Lista de Figuras. xvi

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1 Lista de Figuras Figura 1. Objectos de estudo das principais ciências de base da micotoxicologia e interacções entre áreas de investigação... 5 Figura 2. Organização da dissertação por capítulos e secções de execução experimental, resultados e discussão Figura 1.1. Número de artigos publicados entre 1956 até finais de 2004 em períodos de 4 anos sobre as micotoxinas mais investigadas devolvidos pelo motor de busca Scirus: aflatoxinas, ocratoxinas, patulina e toxinas de Fusarium (deoxinivalenol, fumonisinas, zearalenona e toxina T-2) Figura 1.2. Quadro conceptual de análise de risco da FAO/OMS (1995) Figura 1.3. Diagrama representativo das fases de produção de alimentos até consumo humano Figura 1.4. As 3 componentes necessárias para haver produção de micotoxinas em alimentos: presença de estirpes toxigénicas, cultura susceptível e factores ambientais favoráveis à infecção do fungo e produção da micotoxina na cultura/alimento (M = micotoxinas) Figura 1.5. Distribuição e teor de aflatoxina em grãos de milho numa espiga (adaptado de Cotty et al., 1994). Células brancas = não infectadas, aflatoxina não detectada; Células amarelas = infectadas, aflatoxina não detectada; células cinzentas = concentações de aflatoxina de 0,1 2,5 g/kg; células negras = mais de 2,5 g/kg Figura 1.6. Fungos e actinomicetes proeminentes e suas capacidades de crescer a diversas actividades de água e temperaturas. T. crust. = Thermoascus crustaceus; Sam. = Saccharomonospora; Stm. = Streptomyces (adaptado de Lacey et al., 1991 por Kozakiewicz, com permissão da autora) Figura 1.7. Conidióforo de Aspergillus bisseriado (A. ochraceus) e terminologia das estruturas usadas na classificação e identificação. O conidióforo é constituído pelo aspergillum (designação que se dá à parte superior da estrutura, ou seja, o conjunto da vesícula e das células reprodutivas especializadas que contém) e pelo estipe. São visíveis nas figuras as métulas (células estéreis), fiálides (células conidiogénicas) e conidia (esporos assexuais) (barra de escala = 10 µm) Figura 1.8. Outras estruturas de Aspergillus. Em cima, à esquerda: esclerócios negros de A. alliaceus; em cima, direita: células de Hulle de Emericella sp. (setas); em baixo, à esquerda: cleistotécios de Eurotium vistos ao estereomicroscópio (estruturas de cor amarela); em baixo, à direita: preparação microscópica de Eurotium, em que são visíveis um conidióforo de Aspergillus, o cleistotécio, ascos e ascósporos soltos Figura 1.9. Conidióforos de Penicillium com penicilli do tipo mais simples (penicillus monoverticilado vesiculado de P. glabrum, direita) e complexo (penicillus terverticilado de estipe liso de P. brevicompactum, esquerda) (barra de escala = 10 µm) Figura 2.1. Localização geográfica das zonas vitícolas europeias definidas pela directiva comunitária 822/87 revogado pelo regulamento CE Nº 1493/1999 de 17 de Maio de Figura 2.2. Estrutura molecular da ocratoxina A...79 xvi

2 Figura 2.3. Distribuição da precipitação (R, em mm) e temperatura (T, ºC) ao longo dum ano em diferentes locais da região do Douro, de macrobioclima Mediterrânico (retirado de acedido em 02/12/04)...84 Figura 2.4. Mapa das denominações de origem portuguesas (retirado do sítio do IVV, URL: Figura 2.5. Aspecto da morfologia das colónias de estirpes de Aspergillus secção Nigri em cultura pura (CZ, 10 dias): A) agregado A. niger; B) A. carbonarius; C) A. japonicus. Em todos os casos, a esporulação é abundante e a cor da colónia é dominada pela cor escura dos conidia Figura 2.6. Aspergilli existentes na secção Nigri vistos ao microscópio de Nomarski: em cimaunisseriado, duma estirpe de A. japonicus; em baixo- bisseriado, duma estirpe do agregado A. niger (barra de escala = 10 µm) Figura 2.7. Tipos de esporos de Aspergillus secção Nigri vistos ao SEM. Em cima: esporos verrucosos de A. niger; em baixo: esporos equinulados de A. ellipticus a emergirem das fiálides Figura 3.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes (retirado do sítio da CVRVV. URL: Figura 3.2. Localização das 3 sub-regiões do Douro (retirado do sítio do IVP. URL: acedido a 12/02/05) Figura 3.3. Delimitação geográfica das subregiões vitícolas do Alentejo. (retirado do sítio de clubvintage.com. URL: acedido a 12/02/05) Figura 3.4. Localização geográfica das sub-regiões do Ribatejo (retirado de clubvintage.com. URL: acedido a 12/02/05) Figura 3.5. