fenólicos possuem um anel aromático com um ou mais grupos hidroxilos variando de uma molécula fenólica simples para compostos altamente polimerizados (BALASUNDRAM et al., 2006; IGNAT et al., 2011). Os compostos fenólicos obtidos dos vegetais são constituídos de fenóis simples, ácidos fenólicos (tanto benzóico e derivados do ácido cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos hidrolisáveis e condensados, lignanas e ligninas (SHAHIDI e NACZK, 2004a). Várias pesquisas estão sendo feitas para os compostos fenólicos, pois demonstram que estes compostos possuem a capacidade de capturar radicais livres, e por isso podem prevenir várias doenças degenerativas. A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura química. Segundo Sousa et al. (2007) estas características desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres. Sousa et al. (2007) ainda afirmam que os intermediários formados pela ação de antioxidantes dos compostos fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias. Os compostos fenólicos que ocorrem em alimentos pertencem à família dos fenilpropanóides (C6-C3) que são derivados de ácido cinâmico (ANGELO e JORGE, 2006). Estes compostos não estão de forma homogênea nos frutos e vegetais, assim como as classes e subclasses destes compostos (CRUZ, 2008). 10

24 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Segundo Cartea et al. (2011) estudos recentes sugerem que os vegetais podem ser uma boa fonte de antioxidantes naturais, devido aos altos níveis de carotenóides, tocoferóis e ácido ascórbico. Os compostos fenólicos são derivados metabólicos da fenilalanina que é produzida em células vegetais (CRUZ, 2008). Por meio da eliminação de uma molécula de amônia, a fenilalanina se transforma no ácido cinâmico (Figura 2.4), onde é catalisada pela fenilalanina amonialiase (PAL) (AZEVEDO, 2010). Esta é uma etapa reguladora na formação de vários compostos fenólicos nos vegetais. Figura Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas. Fonte: Shahidi e Naczk (2004a) 11

25 Capítulo 2 Revisão bibliográfica 2.3 Flavonóides Os flavonóides são metabólicos secundários sintetizados pelas plantas (HUBER et al., 2008). Segundo Kahkonen et al. (1999) os principais subgrupos de flavonóides em frutos são as antocianinas, flavonóis, e catequinas. Estes compostos são formados a partir de fenilalanina (Figura 2.4), a condensação de compostos C3-C6 através da participação de malonil-coenzima A, conduz à formação de chalconas, e sob condições ácidas, produz flavonóides e isoflavonas, entre outros (SHAHIDE e NACZK, 2004) (Figura 2.5). Figura 2. 5: Biossintese dos Flavonoides. Fonte: Shahidi e Naczk. (2004b) Sugundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a estrutura dos flavonóides é baseada no núcleo que consiste de dois anéis fenólicos A e B e um anel C, e que se diferem em dois grupos: pirano heterocíclico (flavanóis e antocianidinas) e pirona (flavonóis, flavonas, isoflavonas e flavanonas) que compreendem as principais classes dos flavonóides (Figura 2.6). 12

26 Capítulo 2 Revisão bibliográfica As classes de flavonoides que são consideradas as mais importantes são os flavonóis e as antocianidinas (MARÇO e POPPI, 2008). Segundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a atividade biológica dos flavonóides e de seus metabólitos depende da sua estrutura química e dos vários substituintes da molécula, já que é possível a estrutura básica sofrer uma série de modificações como a glicosilação, esterificação, amidação, hidroxilação, que podem alterar a polaridade, toxicidade e direcionamento intracelular. Figura Estruturas químicas dos principais flavonóides. Fonte: Huber e Rodriguez- Amaya. (2008) 13

27 Capítulo 2 Revisão bibliográfica Antocianinas Antocianinas são importantes flavonóides que são responsáveis por apresentarem cores visíveis ao olho humano presentes nas flores, frutas e folhas desempenhando um papel importante na sobrevivência fisiológico das plantas (HARBORNE e WILLIAMS, 2000). Segundo Harborne e Williams (2000), a cor vermelho-púrpura que aparece nas flores das orquídeas são derivados de cianidina e glicosídeos peonidina, com ligações de açúcares acilados. As antocianinas possuem uma estrutura principal chamada de aglicona e tem como cromóforo básico o 2-fenilbenzopirílio, também conhecido como catião flavílio (Figura 2.7) (COSTA, 2012). As antocianinas são classificadas de acordo com o número de moléculas de hidratos de carbono (ou glicosídeos) ligadas ao cromóforo em monoglicosiladas, diglicosiladas e triglicosiladas (COSTA, 2012). Figura Forma básica das antocianinas. Fonte: Cruz (2008) As funções que as antocianinas desempenham nas plantas são: ação antioxidante, proteção à luz, mecanismo de defesa e função biológica (LOPES et al., 2007b) Segundo Cruz (2008), as antocianinas se apresentam no vegetal mais predominantemente na forma de mono ou di-glicosídeos, e muito pouco na forma de agliconas. As antocianinas são pigmentos naturais e por isso, são responsáveis por uma variedade de cores nas frutas (Figura 2.8), flores e folhas, que variam do vermelho ao azul (SANTOS et al., 2014). Enquanto que as chalconas e flavonas são amarelos. Essas cores variam de acordo com as ligações feitas no anel B nos radiais R1 e R2 (Figura 2.8). 14

28 Capítulo 2 Revisão bibliográfica em água. Shahidi e Naczk (2004b) também relatam que as antocianinas são pigmentos solúveis Figura 2. 8 Estrutura química das antocianinas Fonte: Bobbio e Bobbio (1995) 2.5 Estabilidade das antocianinas A utilização de antocianinas na indústria de alimentos é bastante restrita devido à sua baixa estabilidade. Segundo Schmitz (2014) a instabilidade das antocianinas está associada a composição inicial do fruto como enzimas, íons metálicos, ácido ascórbico, dióxido sulfúrico, açúcares e copigmentos. Sendo os principais fatores da estabilidade das antocianinas são as influências como a copigmentação, temperatura, luz e ph. A interação entre estes fatores também pode afetar a estabilidade (FAVARO, 2008) Copigmentação Segundo Stringheta e Bobbio (2000), nos vegetais o ph se encontra na faixa ligeiramente ácida para neutra e por isso seria impossível que as antocianinas estejam coloridas se considerarmos que a coloração das antocianinas são apenas em função do ph. A presença de compostos chamados copigmentos pode ser um dos fatores que determinem a estabilidade de antocianinas em ph neutro. 15

