Controlo e Garantia de Qualidade da Técnica

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1 Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Mestrado em Controlo de Qualidade Controlo e Garantia de Qualidade da Técnica de PCR Ana Elisabete Pereira Correia de Oliveira Dezembro 2008

2 Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto Mestrado em Controlo de Qualidade Controlo e Garantia de Qualidade da Técnica de PCR Área: Medicamentos e Plantas Medicinais Orientador: Professor Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Co orientadora: Professora Doutora Maria de São José Garcia Alexandre Nascimento da Fonseca Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre apresentado à Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Trabalho realizado no laboratório de Oncologia Molecular do IPO Porto e financiado pela Fundação Astrazeneca. Ana Elisabete Pereira Correia de Oliveira Dezembro 2008

3 Declaração relativa à reprodução: É autorizada a reprodução integral desta dissertação apenas para efeitos de investigação mediante declaração escrita do interessado, que a tal se compromete. ii

4 Agradecimentos O presente trabalho não seria possível sem a ajuda e o apoio de determinadas pessoas que demonstraram o seu apoio e carinho incondicional. Tentando não esquecer ninguém, quero agradecer: Em primeiro lugar, à Fundação Astrazeneca, que financiou este projecto. À Professora Doutora Maria Beatriz Prior Pinto Oliveira, coordenadora do Mestrado em Controlo de Qualidade, pela sua preocupação, atenção e apoio prestados, pela rápida resposta e bons conselhos sempre que solicitada, aproveitando para felicitá la pela excelente coordenação deste mestrado. Ao Professor Doutor Rui Medeiros, meu orientador neste trabalho, pela simpatia e prontidão com que me recebeu, pelo apoio, pela ginástica temporal para me incluir na sua agenda, por si só cheia, pela paciência e entendimento, e principalmente pela orientação neste projecto inesperado. À Professora Doutora Maria de São José Nascimento, minha co orientadora que prontamente aceitou co orientar este projecto, pelas palavras reconfortantes de força e disponibilidade, que sempre me foi transmitindo nos últimos anos e pelo seu optimismo contagiante, que se revelou muito útil nos últimos meses. À Doutora Albina Marinho, do laboratório de Virologia do IPO Porto, pela simpatia e atenção prestada e pela partilha de conhecimentos que em muito enriqueceram este trabalho. A todos os meus colegas e recentes amigos do laboratório de Oncologia Molecular do IPO Porto, pela simpatia com que me receberam e se deixaram observar nas suas rotinas diárias. A todos os meus antigos colegas e amigos do departamento de Química Orgânica da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, especialmente à Professora Doutora Maria José Gonzalez e ao Carlos, pela grande amizade, alegria e apoio que sempre me demonstraram. A todos os meus familiares e amigos, pela presença e apoio constante. À Cátia, amiga e antiga companheira de laboratório e mestrado, pela amizade incondicional. Aos meus pais, pelo enorme carinho e apoio com que acompanharam as diversas fases deste mestrado, desculpando todos os pequenos momentos de má disposição e falta de disponibilidade. Ao Hélder, meu irmão, a pessoa que mais acredita em mim, por todas as horas infindáveis de conversa e carinho. Ao Pedro, que me acompanhou desde sempre neste mestrado, pela confiança, incentivo e carinho nas horas certas. iii

5 Resumo Esta dissertação pretende apresentar uma proposta de avaliação interna da qualidade das técnicas de PCR RFLP e Real Time PCR, utilizadas diariamente no laboratório de Oncologia Molecular do IPO Porto, com fins de diagnóstico e investigação epidemiológica e farmacogenómica. Este trabalho baseou se apenas na sua utilização qualitativa em projectos de investigação. O controlo e a garantia de qualidade têm um papel vital hoje em dia, ajudando a garantir a fiabilidade de resultados e produtos. Os critérios de qualidade tornaram se essenciais para assegurar a correcta utilização de tecnologias genéticas que se desenvolveram nas últimas décadas, como é o caso da amplificação dos ácidos nucleicos. Desde a sua descoberta, a amplificação dos ácidos nucleicos in vitro, através da técnica de PCR, tornou se uma ferramenta muito poderosa em laboratórios de diagnóstico. No entanto, uma das desvantagens apontadas tem sido a falta de requisitos e regulamentos padronizados para esta técnica, assim como a dificuldade de controlar todas as variáveis intervenientes, podendo comprometer a qualidade dos resultados. Sendo assim, e face à nova tendência universal de garantia de qualidade, é necessário implementar protocolos de controlo e sistemas de gestão de qualidade. O HACCP é uma metodologia preventiva que assenta numa abordagem científica e sistemática de identificação e avaliação de perigos específicos em todas as etapas da produção. Apesar do uso do HACCP não se ter ainda expandido ao laboratório de técnicas genéticas, a base deste sistema pode ser adaptada a diferentes sectores, com alta probabilidade de sucesso. Através de uma cuidada observação do laboratório de Oncologia Molecular e seus colaboradores e utilizando as bases do sistema de gestão de qualidade HACCP, foram elaborados os fluxogramas das técnicas de PCR RFLP e Real Time PCR, e preenchidas tabelas de identificação de perigos, pontos críticos de controlo, medidas de controlo e correctivas, reunindo todos os cuidados e acções a realizar durante a técnica e na resolução de problemas. A partir daqui, foram adaptados critérios de avaliação dos vários sectores do laboratório, utilizados na observação diária e que poderão ser implementados futuramente como medidas de avaliação interna do local, sua organização e colaboradores. Com a utilização dos fundamentos do HACCP, os critérios e a observação, concluiu se que os principais requisitos de trabalho eram, em geral, cumpridos, mas que faltava um protocolo que avaliasse internamente a qualidade dos vários passos, para além dos resultados. Tendo em conta os pontos críticos identificados e a necessária adaptação ao local, elaborou se um plano de controlo de qualidade interno, a experimentar, melhorar e implementar num futuro próximo. iv

