CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR DIFERENTES BACTÉRIAS PATOGÊNICAS

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1 CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES POR DIFERENTES BACTÉRIAS PATOGÊNICAS Saskia Rosani BERGAMIN 1 ; Vanessa SCHUH 2 ; Karine DALLA COSTA 2, Marina Leda RIBEIROS 2, Sheila Mello da SILVEIRA 3 ; Alessandra Farias MILLEZI 4 1 Bolsista CNPQ/ITI B, Estudante do Curso Técnico em Alimentos Integrado ao Ensino Médio Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 2 Graduandas do curso de Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 3 Co orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC; 4 Orientadora, Docente do Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia/SC Introdução O termo biofilme descreve a forma de vida microbiana séssil, caracterizada pela adesão microbiana com produção de substâncias poliméricas extracelulares, constituindo uma rede gelatinosa que imobiliza e protege as células. Bactérias em biofilmes apresentam alterações fenotípicas e genotípicas que as diferem das células planctônicas, as quais podem ser estratégias de sobrevivência dos microrganismos as condições ambientais adversas (COSTERTON, et al. 1999). Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos os organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários. Acredita-se que a formação de biofilmes esteja associada, por exemplo, à proteção contra o ambiente. Biofilmes são frequentemente encontrados nas indústrias de alimentos, infelizmente geram uma série de fatores negativos, por ser de difícil remoção após atingirem o estágio maduro. Os biofilmes são responsáveis pela maior parte das interferências causadas por microrganismos em processos tecnológicos. Os impactos econômicos causados por biofilmes são estimados em 1% do PIB em países industrializados (SCHNEIDER, 2009). A formação de biofilmes em ambientes de processamento de alimentos eleva as oportunidades para a contaminação microbiana do produto processado e causam deterioração dos alimentos. A contaminação diminui o tempo de vida útil do produto e é responsável pela transmissão de doenças veiculadas por alimentos. Em relação à redução da eficiência de processos industriais, os biofilmes diminuem a eficácia da transferência de calor ao se tornarem

2 suficientemente espessos em locais como trocadores de calor (MITTELMAN, 1998). Biofilmes são importantes agentes de biocorrosão, alguns microrganismos em biofilmes podem catalisar reações químicas e biológicas causando corrosão do metal em ductos e tanques. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi estudar a capacidade de formação de biofilme por diferentes bactérias de importância na indústria de alimentos, sendo elas: Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila e Pseudomonas aeruginosa. Materiais e Métodos As análises foram realizadas no laboratório de Microbiologia de Alimentos localizado no Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia, SC. As bactérias utilizadas neste estudo foram Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila e Pseudomonas aeruginosa. Para a formação do biofilme, cada bactéria foi inoculada separadamente em meio de cultura TSA por 24/36º. Após esse período foi realizada a padronização para 10 8 UFC/mL (L. monocytogenes, A. hydrophila, S. Typhimurium, P. aeruginosa) e 10 7 UFC/mL (S. aureus) utilizando leitura a 630 nm em espectofotômetro Elisa (Biotek,USA). Os biofilmes foram inoculados em microplacas estéreis de polipropileno com 96 cavidades e incubados em shaker orbital (Tecnal, Brasil) a 37 ºC, agitação de 80 rpm (MILLEZI et al., 2012). Após 24 horas, foram realizadas as análises de quantificação da atividade metabólica pelo ensaio colorimétrico de redução de sais de tetrazólio, por 3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazyl)-2,5- Diphenyl-2HTetrazolium bromide (MTT) e para as bactérias consideradas fortes formadoras de biofilme pela análise de MTT, foi realizada a quantificação de células viáveis pela contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC). Para a análise de MTT, utilizou-se protocolo descrito por Freimoser et al. (1999), com modifiçaões. Após 24 horas de formação dos biofilmes, realizou-se a lavagem da placa com água destilada estéril para remoção de células planctônicas, após, foram adicionados 200 µl de solução MTT em cada poço. A placa foi incubada no escuro por 2 h e 30 min a 36 o C, após, o conteúdo da placa foi descartado e procedeu-se à aplicação de 200 µl de DMSO por 15 min. Depois desse período, foi realizada a leitura em espectrofotômetro Elisa a 630 nanômetros.

