1.1. Enquadramento INTRODUÇÃO

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1 Introdução Sumário Nesta secção introduz-se brevemente o trabalho desenvolvido. Começa-se por enquadrar o tema do trabalho nos ramos da segurança alimentar e micotoxicologia. De seguida, aborda-se a motivação do trabalho, destacamse os principais objectivos que nos propusemos alcançar, bem como as principais limitações ao seu cumprimento, e descreve-se a estrutura da dissertação Enquadramento Motivação Objectivos e metodologia Limitações do estudo Estrutura da dissertação... 8

2 1.1. Enquadramento A segurança alimentar tem vindo a atrair cada vez mais a atenção e preocupação dos consumidores. A Organização Mundial de Saúde (OMS) e a Organização de Alimentos Agrícolas (FAO) reconheceram que o acesso a alimentos nutricionalmente adequados e seguros é um direito de cada indivíduo 1. As micotoxinas são compostos com reconhecida actividade tóxica em animais, produzidas por algumas espécies de fungos filamentosos, que podem estar presentes em alimentos. Como são contaminantes naturais, não é possível eliminar a sua presença dos alimentos por completo, mas podem e devem ser reduzidos a níveis que não apresentem risco para as populações. A detecção recente da micotoxina ocratoxina A (OTA) em vinhos despertou na União Europeia (UE) alguma preocupação por parte de organizações alimentares. O vinho foi considerado a segunda causa principal de ingestão da micotoxina, a seguir aos cereais, contribuindo com 10% da dose ingerida diariamente. A Organização Internacional do Vinho (OIV) com base nos dados disponíveis, estipulou como limite máximo provisório, a entrar em vigor na vindima de 2005, 2 µg/l de OTA no vinho. À data da redacção desta dissertação, existem limites máximos legais na UE para a OTA em cereais e uvas passas, e o controlo legal da presença de OTA em café e vinhos aguarda adopção formal pela Comissão Europeia 2. As causas da contaminação do vinho com a micotoxina não estão bem estabelecidas. Verificou-se que a frequência e os níveis de contaminação de OTA varia consoante o tipo de vinho e a origem geográfica, sendo os vinhos tintos e os doces oriundos de países com climas mediterrânicos, em particular do Sul da Europa e Norte de África, os mais contaminados. Levantou-se a hipótese de que a relação da OTA com a origem geográfica dos vinhos poderia ser devida a diferenças na distribuição e incidência de fungos produtores de OTA na micoflora das uvas. Como tal, comités científicos alimentares salientaram a necessidade de se realizarem estudos detalhados nos países europeus produtores de vinho, para que as causas de contaminação com OTA sejam estabelecidas e a avaliação e minimização do problema seja possível. 1 FAO/OMS, World Declaration on Nutrition, Roma, disponível em: (acedido em 15/01/2005) 2 European Mycotoxin Awareness Network (EMAN). URL: (acedido em 16/02/05) 2

3 Estudos deste género estão enquadrados na área da micotoxicologia. A micotoxicologia pode definir-se amplamente como o estudo das micotoxinas. No entanto, não existe nenhuma definição detalhada do que é a micotoxicologia até à data da escrita desta dissertação. Isto deve-se ao facto de que esta área emergiu como uma disciplina única duma série de estudos prévios com variados propósitos. Na era pós-antibiótica, o estudo dos metabolitos secundários microbianos focou-se na implicação das substâncias na medicina humana, mas a natureza ecológica dos metabolitos secundários permaneceu um mistério. Mais tarde, com o facto das micotoxinas terem um impacto grande na agricultura, a nível comercial e económico, iniciouse uma nova era com o estudo da toxina-microrganismo (Bhatnagar et al., 1992). Como afirmado por Bhatnagar et al. (ob. cit) no prefácio do seu livro: Although initial considerations of mycotoxins appeared to have the qualities of a Tower of Babel, threads of common interdisciplinary interest began to develop as the discipline matured. A critical conceptual problem paralleled the quandary of the antibiotic period, i.e., the fundamental mystery of the biological logic for production of secondary metabolites. Na visão da autora desta dissertação, a micotoxicologia pode ser definida como a vertente de qualquer área científica ou do saber que se dedique ao estudo da produção das micotoxinas por fungos filamentosos nos agroecossistemas e às implicações da presença destes compostos nos agroecossistemas e nos animais que interagem com eles, incluindo animais domésticos e seres humanos. Desta forma, considera-se a micotoxicologia uma ciência de base multidisciplinar que tenta dar resposta à questão de fundo apontada por Bhatnagar et al.: the fundamental mystery of the biological logic for the production of secondary metabolites. Na sua vertente prática, visa reunir conhecimentos que previnam ou minimizem a contaminação dos agroecossistemas com micotoxinas, a níveis considerados seguros. As ciências de base da micotoxicologia e os seus objectos de estudo estão indicadas na Figura 1. A presente dissertação enquadra-se no estudo da produção de micotoxinas por fungos filamentosos e a presença de micotoxinas em alimentos. Este tema é estudado por diversas áreas do saber, que contribuem para o conhecimento geral, como por exemplo a ecofisiologia, patologia vegetal e a ecologia. É claro que cada uma das áreas mencionadas não é estanque, e existe partilha de informação nos diferentes domínios do saber. Isso é particularmente notável em áreas muito abrangentes como é o caso da ecologia, como esquematizado por Christensen 3