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios da temperatura do ar em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas : esquerda- temperatura mínima anual; centro- temperatura média anual; direita- temperatura máxima anual. As letras representam a localização aproximada das estações meteorológicas respectivas utilizadas neste estudo Figura 3.6. Cartas com a representação da distribuição geográfica dos valores médios anuais da precipitação em Portugal Continental com base nas Normais Climatológicas : esquerdaquantidade de precipitação anual (mm); centro- nº de dias com precipitação superior a 1 mm; direita- nº de dias com precipitação superior a 10 mm. As letras representam a localização aproximada das estações metereológicas respectivas utilizadas neste estudo Figura 3.7. Esquema do plano de recolha de 10 cachos na vinha ao longo de 2 transectos diagonais Figura 3.8. Placa de isolamento com 5 dias de incubação onde se observam fungos do género Penicillium a crescer em uvas Figura 3.9. Placa de isolamento ao fim de 5 dias de incubação invadida por Rhizopus sp Figura Cultura de Aspergillus rejuvenescida a partir da missanga (centro da colónia) dum criovial a -80 ºC Figura Exemplo de duas entidades relacionadas num modelo E-R. A entidade região de origem das uvas (designada por Regioes ) é uma tabela com 3 atributos: 1 identificativo (id_regiao) e dois xvii

3 descritivos: o nome da região (cujo valor pode ser Alentejo, Dão, Douro, Madeira, Ribatejo ou Vinhos Verdes) e observações (v.g., sul de Portugal). A entidade Locais liga-se à entidade Regioes com uma relação de 1 para muitos, pois uma região pode ter vários locais. A entidade Locais possui dois atributos chave: um atributo identificativo (id_local) e um atributo identificativo da tabela regiões, que permite fazer a ligação entre os dados das duas tabelas. Possui dois atributos descritivos: o nome do local (v.g., EVAG) e observações (v.g. em Arcos de Valdevez) Figura Modelo conceptual da base de dados. As entidades estão representadas em tabelas (caixas azuis). O nome da tabela está indicado a branco com fundo azul no topo da caixa. Os atributos estão listados nos espaços brancos. O atributo identificativo (chave primária) está a negrito. As relações entre as tabelas estão representadas por uma linha negra. O 1 e indicam que a relação é de um para muitos Figura Código de uma amostra de uvas de bago ervilha (colhida em 6 de Junho) proveniente do Douro, local Do2 (C é a sigla da Quinta), que corresponde ao ponto de amostragem Figura Código duma estirpe de Aspergillus isolada de uvas em O código de estirpe é constituído pelo ano de isolamento, inicial do material de onde foi isolado, siglas do género de fungo, e código sequencial para a estirpe Figura Formulários usados para inserir registos sobre a placa de isolamento (formulário amostragens, lado esquerdo), que através do botão isolamentos, dá acesso ao formulário isolamentos, que tem informação sobre as estirpes Figura Exemplo da construção dum questionário para saber qual o número de bagos colonizados com os Aspergillus negros A. niger e A. carbonarius nas regiões em 2003 nos estados de maturação analisados. Após selecção das tabelas que contêm a informação desejada, seleccionam-se os campos a pesquisar, e a informação desejada, especificando os critérios Figura Resultado do questionário construído conforme representado na Figura 3.16, com o número de bagos colonizados com Aspergillus niger e Aspergillus carbonarius em 2003 nas regiões nos estados de maturação estudados Figura Aspecto das uvas de mesa (casta Dominga) ao fim de 6 dias de incubação após pulverização com uma suspensão de esporos de A. carbonarius MUM Figura Diagrama do tipo caixa da distribuição do número de bagos colonizados com Penicillium nas amostras de uvas dos 3 estados de maturação (1, 2 e 3 correspondem a bago ervilha, pintor e vindima, respectivamente). Estão representadas graficamente a mediana do número de bagos colonizados com Penicillium nas amostras, o primeiro e terceiro quartil, o valor máximo e mínimo excepto outliers e extremos. N indica o número de amostras analisadas de cada estado de maturação Figura Árvore de decisão para a classificação das amostras em regiões. Os atributos são indicados numa oval, e as classes num rectângulo. Nas folhas do modelo, os números entre parêntesis significam o número de itens do conjunto de treino que o nó classificou naquela folha, bem como o número de itens incorrectamente classificados, caso existam (10.0/2.0 significa que 10 amostras foram classificadas como sendo dos Vinhos Verdes usando o critério de <4 bagos colonizados nas amostras com A. niger; 2 amostras foram incorrectamente classificadas por este critério) xviii

