BIOFILMES MULTIESPÉCIES POR

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1 BIOFILMES MULTIESPÉCIES POR Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes E Escherichia coli EM POLIETILENO E EFEITOS DE PROCEDIMENTOS DE HIGIENIZAÇÃO S.S. Gehlen 1, B. Webber 1, N.S.M. Aquino 2, L. Daroit 3, L.B. Rodrigues 2, V.P. do Nascimento 1 1- Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Centro de Diagnóstico e Pesquisa em Patologia Aviária - CEP: Porto Alegre - RS - Brasil, Telefone: (51) (brunahw@hotmail.com). 2- Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos - Universidade de Passo Fundo, Centro de Pesquisa em Alimentos - CEP: Passo Fundo - RS - Brasil, Telefone: (54) Ramal: (laurab@upf.br). 3- Instituto de Ciência Exatas e Geociências Universidade de Passo Fundo - CEP: Passo Fundo - RS Brasil, Telefone: (54) (ludaroit@upf.br). RESUMO A carne de frango pode servir de veículo para inúmeros microrganismos como Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, entre outros, potencialmente capazes de desencadear doenças transmitidas por alimentos. Estes microrganismos podem formar biofilmes em superfícies de processamento de alimento, agindo como pontos de contaminação constantes. Avaliou-se a capacidade destas 4 bactérias formarem biofilme em polietileno e os efeitos de procedimentos de higienização. Os microrganismos foram incubados a 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC por 24 horas para adesão ao polietileno. A higienização foi realizada pelo uso de água estéril a 85ºC, hipoclorito de sódio 2% e peróxido de hidrogênio 0,3%. S. Enteritidis, E. coli e L. monocytogenes aderiram ao polietileno em todas as temperaturas, ressaltando as temperaturas de refrigeração. Hipoclorito de sódio 2% e a água aquecida a 85ºC tiveram ação eficaz semelhante e o peróxido de hidrogênio a 0,3% não foi eficaz diante de biofilmes multiespécies. ABSTRACT The poultry meat serve as a vehicle for numerous microorganisms such as Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, among others, potentially cause of foodborne illness. These microorganisms can form biofilms on food processing surfaces, act as points of constant contamination. In this study, we evaluated the ability of these four bacteria form biofilms on polyethylene and effects of hygiene procedures. The microorganisms were incubated in polyethylene surface at 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC and 3±1ºC for 24 hours for or adhesion to polyethylene. The hygiene procedures was performed by the use of sterile water at 85 C, sodium hypochlorite 2% and hydrogen peroxide 0.3%. S. Enteritidis, E. coli and L. monocytogenes adhered to the polyethylene at all temperatures, emphasizing refrigeration temperature. Sodium hypochlorite 2% and water heated to 85 C had a similar action and hydrogen peroxide 0.3% was not effective against multispecies biofilms. PALAVRAS-CHAVE: biofilmes multiespécies; polietileno; procedimentos de higienização. KEYWORDS: multispecies biofilms; polyethylene; hygiene procedures.

