APLICAÇÃO DE SOLUÇÃO DETERGENTE DE ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon flexuosus EM BIOFILME MISTO

Transcrição

1 APLICAÇÃO DE SOLUÇÃO DETERGENTE DE ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon flexuosus EM BIOFILME MISTO Vanessa SCHUH 1 ; Taciara A. PENNO 2, Janaina SCHUH 2, Sheila Mello da SILVEIRA 2 ; Alessandra Farias MILLEZI 3. 1 Graduanda do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC, Bolsista CNPq; 2 Graduandas do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 3 Co orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 4 Orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC Introdução Os biofilmes são formados por bactérias que se aderem às superfícies, e que são envolvidos por uma camada de partículas de matéria orgânica, formando depósitos, nos quais os microrganismos estão fortemente aderidos a uma superfície através de uma matriz de polissacarídeos (CRIADO et al., 1994). Os biofilmes contêm, além de microrganismos, partículas de proteínas, lipídios, fosfolipídios, carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam depósitos onde os microrganismos continuam a crescer, resultando em uma associação com outros microrganismos (CHZECHOWSKI, 1990; MACÊDO, 2000). Dentre as bactérias patogênicas associadas à formação de biofilmes, citam-se Staphylococcus aureus e Pseudomonas aerugionosa, dentre outras (DOYLE, 1992; PARIZZI et al., 2004). No processo de adesão e formação de biofilmes nas superfícies de equipamentos e utensílios na indústria de alimentos, a liberação desses micro-organismos poderá trazer consequências indesejáveis que podem afetar qualidade do alimento produzido, como alteração deste e veiculação de patógenos (ANDRADE, 2008). Os óleos essenciais (OEs) são originados do metabolismo secundário das plantas e possuem composição química complexa, destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanóides (SIANI et al., 2000). Por isso, os óleos essenciais são considerados fontes em potencial de substâncias biologicamente ativas, contra microrganismos (KELSEY et al., 1984), sendo uma nova alternativa para a indústria de alimentos (ULTEE et al., 1999). Por meio desse viés, o objetivo deste trabalho foi pesquisar a ação da solução de detergente elaborada com óleo essencial de Cymbopogon flexuosus para minimizar o crescimento de biofilme misto.

2 Materiais e Métodos As análises foram conduzidas no mês de abril de 2016, no laboratório de Microbiologia de Alimentos localizado no Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, SC. A ação detergente foi testada para as bactérias Staphylococcus aureus ATCC e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, em co-cultivo. A formação do biofilme foi realizada com base na curva de padronização de cada bactéria (aproximadamente 10 8 CFU/mL), e após foram inoculados em microplacas e incubados em shaker orbital (Tecnal, Brasil) a 37 ºC, agitação de 80 rpm, contendo os tratamentos com a solução detergente na concentração de 0,78% de Cymbopogon flexuosus e o controle positivo contendo apenas a suspensão bacteriana em meio TSB a 2x10 8 UFC/mL (MILLEZI et al., 2012). Após 24 horas, a biomassa dos biofilmes foi quantificada pela análise de Cristal Violeta (CV), de acordo com STEPANOVIC et al., (2000). As células aderidas foram fixadas com metanol 99% (15 min), coradas com cristal violeta (5 min), lavadas em água e, por último, foi adicionado ácido acético 33% para leitura a 630 nm em espectofotômetro Elisa (Biotek, USA). Para quantificação das células viáveis (UFC), estas foram submetidas por 6 minutos ao banho ultrasson (Unique, Brasil). Procedeu-se à diluição seriada das amostras e plaqueamento em superfície de Ágar Triptona de Soja TSA, utilizando a técnica de microgota. Após 24 horas de incubação realizou-se a contagem das células viáveis em biofilmes. Para a análise da atividade metabólica, utilizou-se a solução de MTT conforme descrito na metodologia adaptada de Freimoser et al. (1999). Após 24 horas o conteúdo da microplaca foi descartado e inseriu-se 200 µl de solução MTT em cada poço. A placa foi incubada no escuro por 2 h e 30 min a 36 o C. Em seguida o conteúdo da microplaca foi descartado e foram aplicados 200 µl de DMSO por 15 min. Por fim, realizou-se a leitura em espectrofotômetro Elisa a 630 nanômetros. Os resultados foram tratados com análise estatística, onde foi utilizado ANOVA (Bonferroni), considerando significativo P<0,001. Os dados foram analisados usando o software Prisma (GrafPad Software).