6 Abstract This thesis aims to present a proposal for assessing internal quality of the technique of PCR RFLP and Real Time PCR, used daily in the laboratory of Molecular Oncology of IPO Porto. These techniques are used for purposes of diagnosis and epidemiological and pharmacogenomics research. This work was based only on their qualitative use in research projects. Quality control and assurance play a vital role nowadays helping to ensure the reliability of tests results and industrial products. The criteria of quality have become essential to ensure proper use of genetic technologies that have been developed in recent decades, such as the amplification of nucleic acids. In vitro amplification of nucleic acids using PCR has become, since its discovery, a powerful diagnostic tool. However, the lack of officially approved, standardized regulations and instructions has been pointed as one of the disadvantages, as well as the difficulty to control all the variables. Both can compromise the quality of the results. So, it is necessary to introduce a quality control plan and management system, in order to achieve the new universal trend of quality assurance. HACCP is a preventive approach based on a scientific and logical system designed to identify and evaluate specific hazards at all stages of the process. Despite the use of HACCP has not yet expanded to the genetic laboratory, the foundation of this system can be adapted and implemented in different sectors, with high probability of success. Through a careful observation of the laboratory of Molecular Oncology and its collaborators, and using the fundamentals of quality management system HACCP, the flowcharts were developed for PCR RFLP and Real Time PCR techniques, as well as tables for the identification of hazards, critical control points, control and corrective measures, bringing together all the care and actions to be undertaken during the technique and problem solving. From here, some criteria were also adjusted for evaluating the various sectors of the laboratory, and used for daily observation. These criteria may be implemented as future measures of internal evaluation of the site, its organization and employees. Using the fundamentals of HACCP, the criteria and observation, it was concluded that the main requirements of work were generally satisfied, but we needed a protocol to evaluate the internal quality of the various steps, in addition to the results. Given the critical points identified and the necessary adaptation to local, a plan of internal quality control was prepared, to experiment, improve and implement in the near future. v

7 Objectivos e Organização da Dissertação Face à importância actual da qualidade e à falta de documentos, registos e alguns procedimentos que controlem e comprovem a qualidade dos resultados e ensaios em geral praticados no laboratório de Oncologia Molecular do IPO Porto, foi objectivo desta dissertação iniciar um capítulo de integração do controlo e garantia da qualidade no laboratório, começando assim por exercer um controlo interno dos seus próprios ensaios. Alguns termos relativos a material, reagentes ou técnicas foram mantidos em inglês ao longo da dissertação, pela sua utilização habitual no laboratório. A dissertação está organizada em 4 partes. Na primeira parte, denominada Introdução, efectua se uma abordagem geral ao termo Qualidade, à sua história e evolução até ao tempo actual. A segunda parte, Controlo da Qualidade de Técnicas Genéticas, pretende rever o sector da qualidade nos ensaios genéticos e está subdividida em três pontos. No primeiro descreve se, de uma forma geral, a importância do controlo de qualidade nas técnicas genéticas; no segundo, faz se uma abordagem do controlo interno utilizado em ensaios genéticos, das variáveis que podem afectar os ensaios e que é necessário controlar; no terceiro, referem se brevemente os esquemas de controlo externo e de ensaios interlaboratoriais já existentes para as técnicas genéticas. Na terceira parte, intitulada HACCP, faz se uma descrição deste sistema de gestão da qualidade, a sua história, normas, utilização presente e futura. A quarta parte, Proposta de Modelo de Controlo e Garantia de Qualidade, constitui a parte principal deste trabalho, em que são apresentados os fluxogramas, as tabelas HACCP, os critérios e a proposta de plano de avaliação. Na quinta parte, denominada Resultados e Discussão, apresentam se os resultados da observação diária dos colaboradores do laboratório e da aplicação dos critérios referidos na quarta parte. Segue se uma breve discussão desses resultados e do próprio modelo proposto. A sexta parte, Conclusões e Perspectivas, resume as principais conclusões que foram retiradas a partir deste trabalho e como se pretende evoluir a partir daqui. Por último, a sétima parte compreende a Bibliografia utilizada na realização deste trabalho. vi

8 Índice Geral Agradecimentos iii Resumo iv Abstract v Objectivos e Organização da Dissertação vi Índice de Figuras ix Índice de Tabelas x Abreviaturas e Símbolos xii I. Introdução 1 II. Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas 7 1. Considerações Gerais 8 2. Controlo de Qualidade Interno de Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucleicos PCR Esquemas de Controlo Externo 26 III. HACCP 31 IV. Proposta de Modelo de Controlo e Garantia de Qualidade Adaptação de um Plano HACCP Critérios de Avaliação Plano de Avaliação de Qualidade 63 V. Resultados e Discussão Adaptação de um Plano HACCP Análise dos Resultados da Observação dos Colaboradores e Utilização dos Critérios Plano de Avaliação de Qualidade 79 vii

9 VI. Conclusões e Perspectivas 80 VII. Bibliografia 83 viii

10 Índice de Figuras Figura 1 Ciclo de Shewart/Deming 4 Figura 2 Evolução histórica da qualidade em Portugal 5 Figura 3 Variáveis pré analíticas em testes de laboratório 22 Figura 4 Erros presentes nas três fases do processo de um teste de laboratório 23 Figura 5 Anatomia de um esquema de controlo externo 27 Figura 6 Fluxograma de PCR RFLP 40 Figura 7 Fluxograma de Real Time PCR 41 Figura 8 Árvore de decisão de pontos críticos de controlo 50 ix