2 1. INTRODUÇÃO As bactérias são encontradas na natureza e em diversos ambientes na forma de biofilmes multiespécies (Elias e Banin, 2012). O termo biofilme refere-se aos microrganismos aderidos a uma superfície biótica ou abiótica e, uma vez constituído, age como ponto de contaminação constante, liberando fragmentos ou células, o que pode comprometer a qualidade microbiológica dos alimentos (Azevedo e Cerca, 2012; Costerton et al., 1995; Fuster-Valls et al., 2008). A carne de frango pode servir de veículo para inúmeros microrganismos patogênicos como Salmonella Enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli e Listeria monocytogenes, entre outros (Brasil, 2015; WHO, 2015). Segundo a Organização Mundial da Saúde, Campylobacter jejuni, seguido de bactérias do gênero Salmonella e Escherichia coli são considerados os microrganismos mais envolvidos em doenças diarreicas transmitidas por alimentos no mundo, e Listeria monocytogenes está entre as principais doenças invasivas transmitidas por alimentos (WHO, 2015). Estas bactérias de caráter patogênico são capazes de aderir e formar biofilmes na maioria dos materiais e condições ambientais encontradas na de produção de alimentos, como em superfície de polietileno, componente das placas de corte de matadouros-frigoríficos (Bridier et al., 2015; Giaouris, 2015; Rodrigues, 2009). Sabe-se que microrganismos, em condições de biofilmes, são mais resistentes à ação de procedimentos de higienização comumente realizados na indústria de carnes, que consistem fundamentalmente no uso de água quente, detergentes e sanitizantes (Andrade, 2008; Costerton et al., 1995). Quando associados em biofilmes de espécies mistas, microrganismos poderão ter interações de cooperação que beneficiam seu crescimento e aumentam sua capacidade de sobrevivência no ambiente (Andrade, 2008; Costerton, Stewart, e Greenberg, 1999; Giaouris et al., 2015). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a formação de biofilme na superfície de polietileno por Salmonella Enteritidis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes e Campylobacter jejuni, previamente isolados de fontes avícolas, nas temperaturas de refrigeração (3 C e 9ºC), ambiente (25ºC), ótima para mesófilas (36ºC) e de termotolerância e ótima para C. jejuni (42ºC) em um intervalo de 24 horas. Além disso, foi avaliada a ação de tratamentos de higienização diante destes biofilmes multiespécies envolvendo o uso de água aquecida a 85 C, e dos sanitizantes químicos hipoclorito de sódio 2% e peróxido de hidrogênio 0,3%. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Para o ensaio de formação de biofilmes multiespécies e tratamentos de higienização, foram analisadas uma amostra de Salmonella Enteritidis (SE24), previamente isoladas de surto de DTA com alimentos de origem avícola, uma amostra de Escherichia coli (C7) e uma de Listeria monocytogenes (L4), previamente isoladas de superfícies de matadouro-frigorífico de aves, e uma amostra de Campylobacter jejuni (CJ134), previamente isolada de carcaças resfriadas após imersão em chiller. Para a formação dos biofilmes, corpos de prova de polietileno, com área de 1 cm 2, foram cultivados em microplacas estéreis de poliestireno de 12 poços. Foi adicionado 2,75 ml de caldo triptona de soja sem glicose e culturas individuais de cada microrganismo com concentração final de 250 UFC/mL em 250 µl de caldo, finalizando um volume teste de 3 ml. As microplacas foram incubadas a 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC, simulando as temperaturas do ambiente de processamento da carne de frango e de crescimento bacteriano, nos tempos de 4, 12 e 24 horas. Todos os ensaios foram realizados com três repetições. Em cada intervalo de tempo, os cupons de polietileno foram retirados dos meios de cultivo e enxaguados em 5 ml de água peptonada 0,1%, por 30 segundos, para a remoção de células planctônicas. Em seguida, os cupons foram introduzidos em tubos contendo 5 ml de agua peptonada 0,1%, e sonicados por 10 minutos em banho de ultrassom (frequência de 40 khz e potência de 81 W) para desadesão de células sésseis (Scherba, Eigel e O Brien, 1991). Para quantificação dos biofilmes, diluições seriadas foram transferidas para placas de Petri contendo meios de cultura seletivos, sendo Modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar mccda, suplementado para contagem de C.