4 Figura 4.1. Aspecto da morfologia microscópica de Alternaria (em cima, à esquerda), Cladosporium (em cima, à direita) (barra de escala = 10 µm) Figura 4.2. Distribuição no nº total de fungos filamentosos detectados em cada amostra nos 3 estados de maturação sucessivos (1=bago ervilha; 2=pintor; 3=vindima) Figura 4.3. Distribuição do nº de bagos colonizados nas amostras de uvas nos 3 estados de maturação sucessivos (1= bago ervilha; 2=pintor; 3=vindima) com os géneros de fungos detectados em mais de 1% dos bagos que variaram significativamente com a maturação (continua) Figura 4.4. Distribuição do n.º de bagos colonizados com Aspergillus, Botrytis e Ulocladium nas regiões do Alentejo, Douro, Ribatejo e Vinhos Verdes na vindima. (Chama-se a atenção do leitor que a escala do gráfico de Ulocladium é menor que a de Aspergillus e Botrytis, visto que a frequência deste fungo nas uvas é menor que a dos outros géneros) Figura 4.5. Distribuição do n.º de bagos colonizados com Alternaria e Aspergillus, os géneros que diferiram significativamente entre os locais estudados na região do Douro Figura 4.6. Distribuição do n.º de bagos colonizados com Alternaria, Botrytis, Cladosporium e Rhizopus, os géneros que diferiram significativamente entre os locais estudados na região do Ribatejo Figura 4.7. Distribuição do n.º de bagos colonizados com Aureobasidium, o género que diferiu significativamente entre os locais estudados na região dos Vinhos Verdes Figura 4.8. Distribuição do n.º de bagos colonizados com o agregado A. niger e A. carbonarius, as espécies de Aspergillus que diferiram significativamente entre os estados de maturação (1=bago ervilha; 2=pintor; 3=vindima). Visto que A. carbonarius é menos frequente nas uvas que o agregado A. niger, por motivos gráficos, a escala de A. carbonarius é menor que a do agregado A. niger Figura 4.9. Distribuição do n.º de bagos colonizados com P. brevicompactum e P. glabrum/spinulosum, as espécies de Penicillium que diferiram significativamente entre os estados de maturação (1=bago ervilha; 2=pintor; 3=vindima) Figura Distribuição do n.º de bagos colonizados com estirpes do agregado A. niger, a espécie de Aspergillus que diferiu significativamente entre as regiões Figura Distribuição do n.º de bagos colonizados com estirpes do agregado A. niger e A. carbonarious, as espécies de Aspergillus que diferiram significativamente entre os locais da região do Douro Figura Distribuição do n.º de bagos colonizados com as espécie de Penicillium que diferiram significativamente entre as regiões Figura Árvore de decisão obtida com o algoritmo J48 com base na micoflora total de classificação das amostras em regiões Figura Modelo de árvore de classificação obtido com o algoritmo J48 com base nos atributos seleccionados como os mais preditivos (agregado A. niger, P. expansum, P. thomii e Ulocladium) para classificação das amostras em regiões Figura Modelo de árvore de classificação obtido com o algoritmo J48 com base na micoflora total de classificação das amostras em 3 regiões: Douro, Sul (Alentejo e Ribatejo) e Vinhos Verdes xix

5 Figura Modelo de árvore de classificação obtido com o algoritmo J48 com base nos melhores atributos (agregado A. niger e P. thomii) para classificação das amostras em 3 regiões: Douro, Sul (Alentejo e Ribatejo) e Vinhos Verdes Figura Trichothecium roseum sobre Botrytis num cacho de uvas podres do Douro (A); conidióforos de T. roseum (B). A barra de escala corresponde a 10 µm Figura Aspecto dum Aspergillus negro (A. carbonarius) a crescer num bago de uva na placa de isolamento Figura Gráficos de pontos da relação entre o número de bagos colonizados nas amostras com A. carbonarius e a incidência das espécies com que esteve significativamente correlacionado: agregado A. niger, Cladosporium, P. brevicompactum e P. simplissisimum Figura Gráficos de pontos da relação entre o número de bagos colonizados nas amostras com + estirped do