29 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Stringheta e Bobbio (2000), também relata que os flavonóides não antociânicos, alcalóides, aminoácidos e nucleosídeos, entre outros, podem atuar como copigmentos e a própria antocianina pode agir copigmentando outra antocianina ph O ph tem grande influência na estabilidade das antocianinas. Segundo Falcão (2006) a estrutura das antocianinas em meio ácido são determinadas por uma substituição no anel B da aglicona. Assim, com o aumento do grau de metoxilação, a cor vermelha é intensificada. Já um maior grau de hidroxilação a intensidade da cor azul é aumentada. Lopes et al. (2007)b relatam que as antocianinas em solução aquosa são encontradas com diferentes estruturas químicas e em equilíbrio. Estas estruturas estão na forma de cátion flavilio, de cor avermelhada, base anidra quinoidal possuem cor azul, pseudo-base carbitol sendo incolor, e a chalcona que varia do incolor a levemente amarelado (XAVIER, 2004). Segundo Março e Poppi (2008), a característica importante das antocianinas é o fato de, em soluções aquosas, estas apresentam diferentes estruturas em função do ph. A Figura 2.9 apresenta as diferentes estruturas químicas das antocianinas em função da mudança do ph. Em um ph abaixo de 2 (ácido) as antocianinas estão na forma do cátion flavílico (AH+), mas com o aumento do ph ocorre uma desprotonação formando uma estrutura chamada de pseudobase carbinol (B) (XAVIER, 20040; MARÇO e POPPI, 2008). Março e Poppi (2008) relatam que, com o aumento do ph, as antocianinas perdem a cor até se tornarem incolores em ph aproximadamente igual a 6, devido o pseudobase carbinol (B) ser predominante. Março e Poppi (2008) também afirmam que em um ph acima de 6,0, as duas estruturas: pseudobase carbinol(b) e anidrobase quinoidal (A) podem formar a espécie cis-chalcona (C C ) e que quando se aumenta, de forma brusca, o valor do ph a Anidrobase Quinoidal(A) tende a formar a Anidrobase Quinoidal Ionizada(A - ). Segundo Heredia et al. (1998) com o aumento da temperatura o equilíbrio se desloca na direção da formação da base chalcona. As antocianinas são solúveis em água e a acidez influi na cor, por causar mudanças na estrutura química (AUGUSTA, 2011) como pode ser observado na Figura

30 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Figura Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do ph. Fonte: Março e Poppi (2008) A cor das antocianinas é diretamente influenciada pela substituição dos grupos hidroxila e metoxila na molécula (XAVIER, 2004). Segundo Bridle e Timberlake (1997) quando um ou mais grupos acilas estão presentes na molécula da antocianina, estes tendem a dificultar a hidrólise do cátion flavilium, de coloração vermelha, formando a base carbinol, sendo incolor, permitindo a formação da base quinoidal que possui coloração azul. Segundo Xavier (2004), o aumento de grupos hidroxilas na molécula tendem a tornar a coloração azul e aumentos do número de grupos metoxilas aumentam a intensidade do vermelho. 17

31 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Temperatura A temperatura é um fator importante na degradação destes pigmentos. Brouillard e Dubois (1977) relataram que o aumento da temperatura favorece à formar a chalcona, que e incolor, a partir do carbinol. A estabilidade das antocianinas frente à temperatura é influenciada pelo grau de acilação (LOPES et al., 2007). Um estudo feito por Falcão (2006) em um sistema modelo de geleia de uvas, mostrou que no processamento a 45ºC não houve diferença significativa na concentração de antocianinas depois do processo. Malacrida e Motta (2006) relatam que existem evidências que a principal causa da perda de cor seja a hidrólise glicosídica das antocianinas, pois a velocidade da liberação do açúcar é proporcional à velocidade da perda da cor vermelha Luz A luz é um dos principais fatores de degradação das antocianinas. Segundo Malacrida et al. (2006) as antocianinas são instáveis à luz visível e ultravioleta, ou até mesmo fontes de radiação ionizante. Extratos de antocianinas são mais estáveis sob proteção da luz quando comparados àqueles que permaneceram expostos à luz. A radiação UV interage no extrato de maneira a facilitar reações como, por exemplo, copigmentação com outros compostos presentes alterando a estabilidade das antocianinas, além de favorecer a formação de produtos de degradação oxidativa das antocianinas que possuem coloração marrom (FAVARO, 2008). Segundo Nachtigallo et al. (2010) em um estudo do impacto da luz na estabilidade das antocianinas constataram que o efeito da luz foi bastante destrutivo para a cor das antocianinas, principalmente em ph 4, Ação antioxidante Os compostos fenólicos encontrados em plantas possuem vários efeitos biológicos, entre elas a atividade antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Os ácidos fenólicos são compostos fenólicos primários responsáveis pela ação antioxidante. Bernardes (2014) relata que alguns fitoquímicos, tais como flavonoides, ácidos fenólicos, alcalóides, esteróides e 18

32 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica saponinas foram descritos na literatura com potencial antioxidante, ou seja, com capacidade de sequestrar ou neutralizar espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio. Segundo Sucupira et al. (2012), os compostos fenólicos são poderosos antioxidantes, pois atuam combatendo os radicais livres através da doação de um átomo de hidrogênio de um grupo hidroxila (OH), isto porque através da sua estrutura aromática possui a capacidade de suportar um elétron desemparelhado através do deslocamento deste ao redor de todo o sistema de elétrons da molécula e assim interrompendo a reação de propagação dos radicais livres. Frankel (1980) apresentou o mecanismo da ação antioxidante (Equação 2.1). ROO + AH ROOH + A (2.1) Sendo: ROO radical livre; AH antioxidante com um átomo de hidrogênio ativo; A. radical inerte. O átomo de hidrogênio ativo presente no antioxidante é afastado pelo radical livre (ROO ) formando uma espécie inativa (ROOH) e um radical inerte (A ) procedente do antioxidante, logo estabilizado por ressonância, não tendo a capacidade de iniciar reações de oxidação. Segundo Frankel (1980) o processo de inibição dos compostos fenólicos está na facilidade de doar um átomo de hidrogênio Extração sólido-líquido por imersão A extração tem como objetivo retirar dos materiais orgânicos ou inorgânicos as substâncias de interesse. Para cada substância a ser extraída há um tipo de extração, pois o caráter das substância pode variar. O método de extração vai depender da proposta de aplicação, para uma aplicação industrial, será considerado um método simples, rápido, custo baixo e que utilize solventes extratores de baixa toxicidade (FAVARO, 2008). Existem diversas técnicas de extrações que têm sido desenvolvidas para melhorar o isolamento e produção de compostos bioativos de origem vegetal. Os métodos mais utilizados são as extrações sólido-líquido que podem ser realizadas por percolação ou imersão. 19

33 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica A extração sólido-líquido é utilizada para se obter determinados compostos de materiais diferentes, tais como sedimentos, solos, polímeros, bactérias, fungos, algas e de microalgas, e mais comumente de plantas. (HATTAB et al., 2007). Nessa extração os componentes de uma fase sólida podem ser separados a partir de um dissolução da parte solúvel do sólido por meio de um solvente apropriado. A extração sólido-líquido por imersão normalmente é utilizada para separar compostos bioativos de produtos vegetais. A extração desses compostos é influenciada pela natureza química, o método de extração utilizado, o tamanho da partícula, o tempo e as condições de armazenamento, assim como a presença de substâncias interferentes (AZEVEDO, 2010). A identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais, como frutas, é necessária a realização da extração com solventes orgânicos (ANDREO et al., 2006). Os grãos do material orgânico quando colocados em contato com o solvente ocorre uma troca contínua entre o composto a ser extraído. Neste processo é necessário uma agitação para garantir que o solvente localmente saturado seja substituído pelo solvente (OETTERER, REGITANO D ARCE, SPOTO, 2006). O rendimento da extração pode ser influenciado por fatores como: o tamanho da partícula, o solvente, temperatura e a agitação. Na extração de substâncias antioxidantes com solventes orgânicos pode ser eficiente para alguns casos e exige controle de alguns fatores como, a polaridade do solvente, o tempo e a temperatura de extração, pois podem ocorrer perda ou destruição dos compostos antioxidantes (ANDREO, 2006). As antocianinas são compostos bastantes solúveis em água e podem ser facilmente extraídas com solventes polares (CARDOSO, 2011). Segundo Hattab et al. (2007), o processo para extração de compostos antioxidantes é normalmente realizado a partir da matéria-prima com diferentes solventes, com o objetivo de otimizar a extração dos compostos de interesse. Alguns dos solventes bastante utilizados nos processos de extração são o hexano, éter, clorofórmio, acetonitrilo, benzeno, acetona, metanol, e etanol e são comumente usado em diferentes proporções com água Solvente Os compostos fenólicos podem ser extraídos de vegetais e plantas. Existem diversos métodos para a extração destes compostos em frutas e vegetais utilizando solventes orgânicos. Os solventes mais utilizados para estas extrações são água, etanol, metanol e acetona. O 20