3 jejuni; Eosin Methylene Blue Agar EMB, para contagem de E. coli; Xylose Lysine Desoxycholate Agar XLD, para contagem de S. Enteritidis; e Agar Listeria Palcam suplementado, para contagem de L. monocytogenes. O método de plaqueamento utilizado foi a contagem em gota ou drop-plate, com leitura após 24 horas de incubação a 36ºC ±1ºC (Miles e Misra, 1938). As placas de mccda foram incubadas sob condições de microaerofilia (Microaerobac - Probac ; 5 a 15% O 2, 10% CO 2), sob temperatura de 42 C durante 56 horas de incubação. Em seguida, foram realizados os tratamentos de higienização dos cupons de polietileno, que permaneciam por 3 minutos em água estéril aquecida a 85ºC, e 10 minutos nas soluções de hipoclorito de sódio 2% e peróxido de hidrogênio 0,3%. Depois de tratados e enxaguados com solução neutralizante, os cupons foram introduzidos em tubos contendo 5 ml de agua peptonada 0,1% e sonicados por 10 minutos em banho de ultrassom. A quantificação das células sésseis que não foram removidas pelos tratamentos de higienização foi realizada em meios de cultura seletivos pelo método de plaqueamento em gota, conforme já especificado anteriormente. Os resultados obtidos foram analisados por meio da análise de variância. A comparação das médias foi realizada com o teste Tukey a 5% de probabilidade. A análise estatística foi feita utilizando o software ASSISTAT versão 7.7 beta. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO As cepas de Salmonella Enteritidis (SE24), Escherichia coli (C7) e Listeria monocytogenes (L4) tiveram a capacidade de formar biofilmes multiespécies na superfície de polietileno, nas diferentes condições ambientais testadas, conforme a Figura 1. Figura 1. Formação total de biofilmes multiespécies por S. Enteritidis (SE24), E. coli (C7) e L. monocytogenes em polietileno sob diferentes temperaturas e procedimentos de higienização no decorrer de 24 horas. O microrganismo Campylobacter jejuni não pôde ser quantificado. Alguns pesquisadores alegam que métodos de quantificação de biofilmes através de cultivo padrão podem não ser eficientes em microrganismos de crescimento fastidioso (Manuzon e Wang, 2007). Além disso, C. jejuni, diante de condições extremas, como altas concentrações de oxigênio, carência de nutrientes e flutuações da temperatura e ph, passa para um estado viável mas não-cultivável (VBNC). Neste estado,

4 apresentam morfologia cocoide, e não é possível cultivá-lo em meios de cultivo tradicionais, porém, continuam apresentando atividade metabólica (Sung e Khan, 2015; Magajna e Schraft, 2015). De acordo com Ronner e Wong (1993), para caracterizar a formação de biofilme são necessários um número mínimo 10 3 UFC aderidas por cm 2 (3 log 10.UFC.cm -2 ). Em nosso estudo, a média de formação de biofilmes multiespécies correspondeu a 4,673 log 10.UFC.cm -2 considerando a média entre as temperaturas avaliadas, conforme Figura 2. As amostras SE24 e a C7 tiveram adesão ao polietileno estatisticamente semelhante em relação à média entre todas as temperaturas testadas (P=0,968). Polímeros, como o polietileno das placas de corte, são amplamente utilizados na indústria devido ao seu baixo custo, a sua resistência a oxidação e atoxicidade (Andrade, 2008). Contudo, este material é composto de mais porosidades e microfissuras quando comparados com materiais metálicos, como o aço inoxidável, o que proporciona maior adesão de microrganismos e dificulta a ação dos agentes desinfetantes (Holah e Thorpe, 1990; Giaouris, 2015; Steenackers et al., 2012; Stepanovic et al., 2004). Neste experimento, obtivemos formação de biofilmes multiespécies em todas as temperaturas avaliadas (Figura 1). Apesar de L. monocytogenes ter característica de se multiplicar em baixas temperaturas, esta cepa aderiu apenas a 9 C, enquanto que E. coli e S. Enteritidis aderiram nas superfícies testadas a 3 C e 9 C. Até então, estas temperaturas de refrigeração não foram descritas como propícias para o desenvolvimento de biofilmes multiespécies por estes microrganismos, o que torna este