11 Índice de Tabelas Tabela 1 Princípios de controlo de qualidade interno para métodos de genotipagem baseados em PCR 14 Tabela 2 Operações realizadas em técnicas de ácidos nucleicos e potenciais fontes de erro 16 Tabela 3 Falsos positivos controlo e melhorias 17 Tabela 4 Falsos negativos causas, prevenção e detecção 19 Tabela 5 Fases do processo de um laboratório médico e possíveis erros 21 Tabela 6 Indicadores de qualidade e especificações (limites de aceitabilidade) da fase pré analítica 28 Tabela 7 Indicadores de qualidade e especificações (limites de aceitabilidade) da fase analítica 28 Tabela 8 Indicadores de qualidade e especificações (limites de aceitabilidade) da fase pós analítica 29 Tabela 9 Descrição do produto final 39 Tabela 10 Índice de risco para diferentes valores de severidade e probabilidade 42 Tabela 11 Descrição dos perigos, respectivas causas e medidas de controlo de cada etapa pré analítica 43 Tabela 12 Descrição dos perigos, respectivas causas e medidas de controlo de cada etapa analítica 47 Tabela 13 Descrição dos perigos, respectivas causas e medidas de controlo de cada etapa pós analítica 49 x

12 Tabela 14 Identificação de pontos críticos de controlo 51 Tabela 15 Monitorização e medidas correctivas de cada ponto crítico de controlo 52 Tabela 16 Cumprimento de critérios pré analíticos 68 Tabela 17 Cumprimento de critérios analíticos 69 Tabela 18 Cumprimento de critérios pós analíticos 72 xi

13 Abreviaturas e Símbolos A 260 Absorvância a 260nm A 280 Absorvância a 280nm ACMG ASAE ASCO AZF BRCA CAC CAP CE CEE CF CLIAC CLIA CMGS CMQ CMT DMD DNA DNAse ε American College of Medical Genetics Autoridade de Segurança Alimentar e Económica American Society of Clinical Oncology Factor de Azoospermia Cancro da Mama Hereditário Codex Alimentarius Commission College of American Pathologists Comissão Europeia Comunidade Económica Europeia Fibrose Cística Clinical Laboratory Improvement Advisory Committee Clinical Laboratory Improvement Amendments Clinical Molecular Genetics Society Ciclo de Melhoria da Qualidade Doença de Charcot Marie Tooth Distrofia Muscular de Duchenne Ácido Desoxirribonucleico Desoxirribonuclease Coeficiente de Extinção Molar xii

14 EDTA EMQN EQA EQUAL EU QCCA FA FAO FDA FDCA FMIA GMP HACCP Ácido Etilenodiaminotetracético European Molecular Genetics Quality Network External Quality Assessment Multinational External Quality Assay programmes in Clinical Molecular Diagnostics based on Performance and Interpretation of PCR assay methods European Union Quality Control Concerted Action Anemia de Fanconi Food and Agriculture Organization Food and Drug Administration Federal Food, Drug and Cosmetic Act Federal Meat Inspection Act Good Manufacturing Practices (Boas Práticas de Fabrico) Hazard Analysis Critical Control Point HCV Hepatitis C Virus (Vírus da Hepatite C) HD IEC IPO IR ISO NASA NCCLS NIBSC OMS Doença de Huntington International Electrotechnical Commission Instituto Português de Oncologia Índice de Risco International Standard Organization National Aeronautics and Space Administration National Committee for Clinical Laboratory Standards National Institute for Biological Standards and Control Organização Mundial de Saúde xiii

15 PCC PCR PDCA QA QMS RNA RNAse RFLP SACGT SDS SoGAT SOP TAN TQM UNG UV Ponto Crítico de Controlo Polymerase Chain Reaction (Reacção de Polimerização em Cadeia) Plan Do Check Act (Planear Fazer Verificar Agir) Quality Assurance (Garantia de Qualidade) Quality Management System (Sistema de Gestão da Qualidade) Ácido Ribonucleico Ribonuclease Restriction Fragment Length Polymorphism Secretaries Advisory Committee on Genetic Testing Dodecil Sulfato de Sódio Standardization of Gene Amplification Techniques Standard Operating Procedures Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucleicos Total Quality Management (Gestão da Qualidade Total) Uracil N glicosilase Ultravioleta xiv

16 I. Introdução

17 Introdução A Qualidade é um termo muito actual e de difícil definição. De uma forma geral, pode se dizer que qualidade é antecipar os requisitos dos clientes e fornecê los com precisão todas as vezes. Por outro lado, a qualidade total, termo mais actual, é vista como uma melhoria contínua, tendo como objectivo satisfazer os requisitos dos clientes, a um custo óptimo, através do empenho de todos [1]. No entanto, o termo qualidade é utilizado em muitas situações diferentes, variando a sua definição. Hoje em dia, a qualidade tem sido vista cada vez mais como uma estratégia efectiva para redução de custos, assegurando a vitalidade de um negócio e surgindo como o elemento chave para um aumento de produtividade e confiança, face às exigências cada vez maiores da população. Um pequeno grupo de Gurus da Qualidade tem vindo a defender o caminho da qualidade como um processo de melhoria, um ciclo interminável e indispensável, um caminho que pode ser percorrido através de diferentes meios. Quatro dos mais conhecidos são William Deming, Joseph Juran, Philip Crosby e William Conway, que defendem diferentes abordagens para um mesmo fim e diferentes definições do termo qualidade [2]. Segundo Deming, boa qualidade não é necessariamente um sinónimo de alta qualidade, mas sim um grau previsível de uniformidade e de confiança ao mais baixo custo e adaptado às necessidades do mercado. É um forte defensor dos métodos estatísticos e cartas de controlo, de modo a que não haja somente uma inspecção da matéria inicial e final, mas sim todo um controlo de produção, um acompanhamento do processo total [2]. Juran, por sua vez, menciona qualidade como adequação ao uso e conformidade com as especificações, interessa se pela gestão global da qualidade e defende o conceito de círculos de qualidade, que melhoram a comunicação entre os órgãos de gestão e os trabalhadores [2]. Crosby definiu qualidade como a conformidade com as exigências dos clientes, só podendo ser avaliada pelo custo da não conformidade. A sua abordagem defende que o único padrão de performance aceitável é o de zero defeitos e que a prevenção é o único sistema a utilizar, querendo com isso dizer a perfeição, não admitindo a existência de níveis estatísticos aceitáveis de qualidade [2]. Por último, Conway não fala de uma definição específica de qualidade, mas engloba a numa definição mais ampla de gestão pela qualidade, como sendo o desenvolvimento, fabrico, gestão e um fornecimento consistente de produtos e serviços a baixo custo que os clientes desejam e/ou necessitam. Defende a necessidade de criação de um novo sistema de gestão, cuja primeira tarefa deve ser a melhoria contínua em todas as áreas. É também um grande defensor dos métodos estatísticos [2]. Muitas outras definições de qualidade se podem encontrar, como sendo o grau de satisfação de requisitos dado por um conjunto de características intrínsecas [3], ou the right result 2