34 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica metanol é pouco utilizado pela indústria de alimentos por ser impróprio para o consumo, já que é um solvente bastante toxico. Não existe um sistema perfeito de extração para o isolamento de todos os compostos bioativos, Andreo (2006) relata que há uma grande diversidade de compostos que podem fazer interações formando complexos entre eles. As antocianinas são compostos bastante solúveis em água e podem ser facilmente extraídas com solventes polares (CARDOSO, 2011). O etanol é bastante utilizado como solvente, já que não é toxico. Lopes et al. (2007) relata que o recomendado é usar ácidos fracos para as extrações, como o ácido cítrico. O ácido clorídrico diluído é o mais efetivo, contudo é corrosivo e prejudicial para a saúde humana por isso não pode ser empregado para fins alimentícios. É comum a utilização de solventes acidificados, pois auxilia a penetração do solvente nos materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a extração (FAVARO, 2008). Segundo Favaro, (2008) é necessário o cuidado na adição dos ácidos nos solventes para a extração de antocianinas, pois o excesso de ácido pode levar à formação de antocianidinas e outros flavonóides por hidrólise, então gerar resultados superestimados da quantidade total de antocianinas presentes no material extraído. A extração de substâncias antioxidantes com solventes orgânicos pode ser eficiente para alguns casos e exige controle de alguns fatores como, a polaridade do solvente, o tempo e a temperatura de extração, pois podem ocorrer perda ou destruição dos compostos antioxidantes (ANDREO, 2006). Na Tabela 2.4 são apresentados alguns estudos, em que utilizam diferentes solventes e as condições de operação das extrações realizadas, seguidos dos compostos obtidos a partir dessas condições. É necessária a realização da extração com solventes de diferentes polaridades para a identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais. 21

35 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Tabela Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de operação para a recuperação de compostos bioativos naturais. Fonte: Gil-Ch avez et al. (2013) Solvente e condições de operação Etanol acidificado, ácido tartárico e ácido málico, 1,25% v/v, 40 ºC, min Decano e decano 190 mm CH 2 Cl 2 Etanol 68%, 55 ºC, sólido-líquido de 32,7 ml / g Acetona: água 50% v/v, 2 horas, 60ºC Etanol, acetato de etilo e acetona, 20-60ºC, 2 h Metanol, etanol, acetona, água acidificada, ou misturas (1:1, v/v). 1 ou 120 min, ph 3 ou 8, 22 ou 55ºC Acetona a 50%, de solventes para-sólido proporção de 20 ml/g, 35-36ºC e min Material Casca de berinjela Microalga: Dunaliella salina Cascas Pajang Mangifera Refosk bagaço de uvas. Sabugueiro (EB) e 3 variedades de bagaço de uva vermelha (RGM): Refosk, Merlot, e Cabernet Cascas de banana a partir de 2 cultivares (Grande Naine e Gruesa) Subproduto Parkia speciosa vagem de agroresíduos Composto de interesse Antocianinas Rendimento da extração 65,79 76,44 mg/100 g de casca Referencia Todaro et al., 2009 β-caroteno 345±5 μg/ml Mojaat et al., 2008 fenólicos Fenólicos e antocianinas Fenólicos e antocianinas Fenóis totais e antocianinas Fenólicos totais e flavonóides mg GAE/100 g: miligramas de acido gálico equivalentes a 100 g de extrato. mg CE/100 g: milligramas de catechin equivalentes a 100 g de extrato. PLE, Extração liquido pressurizado; SE, solvente extração. 12,9 mg GAE/g 16,7 mg GAE / g e 0,74 mg / g de material seco EB: 60,6 mg GAE / g RGM: 17,3-20,2 mg GAE/g de material seco EB: 0,5-1,2 mg/g RGM: 10,5 mg/g de material seco para antocianinas 3,1-3,8 GAE/100 g e 434 ug c-3-ge/100 g de material seco 668 mg GAE / 100 g e 49,6 mg pirocatecol E / 100 g Nagendra et al., 2011 Vatai et al., 2008 Vatai et al., 2009 (Gonz alez- Montelongo et al., 2010) (Gan e Latiff, 2010) 22

36 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Metodologia da superfície de resposta O planejamento fatorial, associados à análise de superfície de resposta, é uma ferramenta estatística, que fornece informações seguras sobre o processo (Lopez, Jiménez, Vargas, 2007). A metodologia de superfície de resposta baseia-se na construção de modelos matemáticos empíricos que geralmente empregam funções polinomiais lineares ou quadráticas para descrever o sistema estudado (SANTO et al., 2008). Usa-se a análise de superfície de resposta quando as variáveis de resposta são influenciadas por muitas variáveis independentes. A superfície de resposta pode ser representada pelo modelo matemático apresentado na Equação (2.2). y = β o + β 1 x 1 + β 2 x 2 + β 3 x 3 + β 4 x 4 + β 12 x 12 + β 13 x 13 + β 14 x 14 + β 23 x 23 + β 24 x 24 +β 34 x 34 (2.2) Em que: y é o valor experimental do composto a ser estudado; β i são os parâmetros do modelo em função dos fatores x i são os fatores Análise da variância O modelo matemático obtido pode não ser exatamente aquele que descreve a região estudada do sistema, assim não pode ser usado para fazer estimativas para deslocamento e muito menos para extrair conclusões (TEÓFILO e FERREIRA, 2006). Logo, é necessário avaliar a qualidade do ajuste deste modelo. Esta avaliação é determinada com o emprego da análise de variância (ANOVA). O exame dos resíduos é fundamental, para a avaliação a qualidade do ajuste de qualquer modelo (BARROS NETO et al., 2010). Sendo que o valor dos resíduos deve ser pequenos. Para se avaliar a qualidade do ajuste é necessário calcular os valores de F calc através dos valores obtidos a partir da tabela ANOVA e assim comprovar se o modelo é adequado (Tabela 2.5). 23

37 Capítulo 2 Revisão Bibliográfica Tabela Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela ANOVA. Fonte: Azevedo (2010) Soma Média Fonte de Variação Quadrática Quadrática Fcal Regressão SQ R MQ R MQ R Resíduo SQ r MQ r MQ r Falta de Ajuste SQ f.aj. MQ f.aj. Erro puro SQ ep MQ ep Total % da variação explicada % máxima da variação explicável SQ Total SQ R SQ Total SQ Total SQ ep SQ Total MQ f.aj. MQ ep Para o modelo ser satisfatório é necessário realizar a análise dos valores de F tab, onde se MQ R MQ r > T tab o modelo linear é satisfatório sendo então significativo. Se MQ R MQ r < T tab o modelo é preditivo. Sendo o modelo significativo e preditivo o R 2 também será satisfatório. O valor máximo de R 2 é igual 1. Isto só ocorre se não houver resíduo nenhum e toda a variação em torno da média for explicada pela regressão (BARROS NETO et al., 2010). Portanto quanto mais próximo de 1 for o valor de R 2, melhor terá sido o ajuste do modelo em relação às variáveis respostas. O R 2 (coeficiente de determinação do modelo) fornece uma medida da proporção da variação explicada pela equação de regressão em relação à variação total das respostas (RODRIGUES et al., 2009). Ou seja, fornecer uma medida da qualidade do ajustamento da reta de regressão à nuvem de pontos. 24