estudo de grande relevância, pois denota a possibilidade destes microrganismos se manterem viáveis em biofilmes sob baixa temperatura. O desenvolvimento de biofilmes em temperaturas de refrigeração deve ser investigado, já que é considerado um ponto crítico durante a produção e conservação de alimentos (Lima et al., 2004). Ademais, L. monocytogenes, E. coli e S. Enteritidis foram capazes de aderir nas temperaturas de 25 C, 36 C e 42 C, o que também é um problema, pois revelam que biofilmes também são formados nas temperaturas ótimas de crescimento bacteriano para mesófilos (36 C), temperatura de termotolerância e ótima para C. jejuni (42 C) e em temperatura ambiente (25 C). A eficácia do procedimento de higienização de equipamentos ou superfícies é medida pela quantidade de microrganismos viáveis aderidos após essa operação (Vialta, Moreno e Valle, 2002). Contudo, legislações brasileiras não definem parâmetros microbiológicos para superfícies de equipamentos e utensílios usados no processamento de alimentos. Por isso, legislações internacionais são tidas como base para manter condições higiênico-sanitárias adequadas, no caso de exportações. Conforme a Pan American Health Organization (PAHO/WHO), recomenda-se contagens de até 1,7 log 10UFC/cm 2 (50 UFC/cm²) ou 2 log 10UFC/utensílio (100 UFC/cm²) para mesófilos aeróbios, e ausência de coliformes termotolerantes, principalmente devido às temperaturas ambientes nestes países (PAHO, 2001). A Diretiva 471/2001 da UE, recomenda como nível aceitável contagens de até no máximo 10 UFC.cm -2 de células totais viáveis e 1 UFC.cm -2 de enterobatérias. Os estabelecimentos certificados à exportação para a União Europeia devem atender a esta diretiva (União Europeia, 2001). A American Public Health Association recomenda que, após a ação de sanitizantes físicos ou químicos, as superfícies de utensílios e equipamentos devem possuir menos de 0.3 log 10UFC/cm² (2 UFC/cm²) de microrganismos para que as estas superfícies sejam consideradas higienizadas (APHA, 2014). O sanitizante hipoclorito de sódio a 2% e a água quente a 85 C foram os mais eficazes na remoção das células aderidas na superfície de polietileno, reduzindo 3,85 log 10.UFC.cm -2 e 3,911 log 10.UFC.cm -2, respectivamente, sem diferenças estatísticas entre os tratamentos. Os resultados deste experimento estão de acordo com os padrões exigidos pela PAHO/WHO, com exceção do peróxido de hidrogênio (2,718 log 10.UFC.cm -2 ). Já de acordo com a Diretiva 471/2001 da União Europeia e aos parâmetros estabelecidos pela APHA (2014), houve remanescências bacterianas na superfície de polietileno acima do recomendado, de acordo com a Figura 2.

5 Figura 2. Formação de biofilmes multiespécies e efeitos dos procedimentos de sanitização. a) Somatório total da formação e remoção dos biofilmes multiespécies formado por S. Enteritidis (SE24) L. monocytogenes (L4), E. coli (C7) em polietileno; b) Média de formação e remoção dos biofilmes multiespécies por microrganismo. Durante as últimas décadas, a persistência de patógenos bacterianos em ambientes de processamento de carne tem-se tornado cada vez mais evidente (Giaouris, 2015). Entender a dinâmica de adesão interespécie no ambiente industrial e os efeitos de procedimentos de higienização pode contribuir para o desenvolvimento de formas de remoção de biofilmes mais eficazes. 4. CONCLUSÃO Um dos pontos mais relevantes deste estudo diz respeito à realidade na indústria avícola quanto à formação de biofilmes multiespécies por microrganismos de caráter patogênico, e a preocupante dificuldade de eliminação destes biofilmes por procedimentos rotineiros de sanitização. Nossos resultados confirmam que o polietileno, componente de placas de corte, propicia a aderência de biofilmes multiespécies sob todas as temperaturas analisadas. Ressalta-se a capacidade de formação em temperaturas de refrigeração, pois nas salas de cortes as placas de polietileno são mantidas em baixas temperaturas, possibilitando crescimento microbiano e contaminação cruzada. O hipoclorito de sódio 2% e a água aquecida a 85 C foram os melhores tratamentos para esta superfície. O peróxido de hidrogênio 0,3% não foi eficaz diante dos biofilmes multiespécies. 