18 Introdução on the right specimen from the right patient that is accurate, timely and properly interpreted [4,5], uma definição que talvez se aproxime mais do campo de diagnóstico, ou uma definição mais corrente, em que a palavra qualidade é usada para significar excelência. De qualquer modo, seja qual for a definição usada, a qualidade é um conceito horizontal, que abrange todas as actividades e todos os sectores. É um factor competitivo que pode diferenciar os produtos e as competências e que abrange muitos conceitos, como controlo, garantia e gestão de qualidade. O controlo de qualidade é utilizado para garantir que os produtos ou serviços são realizados ou produzidos de modo a satisfazer ou exceder os requisitos do consumidor. A garantia de qualidade (QA, Quality Assurance) é a parte da gestão da qualidade orientada no sentido de gerar confiança quanto à satisfação dos requisitos da qualidade [3] e inclui todas as actividades desde o design, desenvolvimento, produção, instalação, manutenção e documentação. No fundo, a QA refere se a processos de produção planeados e sistemáticos que providenciam confiança na adequação do produto aos seus requisitos iniciais. A QA não consegue garantir completamente a produção de produtos de qualidade, mas torna a mais provável. Pode se dizer que enquanto o controlo de qualidade enfatiza o teste e o bloqueio da libertação de produtos defeituosos, a QA preocupa se com a melhoria e estabilização da produção de modo a evitar ou, pelo menos, minimizar questões que possam levar a produtos defeituosos. Mas a QA não elimina a necessidade de controlo de qualidade, pois alguns parâmetros são de tal maneira importantes que o seu teste é necessário, como prevenção. Dois documentos internacionais importantes onde a garantia de qualidade é mencionada e onde se especificam requisitos e meios para a conseguir são a ISO e a ISO A gestão da qualidade é o conjunto de actividades coordenadas para dirigir e controlar uma organização no que respeita à qualidade [3]. Resumidamente, assegura que todas as actividades necessárias para desenhar, desenvolver e implementar um produto ou serviço são eficientes, no que respeita à sua performance. A gestão de qualidade pode ter três componentes: controlo, garantia e melhoria de qualidade, focando se não só na qualidade do produto mas também nos meios para a alcançar. Existem muitos métodos para gerir e melhorar a qualidade, melhorando o produto, o processo e a formação das pessoas. Uma das estratégias mais usadas é o Ciclo de Melhoria da Qualidade (CMQ), uma abordagem sistemática e disciplinada para identificar oportunidades de melhoria da qualidade e implementar soluções duradouras [1]. A implementação baseia se num processo em quatro passos, muito utilizado na melhoria de empresas e negócios: Plan Do Check Act (PDCA) ou Planear, Fazer, Verificar e Agir, muitas vezes conhecido como ciclo de Deming ou de Shewhart. As diferentes fases deste processo estão esquematizadas na figura seguinte: 3

19 Introdução Figura 1 Ciclo de Shewhart/Deming (adaptado de [1]). O CMQ ajuda a resolver problemas e a identificar/implementar soluções. Quando todos os gestores utilizam o mesmo processo, o trabalho em grupo pode ser melhorado de forma significativa [1]. Resumidamente, ao planear, estabelecem se os objectivos e processos necessários para atingir os resultados esperados, ou seja, para o output ser o esperado; ao fazer, implementa se um novo processo, uma nova solução; ao avaliar, controla se o novo processo, comparando os resultados obtidos com os esperados, avaliando os desvios e estudando as razões; por último, agir consiste em determinar as causas dos desvios, implementar o processo e estudar ou reflectir sobre o desenvolvimento. Outra estratégia designa se por gestão da qualidade total (TQM, Total Quality Management). Este método é uma estratégia de gestão que visa incorporar a consciência de qualidade em todos os processos organizacionais. Há uma focalização nos clientes, a participação de todos os sectores, inclusive clientes e fornecedores, de modo a que se possa avaliar o desempenho de todos os processos e assim conseguir uma melhoria contínua [5]. A TQM é vista como uma gestão de futuro em Portugal, como se pode ver na esquematização da evolução histórica da qualidade em Portugal: 4

20 Introdução Figura 2 Evolução histórica da qualidade em Portugal (adaptado de [6]). Muitas outras estratégias são conhecidas e utilizadas, como os círculos de qualidade, em que existe uma abordagem de grupo para a melhoria, ou as normas da qualidade, mundialmente aceites. A International Organization for Standardization (ISO) criou as normas de Sistema de Gestão da Qualidade (QMS, Quality Management System), a série ISO 9000 (9001, 9002 e 9003), aplicáveis a diferentes indústrias e que são revistas regularmente. As normas ISO 9000 são um ponto de partida que não definem técnicas de gestão da qualidade, mas definem critérios uniformes pelos quais pode ser avaliado um sistema de qualidade e, por consequência, melhorado. A revisão do ano 2000 (série ISO 9000:2000), por necessidade de alargar o seu âmbito a outros processos, levou à integração da ISO 9002 e 9003 numa única norma, a ISO 9001:2000. Sendo assim, a ISO 9000:2000 passa a referir se aos fundamentos e vocabulário de sistemas de gestão da qualidade e a ISO 9001:2000 aos seus requisitos, exigências e processos necessários para que o produto alcance as expectativas de qualidade. Nesta série 9000:2000, formulou se também a ISO 9004:2000, que descreve as guidelines para uma melhoria da qualidade acima do padrão básico da ISO 9001:2000, ou seja, as linhas de orientação para a melhoria do desempenho de um sistema de gestão da qualidade. A nova estrutura das ISO 9000:2000 baseia se no PDCA já mencionado, na existência de um ciclo de qualidade, aproximando se muito da TQM, numa abordagem por processos na gestão da qualidade [7]. Recentemente a ISO publicou uma nova edição das normas ISO 9001, a ISO 9001:2008. Nesta nova revisão não foram introduzidos novos requisitos, apenas algumas alterações e principalmente clarificações do texto da norma, resultando numa transição fácil para aqueles que já têm um sistema de gestão de qualidade correctamente implementado e de acordo com a ISO 9001:2000. Estas normas do QMS permitem a certificação dos processos e da organização e não do produto ou serviço, não certificando a sua qualidade. Recentemente a ISO lançou a ISO 22000:2005, para a indústria alimentar, que cobre os princípios da ISO 9000 e do Hazard Analysis Critical Control 5