38 CAPÍTULO 3 MATERIAIS E MÉTODOS

39 Capítulo 3 Materiais e Métodos 3 Materiais e Métodos Neste item o projeto será dividido em etapas. A primeira etapa irá tratar da otimização da extração dos compostos bioativos do fruto da castanhola, utilizando o planejamento experimental; a segunda será o estudo cinético do processo de extração e a última etapa será sobre os estudos na estabilidade do fruto da castanhola Matéria-prima Os frutos da castanhola in natura utilizados neste trabalho foram obtidos no Campus Universitário da UFRN, colhidos manualmente durante seu período de safra, nos meses de dezembro a março de 2013 e em novembro de Obtenção do corante por extração sólido-líquido As etapas desenvolvidas para extração do corante encontram-se descritas no fluxograma apresentado na Figura 3.1 e serão descritas a seguir. Castanhola Seleção do fruto Obtenção da Polpa Secagem e moagem Análise granulométrica Planejamento experimental Extração Análises Figura Fluxograma do processo de extração do corante 26

40 Capítulo 3 Materiais e Métodos Seleção do fruto e obtenção da polpa Os frutos de castanhola in natura depois de obtidos foram lavados em água corrente e então selecionados de acordo com a cor e o grau de maturidade. Em seguida foram descascados para a retirada da polpa. A casca e o caroço foram desprezados Secagem e moagem e análise granulométrica Os frutos de castanhola foram submetidos à secagem em uma estufa com ventilação (Marco, modelo MA033) a uma temperatura de 70ºC por 1 hora. Segundo Malacrida e Motta (2006), processos utilizando baixo tempo em altas temperaturas têm sido recomendados para melhor retenção dos pigmentos. Após a secagem, as amostras foram trituradas e então foi realizado a análise granulométrica do material. Esta foi feita em peneiras vibratórias (Bertel, série Tyler 12.11). Foram analisadas abertura, por polegada linear das peneiras de 10, 24, 32 e 48 mesh, com duração de 10 minutos e intensidade de vibração 4. O pó que estava retido nas peneiras foi utilizado para calcular o diâmetro médio das partículas através do cálculo do diâmetro de Sauter de acordo com a Equação (3.1). d ps = 1 x i d i (3.1) Depois o pó foi acondicionado em potes plásticos brancos e opacos, de forma que não recebessem luz, e foi refrigerado até o momento de ser utilizadas. O pó é apresentado na Figura

41 Capítulo 3 Materiais e Métodos Figura Pó da castanhola pronta para a extração Planejamento Experimental A extração foi realizada variando: temperatura, porcentagem do etanol, tempo e ph sendo aplicado o planejamento experimental de acordo com esses parâmetros. Para o solvente foi escolhido um sistema binário de água e etanol representado por porcentagem de etanol. O etanol foi o solvente escolhido para as extrações por não ser tóxico e o mais indicado para aplicação para fins alimentícios. O planejamento fatorial consiste, em selecionar um número fixo de níveis nos quais cada variável investigada varia em todas as combinações possíveis umas com as outras (LOPES et al., 2007a). Os resultados obtidos são aplicados ao planejamento fatorial, fornecendo os efeitos das variáveis em relação a variável resposta. Assim o uso do planejamento determina as variáveis mais importantes que influenciam no processo de extração. Os valores dos fatores foram escolhidos a partir de testes realizados anteriormente, para estabelecer as condições operacionais, para um melhor rendimento dos extratos. Um planejamento com maiores valores de água no solvente não obteve condições necessárias para a realização do planejamento, pois o modelo não era adequado para as condições de operação. O planejamento foi realizado a partir de dois níveis e 4 pontos centrais conforme é apresentado na Tabela

42 Capítulo 3 Materiais e Métodos Tabela Planejamento experimental 2 4 (4 fatores e 2 níveis) Níveis Fatores Temperatura (ºC) 25 37,5 50 Porcentagem do etanol 50 62,5 75 Tempo (min) ph 3,5 5,5 7,5 Ensaio Temperatura Etanol % Tempo ph Extração sólido-líquido por imersão Para a extração foram utilizados 8 g de pó para cada extração com 80 ml de solvente de acordo com os níveis (superior e inferior), que representam a porcentagem do solvente, para cada ensaio. O pó foi submetido à extração sólido-líquido em um reator por agitação mecânica acoplado onde foi realizado o controle dos parâmetros: temperatura, ph, porcentagem de etanol e tempo. Esta extração possui um mecanismo simples de baixo custo. A Figura 3.3 apresenta o os aparelhaem utilizada para a extração. O material a ser extraído é agitado em uma velocidade de 12 rpm, previamente estabelecida, em um reator enjaquetado (Sulglass). O 29

43 Capítulo 3 Materiais e Métodos reator é acoplado em um banho termostático (Tecnal, série TE 184) onde ocorre recirculação de água a uma temperatura constante. Figura Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático A extração sólido-líquido é uma operação unitária que basicamente se resume na separação de um ou mais componentes de uma mistura sólida através de um solvente líquido. Neste processo ocorrem as seguintes etapas: contato do solvente com o sólido, que lhe cede o componente solúvel; separação da solução do sólido remanescente por filtração para recuperação do soluto dissolvido no líquido extrator (FELLOWS, 2006) Análises do extrato Após a realização do experimento, as amostras foram retiradas e levadas às análises de compostos fenólicos totais, antocianinas monoméricas totais e atividade antioxidante Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT) O teor de compostos fenólicos totais foi determinado segundo a metodologia descrita por Cheplick et al., (2010). A metodologia consiste em colocar em um tubo de ensaio 1 ml do extrato, 1 ml de etanol 95%, 5 ml de água destilada e 0,5 ml do reagente Folin- Ciocalteau. A solução é homogeneizada e deixada em repouso durante 5 minutos. Após este tempo adiciona-se à solução 1 ml de Na 2 CO 3 5% e mantem-se em câmara escura por 60 30