5. AGRADECIMENTOS Os autores gostariam de agradecer ao CNPq pelo suporte financeiro para condução deste estudo, e também a CAPES/FAPERGS/UFRGS pela bolsa de estudos. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Andrade, N.J. (2008). Higiene na indústria de alimentos: avaliação e controle de adesão e formação de biofilmes bacterianos (1 ed.). São Paulo: Varela. APHA. American Public Health Association (2014). Disponível em: Azevedo, N.F. e Cerca, N. (2012). Biofilmes: na Saúde, no Ambiente, na Indústria (1. ed.). Portugal: Publindústria Edições Técnicas. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde SVS. (2015). Doenças Transmitidas por Alimentos período de 2000 a Disponível em: Bridier, A., Sanchez-Vizuete, P., Guilbaud, M., Piardb, J.C., Naïtalib, M. e Briandetb, R. (2015). Biofilm-associated persistence of food-borne pathogens. Food Microbiol., (45),

6 Costerton, J. W., Lewandowaki, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., e Lappin-Scott, H. M. (1995). Microbial biofilmes. Annual Review of Microbiology, (49), Costerton, J.W., Stewart, P.S. e Greenberg, E.P. (1999). Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science, 284 (5418), Elias, S. e Banin, E. (2012). Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiology Reviews, 36 (5), Fuster-Valls, N., Hernández-Herrero, M., Marín-de-Mateo, M. e Rodríguez-Jerez, J. J. (2008). Effect of different environmental conditions on the bacteria survival on stainless steel surfaces. Food Control. (19), Giaouris, G. (2015). In: Biofilms in the Food Environment (2. ed.). Chichester: John Wiley e Sons. Holah, J.T.; Thorpe, R.H. (1990). Cleanability in relation to bacterial retention on unused abraded domestic sink materials. Journal of Applied Microbiology, 69 (4), Lima, E.S.C., Pinto, P. S. A., Santos, J.L., Vanetti, M. C. D., Bevilacqua, P. D., Almeida, L. P., Pinto M. S. e Dias, F.S. (2004). Isolation of Salmonella and Staphylococcus aureus at swine slaughtering as subsidy for HACCP, the Hazard analisys and critical control point system. Pesquisa Veterinária Brasileira, 24, Magajna, B.A., Schraft, H. (2015) Campylobacter jejuni biofilm cells become viable but nonculturable (VBNC) in low nutrient conditions at 4 C more quickly than their planktonic counterparts. Food Control, (50), Manuzon, M.Y. e Wang, H.H. (2007). Biofilms in the Food Environment (1. ed.). Oxford: Blackwell Publishing Ltd. Milles, A. A. L. e Misra, S. S. (1938). The estimation of the bacterial power of the blood. Journal of Hygiene, (38), PAHO. Pan American Health Association (2001). Disponível em: Ronner, A. B., e Wong A. C. L. (1993). Biofilm development and sanitizer inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella Typhimurium on stainless steel and buna-n rubber. Journal of Food Protection. (56), Scherba, G., Eigel R. M. e O Brien W. D. (1991). Quantitative assessment of the germicidal efficacy of ultrasonic energy. Applied and Enviromental Microbiology. 57 (7), Steenackers, H., Hermans, K. e Vanderleyden, J. (2012). Salmonella biofilms: An overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Res. Intern., 45 (2), Stepanovic, S.; Irkovic, I.C.; Ranin L, Svabic-Vlahovic M. (2004). Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. (38), Sung, K. e Khan, S. (2015). In: Biofilms in the Food Environment. (2. Ed.). Chichester: John Wiley e Sons, Ltd. União Européia. Regras para os controles regulares à higiene geral dos estabelecimentos. (Diretiva 2001/471/CE). Comissão da Comunidades Européias. Vialta, A., Moreno, I. e Valle, J. L. E. (2002). Boas Práticas de Fabricação, Higienização e Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle na Indústria de Laticínios: 1-Requeijão. Indústria de Laticínios, (37), WHO. World Health Organization. (2015). WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group Disponível em: