Índice. Introdução...1. Capítulo 1. Micotoxicologia O que são micotoxinas Produção de micotoxinas e sua presença em alimentos...

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1 Índice Introdução Enquadramento Motivação Objectivos e metodologia Limitações do estudo Estrutura da dissertação...8 Capítulo 1. Micotoxicologia O que são micotoxinas Perspectiva histórica Avaliação de risco das micotoxinas para a saúde Micotoxinas frequentemente detectadas Controlo de micotoxinas Gestão de risco de micotoxinas Produção de micotoxinas e sua presença em alimentos Pré-colheita Pós-colheita Processamento dos alimentos Cadeia alimentar Presença e distribuição de micotoxinas em comodidades agrícolas Medidas de prevenção e controlo na contaminação por micotoxinas Fungos produtores de micotoxinas Fisiologia e Ecologia Taxinomia e nomenclatura dos géneros produtores de micotoxinas Detecção, quantificação e identificação de fungos filamentosos em comodidades agrícolas e alimentos Métodos de cultivo Métodos de não-cultivo Quantificação de fungos em alimentos Métodos de determinação de micotoxinas Métodos de determinação da produção de micotoxinas por fungos Métodos de determinação de micotoxinas em alimentos Validação de métodos vi

2 Capítulo 2. Revisão bibliográfica: OTA em uvas e seus derivados Micotoxinas em uvas e vinhos: ocratoxina A OTA em uvas, vinho e outros produtos vitícolas Contribuição do vinho para a exposição da população Europeia à OTA Potenciais riscos para a saúde da presença de OTA em vinho Hipóteses para a contaminação dos vinhos com OTA A videira: biologia, ecologia e cultivo O clima Mediterrânico Ciclo vegetativo anual da videira Composição morfológica e química das uvas Os inimigos da vinha Cultivo da vinha em território nacional Espécies produtoras de OTA Espécies produtoras de OTA nas uvas Biologia e ecologia dos Aspergillus secção Nigri Taxinomia da secção Nigri Determinação de OTA em uvas e vinho Determinação de OTA em vinho Determinação de OTA em uvas Capítulo 3.Materiais e Métodos Área de estudo Região Demarcada dos Vinhos Verdes Região Demarcada do Douro Região Alentejo Região Ribatejo Região Dão Região Madeira Locais estudados Caracterização climática e bioclimática dos locais de estudo Regime de temperaturas Regime de precipitações Insolação Temperatura e precipitação em Setembro Caracterização bioclimática dos locais estudados Castas Vinhas amostradas vii

3 1.16. Caracterização climática dos anos de estudo Estados de maturação estudados Total de amostras de uvas analisadas Análise de mostos Plano de amostragem Colheita dos cachos Transporte para o laboratório Enumeração de fungos filamentosos Isolamento de fungos das uvas Meios de cultura usados no isolamento de estirpes Conservação das estirpes isoladas Segurança e higiene no laboratório de micologia Identificação e caracterização dos fungos Manuais de identificação Preparação de Aspergillus para observação ao SEM Confirmação da identificação de Aspergillus secção Nigri Diferenciação de Penicillium Perfis de metabolitos secundários de estirpes de Penicillium Fotografias dos espécimens identificados Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes de Aspergillus Estirpes analisadas Reagentes químicos e materiais Rastreio de produção de OTA pelas estirpes Ensaio interlaboratorial Construção duma base de dados para documentação da micoflora das uvas Software Modelo da base de dados Estrutura da base de dados Formulários Questionários Determinação da OTA em uvas Reagentes químicos e materiais Colheita e preparação das amostras Validação de método de extracção de OTA em uvas Experiências de adição de padrão Comparação dos métodos com uvas naturalmente contaminadas Extracção com solução bicarbonada e PEG Extracção com metanol acidificado Limpeza da amostra por imunoafinidade viii

4 6.9. Quantificação Avaliação da influência da composição química do estado de maturação e variedade de uva na produção de OTA Estirpe e inóculo Amostras de uvas Determinação da composição de açúcares e ácidos orgânicos das uvas Avaliação da produção de OTA nas uvas Detecção, quantificação, e confirmação da OTA Preparação do padrão de OTA Detecção e quantificação por HPLC- FL Identificação e confirmação da OTA Calibração Procedimentos de segurança Análise dos dados Software Testes estatísticos realizados Representação gráfica de estatísticas Árvores de decisão Avaliação do desempenho dos métodos de extracção Objectivos e plano de trabalho Capítulo 4.Resultados Caracterização da micoflora das uvas Micoflora normal das uvas Micoflora das uvas após plaqueamento com desinfecção superficial Podridão detectada nos bagos Fungos filamentosos detectados no mosto Espécies produtoras de OTA detectadas Penicillium Aspergillus Relação entre estirpes produtoras de OTA e a restante micoflora na vindima Relação entre o clima e as espécies produtoras de OTA Aspergillus ibericus Estirpes de A. ibericus analisadas Caracterização morfológica das estirpes Comparação com a morfologia de outras espécies da secção Nigri Caracterização dos esporos de A. ibericus por SEM e comparação com outras espécies da secção Nigri ix

5 3.4. Classificação de espécies com base no tamanho dos esporos Análise de OTA nas uvas Validação do procedimento de extracção com adição de OTA a amostras de uvas Comparação dos procedimentos de extracção com amostras naturalmente contaminadas OTA nas uvas Avaliação do potencial ocratoxigénico das estirpes em meio de uva Avaliação do potencial ocratoxigénico de A. carbonarius 01UAs263 em uvas de diferentes variedades e estados de maturação Capítulo 5.Discussão dos resultados Micoflora das uvas Micoflora de uvas normais Micoflora das uvas após desinfecção superficial dos bagos Podridão detectada nos bagos Micoflora do mosto Espécies de Aspergillus da secção Nigri produtoras de OTA Estirpes OTA + e maturação das uvas Variação da incidência de estirpes OTA + com a região de origem Relação entre estirpes OTA + e a restante micoflora das uvas Aspergillus ibericus Concentração de OTA nas uvas portuguesas Avaliação do potencial ocratoxigénico das estirpes em meio de uva Outros perigos micotoxigénicos nas uvas T. roseum e seus metabolitos Alternaria e alternariol Penicillium e patulina Capítulo 6. Conclusões e trabalho futuro Epílogo Referências bibliográficas Anexo I Parâmetros bioclimáticos Parâmetros relacionados com o regime de temperaturas Parâmetros relacionados com o regime de precipitações (mm) Índices bioclimáticos x

6 2.1. Índice de termicidade (I t ) Índice de continentalidade (I c ) Índice ombrotérmico anual (I o ) Índices ombrotérmicos estivais compensáveis (I osc ) Caracterização bioclimática territorial Anexo II xi