3 Resultados e Discussão Conforme a Figura 1, a Pseudomonas aerugionosa apresentou maior crescimento de células viáveis em biofilme. Houve redução significativa (P<0,05) das células de Staphylococcus aureus, ao aplicar a solução detergente houve redução de 4,37 log10 UFC.cm -2, quando comparado ao controle. Quanto à produção de biomassa, ao utilizar a solução de detergente de óleo essencial, houve redução significativa (P<0,05) 55,43% do material orgânico, demonstrando que o óleo essencial foi efetivo para minimizar a aderência de associação de bactérias que formaram o biofilme. Figura 1 Células viáveis em biofilme. Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. *P < 0,05 de acordo com ANOVA. Sa: Staphylococcus eureus; Pa: Pseudomonas aeruginosa Figura 2 Quantificação de biomassa. Os valores são referentes à média de três repetições e as barras indicam o desvio padrão. *P < 0,05 de acordo com ANOVA.

4 Ao avaliar a atividade metabólica, de acordo com a Figura 3, observou-se que não houve redução significativa. Figura 3 Avaliação da atividade metabólica. Conclusões As bactérias Staphylococcus aureus e Pseudomonas aerugionosa se mostraram fortes formadoras de biofilme, sendo que a Pseudomonas aerugionosa foi mais resistente ao tratamento com a solução detergente de óleo essencial. Entretanto, a solução foi efetiva contra a ação de Staphylococcus aureus, sendo uma alternativa natural frente a esse micro-organismo patogênico, podendo ser aplicado em estabelecimentos manipuladores de alimentos. Referências ANDRADE, N. J Higiene na indústria de alimentos: avaliação e controle da adesão e formação de biofilmes bacterianos. São Paulo: Varela, 412 p. CRIADO, M.T., SUÁREZ, B., FERREIRÓS, C.M. The importance of bacterial adhesion in the dairy industry. Food Technology, v.48, n.2, p , CZECHOWSKI, M. H. Gasket and stainless steel surface sanitation: environmental parameters affecting bacterial attachment. Austr. Journal of Dairy Technology, p , DOYLE, M.P. A new generation of foodborne pathogens. Dairy, Food and Environmental Sanitation, v.12, n.8, p , FREIMOSER, F. M.; JAKOB, C. A.; AEBI, M.; TUOR, U. The MTT [3-(4,5- Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method

5 for colorimetric determination of fungal cell densities. Applied and environmental Microbiology, v. 65, n. 8, p , KELSEY, R.G.; REYNOLDS, G.W.; RODRIGUEZ, E. The chemistry of. biologically active constituents secreted and stored in plant glandular trichomes. In: RODRIGUEZ, E.; HEALEY, P.L.; METHA, I (Eds.). Biology and chemistry of plant trichomes. New York: Plenum, p MACÊDO, J. A. B. Biofilmes bacterianos, uma preocupação da indústria farmacêutica. Revista Fármacos & Medicamentos. São Paulo, v. 2, n. 7, Nov/dez, p , MILLEZI, F. M., PEREIRA, M. O., BATISTA, N. N., CAMARGOS N., AUAD I., CARDOSO, M. D. G. AND PICCOLI, R. H. Susceptibility of monospecies and dual-species biofilms of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to essential oils. Journal of Food Safaty, v. 32, p , PARIZZI, S. Q. F.; ANDRADE, N. J.; SOARES, N.F.F.; SILVA, C.A..B. MONTEIRO, E.A.M. Bacterial adherence to different inert surfaces evaluated by epifluorescence microscopy and plate count method. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.47, n.1, p.77-83, SIANI, A.C. et al. Óleos essenciais: potencial antiinflamatório. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, v.16, p.38-43, STEPANOVIC, S., VUKOVIC, D., DAVIC, I., SAVIC, B. and SVABIC-VLAHOVIC, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microb.Meth. 40, , ULTEE, A.; KETS, E.P.; SMID, E.J. Mechanisms of action of carvacrol on the food-borne pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology, v.65, n.10, p , Agradecimentos: CNPQ e Instituto Federal Catarinense.