agregado A. niger OTA e a incidência das espécies com que esteve significativamente correlacionado: agregado A. niger (total de estirpes), P. citrinum, P. corylophilum e P. roqueforti Figura Gráficos de pontos do número de bagos colonizados nas amostras com estirpes do agregado A. niger e de A. carbonarius com a razão Precipitação/Temperatura dos locais entre os meses do estudo: Junho a Setembro. A escala dos dois gráficos é diferente para melhor visualização Figura Mapa de Portugal continental com a temperatura máxima média com base nas normais climatológicas de A gradação de cores corresponde às temperaturas assinaladas na barra à direita. O número de bagos colonizados com estirpes de Aspergillus negros na vindima nos 3 anos está assinalado com círculos negros - um círculo: de 1 a 20 % bagos colonizados; 2 círculos concêntricos: de 21 a 40% de bagos colonizados; 3 círculos concêntricos: de 41 a 70% bagos colonizados Figura Aspecto duma colónia de A. ibericus em CZ ao fim de 10 dias (esquerda); aspergillum bisseriado da estirpe de A. ibericus A A barra de escala corresponde a 10 µm Figura Fotografias de esporos ao microscópio óptico de campo claro (A e B) e Nomarski (C a F) de estirpes de Aspergillus secção Nigri: A) agregado A. niger 02UAs55; B) agregado A. niger 02UAs165; C) A. carbonarius 02UAs104; D) A. carbonarius 03UAs158; E) A. ibericus 03UAs254; F) A. ibericus A A barra de escala corresponde a 10 µm em todas as fotografias Figura Fotografias de SEM de esporos com ornamentação verrucosa: A) A. carbonarius IMI041875; B) A. niger 01UAs358; C) A. niger 01UAs160; D) A. tubingensis 01UAs278 (barra de escala = 2 µm) Figura Fotografias de SEM de esporos com ornamentação equinulada: A) A. ellipticus NRRL5120; B) A. carbonarius NRRL369; C) A. ibericus 03UAs254; D) A. niger 01UAs227 (barra de escala: 2 µm) Figura Distribuição do diâmetro dos esporos do total de estirpes analisadas do agregado A. niger, A. ibericus e A. carbonarius (N diz respeito ao número total de esporos medidos em cada taxon) Figura Distribuição do diâmetro dos esporos em cada estirpe do agregado A. niger analisada Figura Distribuição do diâmetro dos esporos em cada estirpe de A. ibericus analisada Figura Distribuição do diâmetro dos esporos em cada estirpe de A.carbonarius analisada xx

6 Figura Modelo de classificação obtido com o algoritmo J48 com base no diâmetro médio de 10 esporos de cada estirpe do agregado A. niger, A. ibericus e A. carbonarius nas 3 espécies Figura Modelo de classificação obtido com o algoritmo J48 com base no diâmetro médio de 10 esporos e na capacidade de produção de OTA de cada estirpe do agregado A. niger, A. ibericus e A. carbonarius nas 3 espécies Figura Modelo de classificação obtido com o algoritmo J48 com base no diâmetro de cada esporo de cada estirpe do agregado A. niger, A. ibericus e A. carbonarius nas 3 espécies Figura Modelo de classificação obtido com o algoritmo J48 com base no diâmetro de cada esporo e na capacidade de produção de OTA de cada estirpe do agregado A. niger, A. ibericus e A. carbonarius nas 3 espécies Figura Regressão linear entre o método de extracção proposto nesta dissertação (designado por Serra et al.) e o de MacDonald et al (1999) quanto à determinação da OTA presente em 11 amostras de uvas contaminadas com OTA por incubação das uvas com a estirpe de A. carbonarius 01UAs263. As diferentes concentrações foram obtidas por diluição da amostra contaminada com amostras não contaminada Figura Cromatograma duma amostra de uva negativa para a presença de OTA Figura Em baixo: cromatograma de uma amostra de uva positiva para OTA (0,29 µg/l na amostra, correspondente a 0,04 µg/kg uva). Em cima: cromatograma de um padrão de OTA 0,1 µg/l Figura Cromatograma de uma amostra com uma substância interferente próximo do tempo de retenção da OTA (em cima). O pico não incrementa com adição de padrão à amostra, sendo visíveis dois picos distintos (em baixo) Figura Cromatogramas da amostra de 2003 da vinha 9 no estado bago ervilha. Em cima: amostra com pico de OTA antes da derivatização; no meio: amostra derivatizada com BF ; em baixo: padrão de OTA de 10 µg/kg derivatizado Figura Gráficos de pontos para a [OTA] nas amostras de uvas com a acidez total, açúcares redutores e razão acidez/açúcares redutores Figura 1. Tempo estimado que despendi em cada uma das tarefas integrantes do doutoramento xxi