3 Para quantificação das células viáveis (UFC), estas foram submetidas por 6 minutos ao banho ultrasson (Unique, Brasil). Procedeu-se à diluição seriada das amostras e plaqueamento em superfície de Ágar Triptona de Soja TSA, utilizando a técnica de microgota. Após 24 horas de incubação realizou-se a contagem das células viáveis em biofilmes (SILVA et al. 2010). Para a confecção do gráfico utilizou-se o software Prisma (GrafPad Software). Resultados e Discussão Biofilmes não incluem somente microrganismos, mas também todo material extracelular produzido, bem como qualquer material aprisionado dentro da matriz resultante; são constituídos principalmente de água (95%) e matéria orgânica. Os biofilmes contêm partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídios, carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre outros, que formam uma espécie de crosta debaixo da qual os microrganismos continuam a crescer, formando um cultivo puro ou uma associação com outros microrganismos (MACÊDO, 2000). Das bactérias analisadas nesse trabalho, verificou-se que que P. aeruginosa e A. hydrophila foram as únicas classificadas como fortes formadoras de biofilme devido à alta capacidade de aderência no polipropileno. A. hydrophila alcançou OD = 0,40 e P. aeruginosa OD = 0,70 (figura 1); sendo que o parâmetro utilizado na literarura para bactérias com forte capacidade de biofilme é OD = 0,2 nanômetros (FREIMOSER et al.,1999). Figura 1 Quantificação de atividade metabólica utilizando análise de MTT

4 Conforme mostra a Figura 2, na quantificação de células viáveis, A. hydrophyla teve crescimento de 6,6 log10 CFUcm -2 e P. aeruginosa 7,9 log10 CFUcm -2 De acordo com a literatura, o valor de 5 log10 CFUcm -2 já é considerado que houve a formação de biofilme Figura 1 Células viáveis em biofilme (Unidades Formadoras de Colônias) Conclusões Concluiu-se com esse trabalho que as bactérias A. hydrophila e P. aeruginosa apresentaram forte capacidade de formar biofilme na superfície de polipropileno, sendo que dessas duas espécies, P. aeruginosa foi a mais eficiente formadora de biofilme. Referências COSTERTON, J.W., GEESEY, G.G. and CHENG, K.J. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. New York, v. 284, , FREIMOSER, F. M.; JAKOB, C. A.; AEBI, M.; TUOR, U. The MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities. Applied and environmental Microbiology 65(8): MACÊDO, J. A. B. Biofilmes bacterianos, uma preocupação da indústria farmacêutica. Revista Fármacos & Medicamentos. São Paulo, v. 2, n. 7, Nov/dez, p , 2000.

5 MILLEZI, F. M., PEREIRA, M. O., BATISTA, N. N., CAMARGOS N., AUAD I., CARDOSO, M. D. G. AND PICCOLI, R. H. Susceptibility of monospecies and dual-species biofilms of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to essential oils. Journal of Food Safety, 32, , MITTELMAN, M. W. Structure and functional characteristics of bacterial biofilms in fluid processing operations. Journal Dairy Science. Champaing, v. 81, n. 10, p , RONNER, A.B. andwong, A.C.L Biofilm development and sanitizer inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella Thyphimurium on stainless steel and buna-n rubber. J. Food Prot. 56, SCHNEIDER, R. P. Biofilmes Microbianos. Microbiologia em Foco. n 2, v. 1, p SILVA, N., JUNQUEIRA,V.C.A., SILVEIRA, N.F.A., TANIWAKI, M.H., SANTOS, R.F.S., GOMES, R.A.R Manual de Métodos de AnáliseMicrobiológica de Alimentos e Água, p. 624, 4th Ed.,Varela, São Paulo, Brazil. Agradecimentos: CNPQ e Instituto Federal Catarinense.