21 Introdução Point (HACCP), originando uma única norma integrada para esta indústria. Além disso, existem algumas normas que suportam a gestão da qualidade, descrevendo processos, como a ISO e ISO 15288, e outras que tratam da avaliação e melhoria, como a ISO Face à cada vez maior preocupação com a qualidade e a vasta oferta de programas e soluções, cada empresa ou local deve adequar o seu sistema de qualidade às suas próprias possibilidades e necessidades, passando muitas vezes pelo próprio design do modelo de qualidade a utilizar, que pode integrar diferentes partes das várias estratégias faladas. O objectivo deste trabalho, a proposta de um modelo de controlo de qualidade interno com base no HACCP, passa por isso mesmo. Pretende se iniciar um processo, tendo como base um sistema de gestão de qualidade, o HACCP, aproveitando se certas características de outros métodos, como o PDCA, cujos objectivos e fundamentos nunca devem ser esquecidos, assim como as suas ferramentas, como a esquematização, ou a preocupação da gestão por processos, retirada do método TQM. Com o HACCP, o planeamento tem de ser muito bem feito, avalia se todo o processo, todas as possíveis fontes e causas de erro, as suas medidas preventivas e correctivas e respectiva avaliação. A implementação futura de controlo, garantia e gestão de qualidade deve ser feita segundo esta abordagem, assim como melhorias após implementação. No fundo, trata se de evoluir o laboratório na qualidade da mesma forma que o próprio conceito foi evoluindo, como está representado na Figura 2, permitindo assim um maior grau de confiança, credibilidade e reconhecimento. 6

22 II. Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas

23 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas 1. Considerações Gerais O percurso dos laboratórios de diagnóstico de doenças humanas tem sido permanentemente alterado pelo rápido aparecimento e desenvolvimento da tecnologia molecular e pela sequenciação do genoma humano [8]. Poucas décadas passaram desde que Kan e Dozy reportaram o primeiro teste de DNA com uma enzima de restrição para testar anemia falsiforme [9], assinalando o nascimento da clínica genética e molecular moderna. O que começou como um pequeno conjunto de laboratórios académicos, que realizavam ensaios genéticos para doenças raras e muitas vezes debilitantes, tornou se essencial hoje em dia, levando a que as técnicas genéticas e moleculares entrassem em muitas áreas de diagnóstico e clínica. O mundo da biologia molecular está em constante mudança e desenvolvimento, em que cada novo e pequeno passo representa uma expansão do impacto e da utilidade que esta tecnologia pode ter na clínica, nos pacientes e familiares. Os testes genéticos desenvolveram se a meio da década de 80, em laboratórios que tentavam identificar genes relacionados com determinadas doenças. Nos últimos 15 anos, os testes genéticos passaram do nada para se tornarem parte principal de um laboratório de medicina [10]. Os ensaios genéticos de DNA ou RNA, para diagnóstico de doenças infecciosas, neoplásicas ou genéticas, têm sido amplamente utilizados devido ao recente e enorme progresso da biologia molecular e da biotecnologia e são essenciais para o tratamento e qualidade de vida do doente, providenciando um diagnóstico precoce e mais preciso [11]. Os dados sobre o número de testes genéticos que são realizados são escassos, mas sabe se que só no Reino Unido são feitos mais de testes por ano, o que indica que talvez sejam milhões em todo o mundo. A tendência é para que estes números aumentem, principalmente com o conhecimento da sequência genómica humana. Para além da sua utilização como método de diagnóstico ou de reconhecimento de uma mutação, os testes genéticos estão a expandir este papel mais tradicional para a previsão, prevenção e tratamento de doenças crónicas, ou seja, para determinar a susceptibilidade a determinadas patologias, como a diabetes, doenças cardíacas, cancro [12,13], infecções, e também para uma aplicação farmacogenómica [14], de modo a prever a resposta a um fármaco [8,10]. Esta expansão só foi possível através do conhecimento que o indivíduo pode ser mais ou menos susceptível a uma doença, dependendo da sua base genética. A combinação das variações genéticas e da exposição ambiental influencia a probabilidade de um indivíduo desenvolver determinada patologia [8], e é isso que cada vez mais se tenta determinar. Com a necessidade de usar estas poderosas novas tecnologias no mundo médico, pouca atenção se tem prestado aos critérios de qualidade. O grande desenvolvimento dos ensaios genéticos tornou mais visível a necessidade de regulamentação e padronização e nos últimos anos 8