4 (1989). O papel da taxinomia e identificação de fungos nos estudos das diversas áreas é fundamental para que o conhecimento obtido seja válido e de utilidade, e por isso compreendeu uma boa parte do trabalho da dissertação. Christensen (ob. cit.) resumiu diversas opiniões sobre o papel da taxinomia na ecologia, e transcreve-se um excerto do texto de seguida: In the words of Moore et al., if we are to understand the importance of arthropods in soil processes, several gaps in our present knowledge must be addressed. The first step is to identify the species involved whenever possible. Mycologists will substitute fungi for arthropods and may leave soil processes or replace that phrase with any specific function - like decomposition, accumulation or predation ( ) It is fair to ask the question, Can the mycologist advance beyond the compiling of species lists?, but at the same time, it is important for all of us to recognize that floristics/biosystematics is fundamental to ecological research. Um dos investigadores que mais contribuiu para a elucidação da taxinomia de Aspergillus e Penicillium, dois importantes géneros produtores de micotoxinas, foi John Pitt. Quando confrontado pela autora da dissertação com a pergunta qual a importância da taxinomia para a micotoxicologia?, a sua opinião foi a seguinte:...taxonomy and fungal identification are central to mycotoxicology. Although traditional taxonomy does not have its basis in mycotoxin production, work over the last 20 years has shown that in many genera a direct relationship exists between a species name and mycotoxin production. In Aspergillus and Penicillium, ( ) this correlation is both absolute and fundamental. ( ) in my view, accurate taxonomic identification is a fundamental to understanding of the occurrence of mycotoxins in foods. Even closely related species in Penicillium usually differ in their secondary metabolite profiles, and often in their physiology, including the effect of physical factors such as temperature and water activity on their growth and mycotoxin production. If a species occurring a food or feed is known accurately, one can predict the particular mycotoxins likely to occur in particular foods. 4

5 MICOTOXINA Química analítica Farmácia Toxicologia Taxinomia Ecofisiologia Patologia vegetal Ecologia FUNGO Micologia Taxinomia Ecologia Biotecnologia ALIMENTOS CONTAMINADOS Agricultura Química analítica Engenharia de processos Biotecnologia Medicina Epidemiologia Toxicologia Economia e comércio CONSUMIDORES (SERES HUMANOS E OUTROS ANIMAIS) Figura 1. Objectos de estudo das principais ciências de base da micotoxicologia e interacções entre áreas de investigação 1.2. Motivação O presente trabalho foi englobado num esforço concertado dum projecto internacional para avaliação das causas da contaminação do vinho com a OTA, o Wine-Ochra Risk, tendo em vista a previsão e minimização da sua ocorrência. Portugal é um país produtor de vinhos tintos, e o clima no território português é maioritariamente mediterrânico. De acordo com os dados disponibilizados pelo Instituto da Vinha e do Vinho (IVV) 3, a superfície vitícola de Portugal representa 27% do território 3 Dados disponíveis na WWW. URL: (acedido em 16/02/05) 5