44 Capítulo 3 Materiais e Métodos minutos. Após o tempo determinado, homogeneízam-se as amostras novamente e medem-se suas absorbâncias no comprimento de onda de 725 nm contra branco, constituído apenas de solução etanoica 95%. Estas medidas expressam os resultados de compostos fenólicos em miligramas equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100g de pó. Para isto utilizou-se uma curva de calibração (Figura 6.1), apresentada no Apêndice, construída a partir de diferentes concentrações de ácido gálico. Os reagentes necessários foram preparados da seguinte maneira: Para o reagente Folin-Ciocalteau mediu-se 25 ml do reagente que foi dissolvido com 25 ml de água destilada. Foi preparado apenas o necessário para os experimentos semanais para não ultrapassar a sua validade. O reagente foi conservado sob refrigeração e em ausência de luz. A solução de Carbonato de sódio 5% foi preparada pesando 5g de Na 2 CO 3 e diluído em água destilada, completando o volume em um balão de 100 ml Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH O método mais utilizado para se determinou-se a atividade antioxidante é apresentado por Brand-Williams et al. (1995) e consiste em avaliar a atividade sequestradora do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) por antioxidantes. Por ação de um antioxidante (AH) ou uma espécie de radical (R-), o DPPH é reduzido, formando o difenil-picril-hidrazina. Isto ocasiona o desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo decréscimo da absorbância a 515 nm. Rezende (2010) relata que o método DPPH possui vantagens como: poder avaliar grande quantidade de amostras em um curto período de tempo; o método é sensível e detecta pequenas concentrações do ativo contido na amostra; permite avaliar antioxidantes lipofílicos, isto porque o solvente do processo é metanol ou etanol. A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante (sequestradora de radicais livres) ou a porcentagem de DPPH remanescente no meio reacional. A porcentagem de atividade antioxidante corresponde à quantidade de DDPH consumida pelo antioxidante. A quantidade de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE 50 ), também chamada de concentração inibitória (CI 50 ). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua CE 50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007). 31

45 Capítulo 3 Materiais e Métodos Preparou-se uma solução metanólica de 0,004 g de DPPH em 100 ml de álcool metílico, sendo homogeneizado e transferido para um frasco de vidro âmbar, devidamente etiquetado. O decaimento da absorbância das amostras (A amostra ) correlacionado ao decaimento da absorbância do controle (A controle ), resultando na porcentagem de sequestro de radicais livres (%SRL), que pode ser expresso através da Equação (3.2): % SRL = A controle A amostra A controle 100 (3.2) A curva de calibração foi estabelecida conforme o procedimento a seguir. Após realizar a extração do corante, uma amostra de 0,3 ml era retirada e adicionada a 1,7 ml do reagente em um frasco de eppendorf. Para o controle o procedimento foi repetido trocando o extrato por metanol. Para o branco foram adicionados em um eppendorf 2 ml de metanol. Aguardando-se 30 min em uma câmara escura. Foram realizadas leituras das absorbâncias em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm. Uma curva de calibração (Figura 6.2), apresentada no Apêndice, foi construída a partir de diferentes valores da concentração do extrato. Os resultados para a atividade antioxidante foram expressos em grama de concentração inibitória (IC 50 ) Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT) O método diferencial baseia-se nas mudanças de absorbância resultantes da variação do ph das soluções e no fato das características espectrais dos produtos de degradação não serem alteradas por mudanças no ph (MALACRIDA e MOTTA, 2006). O conteúdo de antocianinas monoméricas e poliméricas foi determinado pelo método do ph diferencial descrito por Giusti e Wrolstad (2001). As antocianinas, em ph baixo, encontram-se predominantemente na forma de cátion flavílico, apresentando coloração vermelha em solução aquosa. Em ph alto, esse cátion é convertido em outras espécies incolores. Cada extrato foi diluído, tanto em tampão cloreto ph = 1,0 quanto em tampão acetato ph = 4,5, de acordo com o valor do fator de diluição (FD) previamente calculado (FD = 10, ou seja, 2 ml de amostra / 0,2 ml extrato). Sendo assim, será adicionado 1,8 ml de cada tampão em 0,2 ml de extrato, homogeneizados em agitador e deixados a temperatura ambiente e na ausência de luz por 30 minutos. Ao término desse período, a absorbância foi 32

46 Capítulo 3 Materiais e Métodos medida no comprimento de onda do visível, em 510 nm e 700 nm de acordo com o método de Giusti e Wrolstad (2001). O comprimento a 510 nm é a máxima absorbância para a identificação das antocianinas e a 700 nm é usado para corrigir o espalhamento de luz produzido por uma possível turbidez da amostra (AZEVEDO, 2010). Foi utilizado o mesmo procedimento para o preparo do branco, sendo substituído o extrato por 0,2 ml de H 2 O destilada. Todas as medidas foram realizadas em triplicatas para cada amostra. Em seguida determinou-se a absorbância resultante (A) pela Equação (3.3), partindose das leituras das soluções obtidas. A = (A 510 A 700 )ph 1,0 (A 510 A 700 )ph 4,5 (3.3) Equação (3.4). O calculo da concentração das antocianinas nos extratos foi realizado de acordo com a C = (A FD MM 1000) (ε b) (3.4) em que: C é a concentração de antocianinas (mg / L); A é a absorbância; FD é o fator de diluição utilizado; MM é a massa molar do padrão (g / mol); ɛ é o coeficiente de absortividade molar do padrão (L / cm.mol); b é o caminho óptico ( a espessura da cubeta utilizada para leitura no espectrofotômetro) (cm). Para o procedimento foram preparados o tampão KCl (ph 1,0) pela pesagem de 1,86 g de KCl e diluição em 980 ml de água destilada. Foi ajustado o ph desejado da solução com HCl (37%), em seguida a solução foi transferida para um balão de 1 L que teve seu volume completado com água destilada. Também foi preparada a solução tampão CH 3 COONa (ph 4,5) pesando-se 54,43 g de CH 3 COONa, e que foram diluídos em 960 ml de água destilada. Ajustado o ph desejado da solução com HCl (37%), a solução foi transferida para um balão de 1 L e completado o seu volume com água destilada. 33

47 Capítulo 3 Materiais e Métodos 3.3 Estudo cinético do processo de extração Para o estudo cinético foram realizados ensaios em que se acompanhou a concentração ao longo do tempo. Os ensaios foram realizados utilizando 8 g de pó de castanhola com 80 ml do solvente. A proporção de água e etanol foi obtida a partir dos resultado do planejamento realizado anteriormente para cada composto analizado. O estudo foi realizado com extrações em batelada a cada 20 minutos, avaliando os teores dos compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante. As condições de extração foram realizadas a partir das condições ótimas obtidas no planejamento fatorial 2 4 dos melhores valores obtidos nas extrações de compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante. Os ensaios realizados foram então analisados em espectrofotômetro, seguindo as metodologias citadas no item Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos Foram feitos estudos de estabilidade no extrato do fruto de castanhola em relação a temperatura (25 C e 60 C), concentração do extrato (30% e 50%) e ph (3 e 6). As amostras foram diluídas com concentrações diferentes de extrato em duas soluções tampão. Para o ph igual a 3 foi utilizado a solução tampão de KCl e para o ph igual a 6 foi utilizado uma solução tampão de KH 2 PO 4. O extrato foi obtido a partir de uma extração sólido-liquido por imersão, utilizando 30 g de pó de castanhola com 300 ml de solvente. As condições de operação (%Etanol, temperatura, ph e tempo) foram obtidas a partir dos dados do planejamento experimental. As concentrações de extratos foram realizadas de acordo com Chigurupati et al. (2002) da seguinte maneira: utilizou-se um volume total de 100 ml para cada amostra. Para as amostras com concentrações de 30% foram adicionados em dois elermeyers 30 ml de extrato e 70 ml de cada solução tampão. Para a concentração de 50% foram adicionados 50 ml de extrato e 50 ml da solução tampão. Para cada concentração foram alternados os tampões de ph 3 e 6. Foram preparadas um total de 8 amostras. Metade das amostras (Figura 3.6) foram mantidas em um shaker com velocidade de agitação de 80 rpm a 25 C em um período de 5 dias. A outra metade foi colocada em outro shaker com temperatura de 60 C com agitação de 80 rpm por 5 dias. 34