24 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas começaram a surgir esforços para implementar e testar a qualidade dos resultados dos ensaios genéticos. Esta necessidade de certificação e qualidade é realçada pela alta expectativa que está aliada a esta tecnologia, compreensivelmente, sendo necessário manter um determinado grau de confiança nestas técnicas. Agências regulamentares como a Food and Drug Administration (FDA), a Secretaries Advisory Committee on Genetic Testing (SACGT) e a Clinical Laboratory Improvement Advisory Committee (CLIAC) discutem este assunto e principalmente as duas últimas agências têm deliberado sobre como os testes genéticos devem ser ordenados, realizados, comunicados e supervisionados nos Estados Unidos. Os ensaios genéticos são diferentes dos outros testes laboratoriais de diagnóstico em diversos aspectos, acentuando a necessidade de assegurar a qualidade dos resultados: A. A composição genética de um indivíduo não se altera com o tempo, os pacientes normalmente são testados uma só vez e um resultado incorrecto pode ficar para sempre como certo [8,10]; B. Os resultados de um teste genético podem resultar em consequências para outros membros da família [10]; C. As pessoas em geral têm um alto grau de confiança nos resultados genéticos e poucos questionam a sua validade [10]; D. No que se refere à avaliação de susceptibilidade, o teste é muitas vezes realizado em pessoas assintomáticas e os resultados podem ou não ser suportados por outros dados, como a história familiar [8]. Sendo assim, tudo o que se referiu contribui para a necessidade de estabelecimento de medidas de controlo de qualidade. Já foram mencionadas algumas definições de qualidade, seu controlo e garantia, mas dentro do universo dos laboratórios de técnicas genéticas, o controlo de qualidade pode ser definido como o controlo de um processo para garantir que os resultados tenham a qualidade exigida [15,16]. A aplicação do controlo de qualidade nos laboratórios foi introduzida por Levey e Jennings em 1950, como uma ferramenta para melhorar o desempenho de um laboratório [16,17]. Desde aí, os fundamentos práticos não sofreram grandes alterações, podendo se enumerar algumas modificações na frequência de análise de amostras controlo, no número de controlos e nas regras de aceitação ou rejeição de um teste, baseando se nos resultados dos controlos [16]. Face à importância que o conceito de controlo de qualidade tem hoje em dia, a garantia que é necessário dar e comprovar ao público alvo, os laboratórios procuram implementar esquemas de qualidade e todas as medidas recomendadas, que podem ser indiscutivelmente importantes, como a 9

25 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas inclusão de um controlo positivo e negativo em cada ensaio, ou de importância dúbia, como o registo diário da temperatura do frigorífico [18]. Independentemente dessa importância, um modelo de controlo de qualidade é concebido com todas essas ferramentas, para que se consiga o resultado considerado como certo. Pode se definir um resultado certo pela negativa, ou seja, não é um falso positivo ou um falso negativo. Um resultado certo deve ser sim reprodutível, independente do genótipo, principalmente na quantificação, relevante clinicamente e reembolsável [18]. É tendo em conta todos os conceitos e a importância relativa de cada um que se vai construindo um modelo de controlo de qualidade, passo por passo. Um programa de controlo de qualidade genérico de diagnóstico deve ser constituído por, pelo menos, três componentes essenciais: controlos, procedimentos e regras. Os controlos contêm um analito em concentração conhecida, usados para se conseguir precisão e reprodutibilidade. Os procedimentos referem se essencialmente ao número de vezes que os controlos devem ser testados e onde são colocados. As regras definem como os resultados dos controlos vão ser interpretados para aceitar, solucionar ou rejeitar um ensaio. Na grande maioria das vezes aplicam se aqui as regras de Westgard. No entanto, se os controlos forem fornecidos como parte de um kit, normalmente também são fornecidas sugestões ou requerimentos para o uso dos controlos [19]. Estes três pontos essenciais cobrem principalmente a fase analítica do processo, mas não o processo total, que se foi descobrindo ser essencial num programa de controlo e garantia de qualidade. Actualmente, a implementação de esquemas de controlo de qualidade e a padronização de protocolos nos laboratórios são cada vez mais necessários, englobando a preparação da amostra, laboratório, equipamento, amostras de referência, acreditação do laboratório, treino do pessoal e validação de protocolos. Além disso, os estudos de controlo de qualidade externo e estudos interlaboratoriais são essenciais [10,20]. É com o desenvolvimento de métodos de controlo de qualidade para os testes genéticos humanos que vai continuar o crescimento destas técnicas e a sua integração na prática clínica [8]. Já se têm desenvolvido determinadas guidelines e surgem cada vez mais propostas e recomendações, como é o caso das desenvolvidas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), agora conhecido por Clinical and Laboratory Standards Institute, pelo American College of Medical Genetics (ACMG), pelo Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA) ou pelo College of American Pathologists (CAP), em que alguns surgiram como resposta às deliberações do SACGT e estabeleceram relações de trabalho com a FDA através de discussões com a FDA Professional Organization Roundtable, com o objectivo de desenvolver um plano prático de supervisionamento [8,21 25]. O CLIA define muitos dos sistemas básicos de qualidade que um laboratório requer mas faltam lhe guidelines específicas para ensaios genéticos e moleculares. No entanto há pelo menos 10