6 nacional. Em Portugal produz-se em média cerca de 7 milhões de hectolitros de vinho por ano, e consome-se cerca de 5 milhões de hectolitros por ano. Em 2003, exportaram-se cerca de 3 milhões de hectolitros de vinho, correspondentes a cerca de 544 milhões de euros. O vinho é um produto de enorme importância para Portugal, fabricado desde tempos ancestrais, com implicações na história, economia, hábitos sociais e culturais. Contribuir para a segurança alimentar do vinho é pois uma necessidade, em particular quando o estabelecimento de limites máximos de OTA foi proposto na UE. O presente trabalho permitiu ainda o estudo da micoflora das uvas portuguesas, e suas implicações quanto à eventual produção de outros metabolitos relevantes, permitindo contribuir para o conhecimento da ecologia das uvas e sua relação com os fungos a que estão expostas Objectivos e metodologia O objectivo central desta dissertação foi contribuir para a avaliação de risco de contaminação das uvas com OTA nas regiões estudadas e identificar outros potenciais perigos causados pelos fungos filamentosos quanto à produção de micotoxinas que possam estar presentes no vinho. Para tal, fizeram-se estudos a 3 níveis: Determinação da micoflora das uvas. A micoflora das uvas foi estudada em 3 estados de maturação do bago, em 4 regiões demarcadas distintas durante um período de 3 anos: Alentejo, Douro, Ribatejo e Vinhos Verdes. Usaram-se métodos de detecção de plaqueamento que permitem avaliar a micoflora total do bago e a micoflora após desinfecção superficial. Desta forma, pretendeu-se: i) conhecer e identificar as espécies de Aspergillus e Penicillium presentes nos bagos capazes de produzir micotoxinas relevantes nas uvas, com destaque para a OTA; ii) determinar quando surgem as principais espécies produtoras no bago; iii) verificar qual a sua relação com a restante micoflora; iv) determinar a variação com a região geográfica de origem. Adicionalmente, analisou-se a micoflora do mosto de uvas até à fermentação, para ver que fungos permaneciam viáveis. Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes isoladas. A capacidade das estirpes produzirem OTA foi avaliada em meios laboratoriais e meios formulados à 6

7 base de uvas, para verificar o potencial toxigénico das estirpes das potenciais espécies produtoras de OTA para as uvas portuguesas. Determinação de OTA nas uvas ao longo da maturação. Pretendeu-se desenvolver um método para análise de OTA nas uvas com base num método descrito para o vinho, e verificar a sua adequação à matriz sólida das uvas. De seguida, pretendeu-se determinar o teor de OTA das uvas ao longo da maturação, para avaliar se o potencial de produção dos fungos produtores de OTA detectados nas uvas está a ser expresso nos bagos antes da colheita, e a que níveis Limitações do estudo O facto de ser um estudo em ambiente real, com uvas destinadas à produção de vinho, fez com que não se tivesse liberdade experimental em campo para avaliar a influência de factores em separado. Daí que o estudo da micoflora das uvas seja automaticamente condicionado pelos tratamentos fitossanitários efectuados. A realização do presente trabalho de dissertação foi englobada no projecto internacional Wine-Ochra Risk. Como tal, forçou a tarefas de entrega obrigatória, e uso de metodologias uniformizadas para ser possível correlacionar os trabalhos com os resultados de outros países, limitando a liberdade de escolha. A diversidade de regiões vitivinícolas demarcadas, com microclimas diversos, tornou impossível uma caracterização cuidada nacional. Isso é particularmente verdade para as regiões autónomas da Madeira e Açores, que essencialmente por razões logísticas, não foram estudadas. Foi, no entanto, possível estudar duas amostras da ilha da Madeira. É de lamentar a nível do estudo o facto de não ter sido encontrada nenhuma situação de controlo fortemente positivo quanto à presença da micotoxina, para efeitos comparativos da micoflora. Por outro lado, se reflectir a situação nacional, esta situação é muito benéfica para todos os produtores e consumidores de uvas e vinhos portugueses. 7