48 Capítulo 3 Materiais e Métodos Figura 3. 4 Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de KH 2 PO 4 (ph = 6) e KCl(pH = 3). No estudo da estabilidade foram feitas análises para a queda do teor de antocianinas monoméricas em 5 dias. Método espectrofotométrico foi utilizado para determinar o teor de antocianinas monoméricas. O resultado foi expresso pela porcentagem da queda do teor de antocianinas monoméricas totais presentes ao final do estudo. O calculo da queda do teor de antocianinas é realizado pela equação (3.5). %C f = C f 100 C i (3.5) Em que: %C f - Porcentagem da concentração final de antocianinas monoméricas totais. C f - Concentração final de antocianinas monoméricas totais. C i - Concentração inicial de antocianinas monoméricas totais. 35

49 CAPÍTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

50 Capítulo 4 Resultados e discussões 4 - Resultados e discussões No presente capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos conforme a metodologia descrição do capítulo anterior. 4.1 Análise granulométrica do pó da polpa de castanhola A partir do pó adquirida foi realizada a análise granulométrica. Na Tabela 4.1 é apresentada a massa das partículas retidas e a respectiva fração mássica (x i ) do material retido em cada peneira. Foram utilizadas 3 peneiras onde o fundo é a sobra do material que conseguiu passar por todas as peneiras. As aberturas das peneiras são apresentadas em milímetros e o diâmetro médio de cada partícula (di) em milímetros. Tabela Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (x i ) da massa retida em cada peneira. Diâmetro das d i (mm) peneiras (mm) 0,7 0,7 0,383 0,5 0,6 0,219 0,3 0,4 0,239 Fundo 0,15 0,159 x i O valor do diâmetro médio de Sauter foi calculado de acordo com a Equação (3.1) no Item A partir dos valores obtidos na Tabela 4.1, o diâmetro de Sauter obtido foi de 0,389 mm. 37

51 Capítulo 4 Resultados e discussões Extração do corante e avaliação do planejamento As extrações foram realizadas de acordo com o planejamento fatorial 2 4 conforme os itens e Os extratos retirados do reator e filtrados eram submetidos às análises de compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante. Os resultados experimentais decorrentes do processo de extração do corante do fruto de castanhola conforme o planejamento previamente mostrado na Tabela 3.1, estão apresentados na Tabela 4.2. O melhor resultado obtido com a amostra em base seca foi: 30307,53 mg GAE/100g da amostra para o teor de compostos fenólicos totais (CFT) quando utilizaram-se 50 C, 30 minutos, 50% de Etanol e ph igual a 3,5. Para a para a atividade antioxidante (AA) obteve-se 0,17 de IC 50 (g/ml) da amostra em 50 C, 75% de etanol, 10 minutos e ph igual a 3,5. Para a concentração de antocianinas monoméricas totais (AMT) verificou-se 376,33 mg ci-3-gli/100 g para 50 C, 30 minutos, 75% de etanol e ph igual a 3,5. O melhor resultado para a atividade antioxidante foi o menor valor obtido, já que este valor representa a concentração do extrato que inibe o radical livre (DPPH). Os resultados para CFT, AA e AMT foram bastante superiores quando comparados a resultados obtidos por outros autores para o estudo da castanhola, como Marques et al. (2012), que obtiveram 244,33 mg de GAE/100g de compostos fenólicos e Lima (2012) com 142,84 mg de GAE/g no processo de extração da polpa da castanhola. Esta diferença pode ter ocorrido devido o fruto ter sido produzido em condições climáticas, grau de maturação, condições de estocagem ou condições do processo para a extração do corante não semelhante. 38

52 Capítulo 4 Resultados e discussões Tabela Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e antocianinas da polpa do fruto de castanhola T (⁰C) Etanol % t (min) ph AA IC 50 (g/ml) CFT mg GAE/100g AMT mg ci-3-gli/100 g ,5 1, ,62 92, ,5 1, ,67 76, ,5 1, ,27 88, ,5 1, ,33 80, ,5 1, ,36 86, ,5 1, ,6 78, ,5 1, ,84 53, ,5 1, ,25 75, ,5 0, ,8 376, ,5 1, ,5 218, ,5 0, ,5 203, ,5 1, ,1 163, ,5 0, ,5 177, ,5 1, ,1 151, ,5 1, ,3 209, ,5 0, ,2 213, ,5 62,5 20 5,5 1, ,2 161, ,5 62,5 20 5,5 1, ,4 119, ,5 62,5 20 5,5 1, ,2 161, ,5 62,5 20 5,5 1, ,4 169,9077 A partir dos valores reais obtidos na extração foram calculadas as estimativas dos efeitos, que correspondem aos parâmetros β (Tabela 4.3) dos modelos matemáticos de regressão. A Tabela 4.3 apresenta também os parâmetros estatisticamente significantes (p 0,05), sendo que os efeitos em negrito dizem respeito aos valores dos efeitos dos fatores e a interação entre eles que apresentaram significância estatística. 39

53 Capítulo 4 Resultados e discussões Tabela Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT Efeitos Fator AA CFT AMT β o 37, ,4 142,020 β 1 10, ,1 12,272 β 2-0, ,1 0,296 β 3-4, ,2 47,097 β 4-21, ,2-156,611 β 12-6, ,8-1,618 β 13 4, ,2 45,761 β 14-11, ,6-47,769 β 23 2, ,8-57,489 β 24 14, ,5 33,888 β 34 5, ,9 0,950 β 123 7, ,7-29,999 β 124 7, ,4 35,426 β 134-1, ,9 4,463 β 234-0, ,0 23,027 As Equações (4.1), (4.2) e (4.3) representam os modelos obtidos no estudo dos compostos AA, CFT e AMT respectivamente. y AA = 37, ,91x 1 21,55x 4 11,73x ,19x 24 (4.1) y CFT = 14062, ,2x ,6x 14 (4.2) y AMT = 142, ,097x 3 156,61x ,76x 13 47,76x 14 57,49x 23 (4.3) Os valores dos coeficientes de correlação (R 2 ) de cada modelo matemático gerado foram 94,68%, 97,03% e 98,26% (Figuras 4.1, 4.2, 4.3) para a atividade antioxidante, compostos fenólicos totais e antocianinas monoméricas totais, respectivamente. 40

54 Capítulo 4 Resultados e discussões Os gráficos nas Figuras 4.1, 4.2 e 4.3 apresentam os valores preditivos, que são adquiridos a partir do modelo matemático gerado, versus os valores observados ou valores experimentais. Os valores de R 2 são adquiridos a partir destes gráficos. Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade antioxidante Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos Fenólicos Totais 41

55 Capítulo 4 Resultados e discussões Figura Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas Monomérica Totais Os valores de R 2 representam a quantidade de variabilidade nos dados que é explicada pelo modelo de regressão ajustado, ou seja a média da qualidade do ajuste. Entretanto, não demonstra a significância do modelo realizado. Para isso usa-se a análise da variância. A partir da ANOVA podem ser obtidos os valores de F cal e F tab (Tabela 4.4). Tabela Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT Fcal Ftab AA CFT AMT AA CFT AMT MQ R MQ r 6,40 17,96 13,37 4,62 5,66 5,86 MQ faj MQ ep 0,75 2,07 1,76 9, A partir da Tabela 4.4 foram obtidos os valores de Fcal/Ftab para os testes F de significância (Tabela 4.5). 42