26 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas três guidelines com este objectivo que podem ser aplicadas a muitas áreas dos testes moleculares, independentemente do campo de estudo [26]. O ACMG contém guidelines que remetem para a citogenética, genética bioquímica e genética molecular. Para além disso, desenvolveu guidelines específicas para determinadas doenças, que remetem para problemas específicos que aparecem frequentemente em ensaios mais complexos. Todas estas guidelines conseguem cobrir as regras de boas práticas num laboratório, validação de ensaios e assuntos técnicos específicos para métodos ou doenças [26]. O CAP é a organização por excelência para acreditação dos laboratórios [26]. Uma outra organização, a Clinical and Laboratory Standards Institute utiliza peritos em determinados campos para desenvolver guidelines para diagnósticos moleculares, incluindo testes de genética molecular, hematopatologia molecular, sequenciação de DNA, diagnóstico por microarray e testes de proficiência [26]. Falando mais especificamente da área de oncologia, destaca se uma organização, a American Society of Clinical Oncology (ASCO), que representa os especialistas da área envolvidos nos cuidados dos pacientes e pesquisa clínica. Esta organização reconheceu a necessidade de recomendações específicas para esta área, principalmente na pesquisa de predisposição genética para cancro e medicina preventiva. Os testes genéticos envolvidos têm de sofrer um controlo apertado, para garantir resultados de qualidade elevada. Segundo eles, existem elementos críticos que têm de ser controlados, tem de existir supervisão dos reagentes, ensaios, pessoal que realiza os ensaios, controlo de qualidade e um formato padrão de comunicação dos resultados. Além disso, defendem a participação dos laboratórios em programas de controlo externo e de acreditação, como os do CAP e ACMG [27]. Em todas as organizações se assume que os programas de controlo interno e externo são estabelecidos para garantir que os laboratórios consigam produzir e reproduzir resultados de alta qualidade. Os testes de proficiência ou controlo externo identificam fraquezas e funcionam como um guia para o desenvolvimento [24]. No entanto, um programa de QA engloba mais do que um controlo interno e externo. Os programas podem variar entre laboratórios mas em geral compreendem um manual de garantia de qualidade, os objectivos do programa, a qualidade dos recursos, os procedimentos padronizados (SOP, Standard Operating Procedures), controlo de qualidade interno e externo [28]. É o conjunto de todas estas acções e de todos os dados que vai conseguir minimizar os erros e garantir uma maior confiança nos resultados dos testes do laboratório. Apesar do imenso crescimento que a área tem sofrido e do estabelecimento de todas estas organizações, ainda existem muitos problemas no controlo e garantia de qualidade das técnicas genéticas. Entre os factores que mais impedem o desenvolvimento de programas que assegurem e avaliem a qualidade, foi eleito como um dos mais preponderantes, no controlo interno e externo, a 11

27 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas falta de amostras positivas ou amostras com mutações bem definidas associadas com doenças de saúde pública. Além disso, a falta de métodos padronizados e os diferentes métodos analíticos de cada laboratório também complicam a criação de um modelo de controlo de qualidade global, principalmente de controlo externo [8]. 12

28 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas 2. Controlo de Qualidade Interno de Técnicas de Amplificação de Ácidos Nucleicos PCR O controlo de qualidade tem um papel cada vez mais importante na implementação das técnicas de amplificação de ácidos nucleicos (TAN) no diagnóstico. Nos últimos 10 anos estas técnicas revolucionaram a medicina, mas para serem aceites têm de demonstrar continuamente a sua precisão, fiabilidade e relevância clínica para o paciente. Sendo assim, os responsáveis do laboratório e os fabricantes de reagentes e kits de diagnóstico têm de estabelecer e implementar sistemas efectivos de controlo de qualidade [18]. Nos primeiros anos de utilização destas técnicas a percentagem de resultados errados era muito superior, demonstrando a importância e a diferença que a automatização e o controlo de qualidade podem fazer [18]. Um controlo de qualidade optimizado vai permitir a redução de erros e da comunicação de resultados errados, a comunicação de bons resultados de modo mais rápido e seguro e a poupança de dinheiro pela prevenção do aparecimento de erros e por se implementar apenas o controlo necessário e não o excedente [19]. A avaliação da qualidade pode ser interna ou externa e, recentemente, foram introduzidos alguns programas de avaliação externa para as técnicas genéticas, mas uma menor atenção tem sido prestada à avaliação interna [29]. Uma definição de controlo interno foi estabelecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS), através do departamento de External Assessment of Health Laboratories, como sendo um conjunto de procedimentos realizados pelos colaboradores do laboratório para avaliar o trabalho e os seus resultados, de modo a decidir se são suficientemente fiáveis ou não para serem comunicados [30]. Assim, os procedimentos que se vão executar têm um efeito imediato na actividade do laboratório, com o dever de controlar e não apenas de examinar os resultados [30]. Alguns autores, tendo em conta a necessidade deste género de controlo, já começaram a investir um pouco mais nesta área. Um exemplo é o grupo de trabalho de Bladbjerg et al. (2002), que apresentou um exemplo de esquema de controlo de qualidade interno para análise de polimorfismos através da reacção de polimerização em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction), que pode ser visto na Tabela 1. 13

29 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas Tabela 1 Princípios de controlo de qualidade interno para métodos de genotipagem baseados em PCR (adaptado de [29]). Fase Processo Passos para assegurar qualidade Variação pré analítica Manuseamento da amostra Quantificação do DNA Isolamento do DNA Cálculo do ratio DNA/proteína Teste de DNAses Diluição das amostras para concentração de DNA semelhante Utilização de tubos e pontas livres de DNAse/RNAse Variação analítica Amplificação do DNA (PCR) Inclusão de amostras com genótipo conhecido Digestão com enzima de restrição Inclusão de branco de reagentes Separação de fragmentos por electroforese Inclusão de marcador de pares de bases Confirmação de resultados Em populações: reanálise de 5 10% Em pacientes: reanálise de portadores do alelo da doença e de 5 10% de não portadores Reanálise com método diferente, se possível Associação com outra variação Se discordam mais de 5% dos resultados, reanalisar toda a série Variação pós analítica Leitura dos resultados Duas leituras independentes Entrada na base de dados Dupla entrada na base de dados A maior parte das técnicas moleculares, senão todas, usa a técnica de PCR. A obtenção rápida de resultados, o bom limite de detecção, selectividade, especificidade, sensibilidade e potencial para automatização compõem as suas principais vantagens [31] e fazem com que esta técnica seja utilizada em laboratórios de todo o Mundo, com diversas finalidades. Cada vez mais protocolos específicos e automatizados para determinado diagnóstico estão a ser criados. São exemplos os protocolos para o RNA do vírus de hepatite C (HCV, Hepatitis C Virus) [11] e para a infecção meningocócica [20]. A importância desta técnica para o diagnóstico da infecção viral ou da infecção bacteriana é muito grande, principalmente quando se trata do rastreio de doenças potencialmente transmissíveis por transfusão. Na década de 90 essa importância foi descoberta e assim, em 1995, no Reino Unido, o Standardization of Gene Amplification Techniques (SoGAT), foi estabelecido no National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). O SoGAT é um grupo de discussão, o único fórum internacional para troca de informação de aspectos científicos da técnica de PCR, com o intuito de promover a padronização de reagentes, da amplificação e validação, 14