8 1.5. Estrutura da dissertação Esta dissertação encontra-se organizada em 6 capítulos, dois dedicados à introdução e revisão bibliográfica, e os 4 seguintes aos materiais e métodos, resultados, discussão e conclusões e trabalho futuro. A interacção entre as diferentes secções nos capítulos está representada na Figura 2. A dissertação inicia-se com o capítulo 1, onde se faz um apanhado do estado do conhecimento actual da micotoxicologia e dos seus principais problemas nas suas vertentes distintas. Introduzem-se definições e conceitos usados no decorrer da dissertação. No capítulo 2, faz-se uma revisão bibliográfica sobre a problemática da contaminação das uvas e vinho com micotoxinas, em particular a OTA, em que se expõe uma perspectiva histórica, hipóteses existentes no início da dissertação e conhecimento publicado até à escrita desta dissertação. De seguida apresenta-se os objectivos e o plano experimental seguido neste trabalho. No capítulo 3 é dedicado aos materiais e métodos usados na dissertação. Na secção 1, faz-se uma caracterização da área de estudo, com ênfase no clima dos locais estudados; na secção 2, descreve-se o procedimento de amostragem; na secção 3, descrevem-se os procedimentos de detecção, isolamento, identificação e conservação de estirpes de fungos filamentosos; na secção 4, descreve-se o procedimento da avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes em meios laboratoriais; na secção 5, descreve-se a estrutura da base de dados destinada ao registo de informação quanto à identidade, origem e capacidade de produção de OTA das estirpes isoladas; na secção 6, indica-se o método de determinação de OTA em uvas, incluindo o processo de validação do método de extracção de OTA das uvas; na secção 7, descreve-se a experiência de estudo da influência da composição do meio de uva na capacidade de produção de OTA por Aspergillus; na secção 8, descreve-se a detecção, quantificação e confirmação de OTA nas amostras por HPLC com detector de fluorescência, incluindo a calibração do aparelho; na secção 9, indicam-se as ferramentas de análise de dados usadas e os testes efectuados. A secção 7, apesar de estar relacionada com a avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes, é apresentada separadamente da secção 4 pois tem um planeamento experimental distinto que foi motivado pelos resultados obtidos quanto à micoflora e presença de OTA nas uvas. 8

9 No capítulo 4, apresentam-se os resultados obtidos no decorrer do trabalho da dissertação. Na secção 1, apresentam-se os resultados quanto à caracterização da micoflora. Na secção 2, indicam-se as principais espécies produtoras de OTA detectadas nas amostras e sua distribuição nas amostras estudadas; na secção 3, descrevem-se em detalhe as estirpes de Aspergillus negros isoladas das uvas, em particular de algumas estirpes incapazes de produzir OTA em níveis detectáveis e de morfologia distinta das espécies descritas na literatura, que se pensa tratar-se dum novo taxon: Aspergillus ibericus. Na secção 4 indicam-se os resultados obtidos quanto à validação do procedimento de extracção das uvas bem como os níveis de OTA detectados nas amostras analisadas. Na secção 5 descrevem-se os resultados obtidos quanto à capacidade ocratoxigénica de estirpes de Aspergillus em meio de uva. No capítulo 5 discutem-se os resultados apresentados no capítulo anterior pela mesma ordem e discutem-se na última secção as implicações da presença dos fungos detectados quanto a outros perigos micotoxigénicos para as uvas. No capítulo 6 apresentam-se as principais contribuições e conclusões da dissertação, bem como sugestões de trabalhos futuros. Em seguida, reserva-se um espaço de reflexão e avaliação pessoal do trabalho desenvolvido no epílogo. Finalmente, apresentam-se dois anexos. O anexo I diz respeito aos parâmetros e índices climáticos usados na caracterização bioclimática das regiões, no capítulo 3, secção 1. No anexo II, estão listadas todas as estirpes conservadas, incluindo o código, a origem, condições de isolamento e informação quanto à produção de OTA para as estirpes de Aspergillus. Indica-se correspondência com códigos de acesso da Micoteca da Universidade do Minho MUM para as estirpes que estão depositadas nesta colecção. 9

10 Introdução CAPÍTULO 1 Micotoxicologia CAPÍTULO 2 Revisão bibliográfica: OTA em uvas e seus derivados Objectivos Determinação da micoflora das uvas Avaliação da capacidade ocratoxigénica das estirpes Determinação da OTA em uvas CAPÍTULO 3 Material e Métodos 1. Área de estudo 2. Amostragem 3. Enumeração de fungos filamentosos 4. Produção de OTA pelas estirpes 5. Base de dados 6. OTA em uvas 7. Produção OTA em meio de uva 8. Análise de dados CAPÍTULO 4 Resultados 1. Micoflora das uvas 2. Espécies OTA+ isoladas 3. Aspergillus ibericus 4. OTA em uvas 5. Produção OTA em meio de uva CAPÍTULO 5 Discussão 1. Micoflora das uvas 2. Espécies OTA+ isoladas 3. Aspergillus ibericus 4. OTA em uvas 5. Produção OTA em meio de uva 6. Outros perigos micotoxigénicos CAPÍTULO 6 Conclusões Figura 2. Organização da dissertação por capítulos e secções de execução experimental, resultados e discussão 10