56 Capítulo 4 Resultados e discussões Tabela Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT Fcal/Ftab AA CFT AMT MQ R MQ r 1,38 3,17 2,28 MQ faj MQ ep 0,07 0,10 0,09 A partir da Tabela 4.4 pode-se observar que para todas as variáveis (AA, CFT e AMT) o Fcal > Ftab para MQ R MQ r, sendo Fcal muito maior que o Ftab, levando a valores de Fcal/Ftab (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, portanto o modelo é significativo. Tem-se então evidência estatística suficiente para se acreditar na existência de uma relação linear entre as variáveis resposta (AA, CFT e AMT) e as variáveis independentes (Temperatura, proporção do solvente, tempo e ph). Além do modelo ser significativo deve ser observado se o modelo também é preditivo para a falta de ajuste. Foi observado que os valores para MQ f.aj MQ ep (0,07, 0,10, 0,09) estão abaixo de MQ R MQ r (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, então o modelo é preditivo. Isto reforça ainda mais a significância do modelo, o que também pode ser confirmado pelos valores de Fcal serem muito menores que Ftab na Tabela 4.4 para a falta de ajuste e o erro. Portanto todos os modelos são significativos e preditivos para o intervalo de confiança de 95%. Nenhum dos modelos demonstraram a necessidade de modificação dos níveis dos parâmetros de controle Análise da superfície de resposta Atividade antioxidante O Diagrama de Pareto (Figura 4.4) demostram os valores para os efeitos das variáveis sobre a resposta para 95% de confiança, sendo o ph o fator mais significativo na extração. Observa-se também que a interação da proporção do solvente com o ph (2by4), a interação da temperatura com o ph (1by4) e o efeito isolado da temperatura foram também significativos. 43

57 Capítulo 4 Resultados e discussões Figura Diagrama de Pareto para AA O ph influenciou bastante o processo de extração. O valor negativo do t calc observado no Diagrama de Pareto demonstra que a extração alcançou valores maiores no nível inferior, ou seja em ph igual a 3,5. Entretanto aumentando o ph, a atividade antioxidante diminuiu. Isto se deve ao fato de que com o aumento do ph menos compostos bioativos, responsáveis pela atividade antioxidante, são extraídos, ocasionando uma queda na extração de compostos antioxidantes. A temperatura também apresentou uma influência na extração, contudo a partir do valor t calc observado na Figura 4.4, demonstra que em temperaturas mais altas, na faixa de 25 C a 50 C, pode ser extraído mais composto antioxidante. A interação da porcentagem de etanol com o ph (Figura 4.5) também influenciou na extração, sendo que quando esses dois fatores interagiram ocasionou numa melhor extração, ou seja, contribuiu favoravelmente para a extração dos compostos antioxidantes, usando-se quantidades maiores de etanol e em baixo ph na faixa de 3,5 a 7,5. Constata-se que em boa parte da faixa da porcentagem do etanol, de 75% até 66% de etanol, e ph entre 3 e 4, o rendimento foi favorável para a extração. 44

58 Capítulo 4 Resultados e discussões Figura Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o ph (2by4) para a extração da atividade antioxidante No presente estudo o efeito isolado da porcentagem de etanol utilizada no solvente não foi significativo, entretanto observou-se que, tanto na interação de proporção do solvente com o ph como no ponto de melhor rendimento da extração, obteve um melhor resultado quando se utilizaram quantidades maiores de etanol. Sun et al. (2007) afirmaram em seus estudos, envolvendo cinco solventes (água, metanol, etanol, éter dietílico e acetona) na extração da atividade antioxidante utilizando cascos Avellana gevuina, que os extratos de etanol e de metanol apresentaram um maior teor de atividade antioxidante, enquanto a extração apenas com água resultou em um menor teor de atividade antioxidante, determinada pelo método de DPPH. Segundo Azevedo (2010), em um estudo com o jambo, a temperatura e a proporção de solventes foram bastante significativas na extração da atividade antioxidante, sendo observado um melhor desempenho em toda a faixa de temperatura para maiores quantidades de etanol. Num estudo com brócolis e aspargos Sun et al. (2007) observaram que os extratos de metanol e acetona obtinham uma atividade antioxidante mais elevada do que os extratos de água, concluindo que os flavonoides são mais solúveis em metanol e acetona do que em água. Assim, concluíram que a utilização de água apenas, não é favorável à extração dos antioxidantes de espargos ou brócolis. A Figura 4.6 apresenta as curvas de níveis da interação da temperatura com o ph. Esta interação gerou em um baixo rendimento para a extração. Apenas uma pequena faixa de ph entre 3 e 4 com temperaturas mais altas, na faixa de 45 C a 50 C, apresentaram um bom rendimento na extração. 45

59 Capítulo 4 Resultados e discussões Segundo Sartori (2013), as condições de ph igual a 4, temperatura de 70 C e 40% de etanol foi a combinação entre os parâmetros que melhor possibilitou a extração de substâncias com propriedade antioxidante, quando utilizou-se a cana-de-açúcar como matéria-prima. Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o ph (1by4) para a extração da atividade antioxidante Oliveira et al. (2009) afirmaram que a obtenção de antioxidantes é influenciada pelo substrato utilizado no ensaio, pelo solvente e pela técnica de extração empregada, bem como o tempo e temperatura Compostos Fenólicos Totais Na análise do diagrama de Pareto (Figura 4.7), para a extração de compostos fenólicos totais, observou-se que o ph foi bastante significativo e também a interação da Temperatura e ph (1by4), sendo esta bem menos significativa. De acordo com a Figura 4.7 o valor de t calc negativo para o ph indica que o nível inferior referente ao ph favoreceu a extração, ou seja, quanto menor o valor do ph no solvente maior será a extração de compostos fenólicos. Assim, para a remoção desses compostos, uma solução mais ácida seria mais favorável, já que de acordo com a literatura os compostos fenólicos são extraídos de forma mais eficiente em ph ácido. Lopes et al. (2007)b afirma que a utilização de solvenes ácidos facilitam a extração de compostos fenólicos. É comum a utilização de solventes acidificados, pois auxiliam na penetração do solvente nos materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a extração (FAVARO, 2008). 46

60 Capítulo 4 Resultados e discussões Na interação da temperatura com o ph pode-se observar que a junção desses dois fatores na extração não favoreceu a extração, em que uma análise da curva de nível (Figura 4.8) permite avaliar o resultado sobre esta interação. Figura Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos Na Figura 4.8 é apresentada a curva de nível da interação entre a temperatura e o ph (1by4). Constatou-se que as condições ótimas para determinação dos compostos fenólicos totais estão com valores de temperatura maiores e um menor ph. Souza et al. (2013) em um estudo com extratos vegetais concluíram que todos os extratos etanólicos acidificados extraídos em alta temperatura apresentaram elevados teores de compostos fenólicos e concluiram que o aumento da temperatura promoveria um aumento da reatividade do etanol, facilitando o processo extrativo das fibras vegetais. 47