30 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas ajudando na definição de protocolos como o do HCV [32]. Face a isto, é notória a importância do PCR e, por isso mesmo, os seus aspectos técnicos e principais cuidados devem constituir a primeira camada de um projecto completo de QA [20]. No entanto, apesar das grandes vantagens da PCR relativamente a outros métodos, alguns problemas têm sido discutidos. A novidade tecnológica, o investimento económico e a falta de SOP têm sido as desvantagens mais apontadas [31]. A falta de padronização é sem dúvida o problema que mais preocupa os laboratórios e tal deve se à complexidade dos métodos moleculares. As técnicas de amplificação são baseadas em reacções enzimáticas cíclicas muito sensíveis a qualquer contaminação, gerando facilmente falsos positivos. A técnica de PCR é particularmente sensível às inúmeras variáveis, previsíveis ou não, que podem influenciar negativamente a amplificação [33]. Além disso, tal como todos os testes de biologia molecular, é tecnologicamente mais exigente e exige maior experiência do que a maioria dos testes convencionais [34]. Na Tabela 2 estão resumidas as principais operações efectuadas numa amplificação e alguns dos potenciais problemas que podem aparecer. A maior parte destes aspectos negativos refere se a protocolos de amplificação inapropriados, má preparação ou quantificação dos ácidos nucleicos alvo, baixa recuperação, presença de inibidores, uso de reagentes ou termocicladores ineficientes e má interpretação dos resultados [33]. A importância destes pontos é visível em certos estudos como o de Grundmann et al. (1997), que concluíram que utilizando reagentes padrão, de qualidade controlada, protocolos de extracção de DNA e condições de amplificação padronizadas, é possível ultrapassar os problemas de reprodutibilidade em diferentes laboratórios [35]. 15

31 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas Tabela 2 Operações realizadas em técnicas de ácidos nucleicos e potenciais fontes de erro (adaptado de [19]). Extracção/Isolamento do ácido nucleico RNA ou DNA degradado Introdução de inibidores ou contaminantes Extracção incompleta, erro de amostragem Ligação do analito a um anticorpo ou coluna Transformação (ex: RNA a cdna) Erros de transcrição Falha da enzima Amplificação Insensibilidade Não especificidade Inibição Contaminação Degradação enzimática Detecção Inespecificidade Falha da enzima Falha de calibração Uma técnica de amplificação por si só apresenta, então, inúmeras variáveis que necessitam de ser controladas. As principais preocupações concentram se normalmente nos falsos positivos e nos falsos negativos. Os falsos positivos são conhecidos desde os anos 90, constituindo uma das mais graves preocupações, e devem se principalmente à contaminação por produtos que foram anteriormente amplificados [18,36,37]. Embora seja um problema que possa estar presente em diversos ensaios, neste caso assume um carácter especial, devido à extrema sensibilidade destas técnicas que, teoricamente, são capazes de detectar um único microorganismo, por exemplo, numa amostra de um paciente. As primeiras recomendações para redução do risco de contaminação foram descritas por Kwok e Higuchi (1989), que defenderam a importância de um protocolo bem delineado como instrumento para evitar um mau desfecho da experiência [38]. Hoje em dia, essas recomendações continuam actuais, foram incorporadas em programas de controlo de qualidade e melhoradas com a introdução de novas medidas, como os sistemas de controlo de contaminação enzimáticos ou sistemas automatizados [18], como se pode ver na Tabela 3. 16

32 Controlo de Qualidade de Técnicas Genéticas Tabela 3 Falsos positivos controlo e melhorias (adaptado de [18]). Controlo de contaminação (Kwok e Higuchi, 1989) Separação física de pré e pós PCR Material próprio de cada área (micropipetas, pontas, centrífugas, tubos, luvas, batas, canetas, pessoal) Reagentes em alíquotas Manuseamento semi estéril Controlos positivos (pequeno número, baixa concentração) Controlos negativos (em maior número) Melhorias recentes Pontas resistentes a aerossóis Semi automatização Uracil N glicosilase Sistema fechado (Real Time PCR) Automatização completa (processamento da amostra + amplificação + detecção) Para ultrapassar os falsos positivos e garantir a integridade de um resultado positivo, foram formuladas algumas regras (A F): A. Um teste de PCR deve ser realizado, pelo menos, em três áreas diferentes: uma de preparação dos reagentes, uma de preparação da amostra e uma terceira de amplificação e consequente detecção [34,39]. Embora os cuidados básicos e essenciais dos pontos B F não variem de autor para autor, existem diferentes opiniões quanto à divisão de espaço. Por exemplo, a Farmacopeia Europeia estabelece guidelines para a técnica de PCR, aconselhando a sub divisão em quatro áreas: área de master mix, pré PCR, amplificação e detecção pós PCR [40]; Neumaier et al. (1998) concordam também com esta divisão em quatro compartimentos ou espaços: preparação e armazenamento de reagentes onde se recebem, se dividem em alíquotas e se preparam reagentes e master mix, preparação da amostra, amplificação e, por último, análise dos produtos de PCR [41], espaços que vão de encontro aos designados pela Farmacopeia Europeia; B. Estes espaços não devem ser adjacentes, mas sim em diferentes pisos ou edifícios e o sentido de trabalho deve ser unidireccional [34,39 42]; C. A organização do laboratório é essencial para evitar a contaminação. Cada zona deve ter batas, luvas e material próprio, não havendo trocas entre áreas. Os reagentes devem ser armazenados em alíquotas, ou seja, guardados em pequenos volumes para diminuir a contaminação, e as bancadas devem ser descontaminadas através da utilização de radiação 17