61 Capítulo 4 Resultados e discussões Figura Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o ph(1by4) para a extração de compostos fenólicos Os efeitos isolados da porcentagem de etanol, temperatura (ºC) e o tempo (min) não influenciaram na extração. Entretanto, a maior concentração dos compostos fenólicos foi obtida com 75 % de etanol, tempo de 30 min e a uma temperatura de 50 C, ou seja, uma maior proporção de etanol, maior temperatura e maior tempo apresentaram um melhor rendimento para a extração dos compostos fenólicos. Segundo Sartore et al. (2013), no processo de extração, o tipo de solvente, a temperatura e ph afetam a quantidade de compostos fenólicos extraída, mas não foram encontrados na literatura estudos que relacionam os três parâmetros citados. Haida et al. (2011) afirmaram em um estudo com folhas de goiaba vermelha, goiaba branca e arruda, que na extração com solvente etanólicos e aquosos houve extração de compostos fenólicos nas duas variedades de goiaba. Azevedo (2010) também analisou que as condições ótimas de extração para a determinação de compostos fenólicos do extrato de jambo estão na faixa de temperatura entre 50ºC a 60ºC com intervalos de tempo de 25 a 30 min. Os compostos fenólicos são os maiores responsáveis pela atividade antioxidante em frutos (HEIM et al., 2002). Segundo Kuskoski et al. (2006), a média dos valores de atividade antioxidante se correlaciona de forma positiva com a média dos valores de polifenóis e antocianinas. Os autores observaram uma resposta tanto entre o conteúdo total de polifenóis e a atividade antioxidante de 15 frutos e que isso indicaria que os compostos fenólicos são contribuintes na atividade antioxidante dos frutos analisados. Thoo et al. (2010) relataram que, embora a extração dos compostos fenólicos fosse melhorada utilizando um solvente composto por 100% de etanol no processo, esta condição 48

62 Capítulo 4 Resultados e discussões não contribuiu para elevar a quantidade da atividade antioxidante. Já Chirinos et al. (2007) inferiram que tal fato devido ao processo utilizar 100% de etanol, o que pode incapacitar a extração dos compostos fenólicos, por estes serem mais solúveis em água. Estudos anteriores mostraram que um sistema de solvente binário foi superior a um sistema de apenas um componente (água ou etanol puros) para a extração de compostos fenólicos no que diz respeito à sua polaridade relativa (Thoo et al., 2010). Thoo et al. (2010) afirmaram que em relação ao princípio do equilíbrio, a temperatura elevada poderia aumentar a taxa de extração e, portanto, reduzir o tempo de extração para alcançar a máxima recuperação de polifenóis. Entretanto, elevar a temperatura pode não ser adequado para a extração de todos os tipos de compostos fenólicos. O aumento da temperatura no presente estudo foi significativo para a faixa de temperatura estudada (25 C a 50 C), o que não garante que em outras faixas de temperatura os resultados se manteriam significativos Antocianinas monoméricas totais A Figura 4.9 mostra o Diagrama de Pareto relativo ao estudo das AMT, sendo o ph o fator mais significativo para a extração seguido pela interação da proporção do solvente com o tempo (2by3), pela a interação da temperatura com o ph e a interação da temperatura com o tempo. Figura Diagrama de Pareto para as antocianinas 49

63 Capítulo 4 Resultados e discussões O fator isolado ph (Figura 4.9) foi o mais significativo em relação aos outros. Isto pode ser afirmado observando o valor de t calc negativo, que indica que o rendimento da extração aumenta em valores de ph baixos no processo, tal como ocorreu na extração dos compostos fenólicos. Portanto, em ph mais baixo é possível extrair um teor maior de antocianinas. Xavier (2004), em um estudo com repolho roxo, concluiu que quanto menor o ph maior a quantidade de antocianinas extraídas e que a melhor condição de operação seria com um ph de 3,5. Favaro (2008) afirma que soluções muito ácidas na presença de agentes oxidantes favorecem a hidrólise ácida das antocianinas podendo afetar a estabilidade dos extratos e que soluções muito alcalinas levam à formação irreversível da cis-chalcona ionizada (solução amarelada). Segundo Kato et al. (2012), o fator determinante na extração de antocianinas de uvas do tipo Vitis vinífera L. foi a condição do ph, em que quanto mais baixo o ph, maior foi a concentração destes pigmentos. De acordo com a Figura 4.19, o segundo fator isolado significativo no processo foi o tempo. O tempo influenciou de forma positiva na extração, concluindo que quanto maior o tempo de extração, melhor será o rendimento do teor de antocianinas. No presente estudo o teor de antocianinas apresentou melhor rendimento em um tempo de 30 minutos de extração. Ainda na Figura 4.9 observa-se que as interações da porcentagem de etanol com o tempo (2by3) e a interação da temperatura com o ph (1by4) também foram significativas na extração. Pelas curvas de níveis (Figuras 4.10, 4.11 e 4.12) pode-se avaliar melhor as interações da temperatura com a porcentagem de etanol utilizada Figura Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3) para a extração de antocianinas 50

64 Capítulo 4 Resultados e discussões Na interação da porcentagem de etanol com o tempo (2by3) apresentado na Figura 4.10 pode-se observar que a interação entre eles ocasionou um bom rendimento para a extração de antocianinas, em que o valor de t calc é positivo. As antocianinas tiveram um melhor rendimento em um tempo maior com maiores quantidades de etanol. Também se observa que o rendimento foi maior na faixa de 28 a 32 minutos de extração e 66% a 76 % de etanol. Entretanto Thoo et al. (2010) não obtiveram bons resultados na extração de antocianinas com altas concentrações de etanol (80%). Os autores também constataram um menor rendimento de extração das antocianinas para concentrações de etanol abaixo de 40%. Na interação da temperatura com o tempo (1by3) (Figura 4.11), há um melhor rendimento na extração de antocianinas quando se empregam temperaturas e tempos de extração maiores. Os melhores rendimentos na extração de antocianinas foram observados com valores de temperatura na faixa de 42ºC a 52ºC com o tempo na faixa de 28 a 32 minutos de extração. Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a extração de antocianinas A interação da temperatura com o ph (1by4) (Figura 4.12) proporcionou um bom rendimento na extração de antocianinas. Observou-se que em temperaturas maiores e ph baixo ocorre um melhor rendimento na extração numa faixa de temperatura de 32ºC a 52 ºC e ph entre 3 e 4. 51

65 Capítulo 4 Resultados e discussões Figura Curvas de nível para a interação da temperatura com o ph (1by4) para a extração de antocianinas Apesar do efeito isolado temperatura não ter sido significativo no sistema de extração estudado, Sartore et al. (2013) afirmam, em seus estudos sobre extração de compostos fenólicos, que os teores de flavonóides totais foram maiores para temperaturas inferiores a 30 C. Contudo os autores afirmam que o aumento da temperatura promoveria um aumento da reatividade do etanol, o que facilitaria o processo de extração das fibras vegetais. Contudo no presente trabalho a extração de antocianinas foi mais alta em uma temperatura de 50ºC. 4.4 Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante No presente trabalho foram analisadas correlações entre os compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante a partir dos dados experimentais adquiridos no planejamento fatorial 2 4 avaliando a relação existente entre eles. Os valores e gráficos das correlações foram obtidos a partir do software Statistica 7.0. A intensidade da correlação pode ser descrita por Dancey e Reidy (2005), onde apontam uma classificação sendo: r = 0,10 até 0,30 (fraco); r = 0,40 até 0,6 (moderado); r = 0,70 até 1 (forte). Na (Figura 4.13) é apresentado a correlação dos compostos fenólicos com o teor de antocianinas com um valor de r igual a 0,79. Conclui-se que na extração de antocianinas e compostos fenólicos possui uma forte correlação entre eles. Esta forte correlação também foi 52