DINÂMICA DE FORMAÇÃO DE BIOFILME POR CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO

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1 DINÂMICA DE FORMAÇÃO DE BIOFILME POR Campylobacter jejuni SUBMETIDO A DIFERENTES CONDIÇÕES DE CRESCIMENTO S.S. Gehlen 1, N.S.M. Aquino 2, G. Perdoncini 1, L.N. Diedrich 1, L.B. Rodrigues³, V.P. do Nascimento 1 1- Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias/Sanidade Avícola Universidade Federal do Rio grande do Sul CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (54) (saragehlen@gmail.com). 2- Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos - Universidade de Passo Fundo- CEP: Passo Fundo RS Brasil, Telefone: (54) (nathanyelleaquino@gmail.com) 3 - Faculdade de Medicina Veterinária Universidade de Passo Fundo CEP: Passo Fundo RS Brasil, Telefone: (54) (laurab@upf.br). RESUMO Campylobacter jejuni é um dos patógenos de maior relevância nos casos de Doenças Transmitidas por Alimentos. Apesar de possuir um crescimento fastidioso in vitro, o patógeno microaerófilo C. jejuni consegue sobreviver em condições ambientais com baixas concentrações de nutrientes, variações de temperatura e altas concentrações de oxigênio na forma de biofilmes. Sua capacidade de formação de biofilmes é uma das formas de se manter no ambiente de processamento de alimentos, contaminando o produto final. Neste estudo, cepas de Campylobacter jejuni de origem avícola foram submetidas formação de biofilmes em microplacas de poliestireno sob diferentes condições ambientais envolvendo as temperaturas de 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC, ambiente de microaerofilia e aerobiose e dois caldos de cultivo, o caldo Bolton e Triptona de Soja sem glicose. Os resultados obtidos demonstraram que C. jejuni formou biofilmes em todas condições ambientais analisadas, com destaque no caldo Triptona de soja sem glicose. ABSTRACT Campylobacter jejuni is one of the most relevant pathogens in cases of Foodborne Diseases. Despite having a fastidious growth in vitro, microaerophilic pathogen C. jejuni can survive on environmental conditions of low nutrient concentrations, temperature variations and high oxygen concentrations in the form of biofilms. His biofilms forming ability is one of the ways to stay in the food processing environment, contaminating the final product. In this study, Campylobacter strains jejuni avian origin have been subjected biofilm formation on polystyrene microplates under different environmental conditions involving temperatures of 42 ± 1 C, 36 ± 1 C, 25 ± 1 C, 9 ± 1 C and 3 ± 1 C, microaerophilic environment and aerobically and two broths cultivation, Bolton broth and Tryptone Soy without glucose. The results showed that C. jejuni biofilms formed in all environmental conditions analyzed, especially in Tryptone soy broth without glucose. PALAVRAS-CHAVE: biofilmes, Campylobacter jejuni, microaerofilia, aerobiose KEYWORDS: biofilms, Campylobacter jejuni, microaerophilia, aerobiosis

2 1. INTRODUÇÃO Campylobacter jejuni é uma bactéria Gram negativa, móvel, com flagelos uni ou bipolares, que originam um movimento característico em serrote ou saca-rolha. Seu crescimento ótimo ocorre entre 42 C e 46 C e não se multiplicam em temperatura ambiente ou sob refrigeração (Forsythe, 2013). Uma característica peculiar deste microrganismo é o fato de que quando submetido às condições adversas ao seu crescimento, as células adquirem a forma cocoide e são denominadas viáveis, mas não-cultiváveis (VBNC). Bactérias nesse estado, mantêm sua capacidade de virulência, porém diminuem seu metabolismo até que as condições sejam favoráveis (Oliver, 2005). Este patógeno é considerado um dos principais agentes etiológicos de diarreia humana e está entre os microrganismos mais causadores de Doenças Transmitidas por Alimentos nos Estados Unidos e em diversos países da Europa (CDC, 2016). A contaminação de carcaças de frangos em abatedouros é considerada o principal fator de risco para infecções humanas e pode ocorrer devido a presença de biofilmes (Carvalho et al.; 2010; Forsythe, 2013). O termo biofilme refere-se aos microrganismos aderidos a uma superfície biótica ou abiótica e, uma vez constituído, age como ponto de contaminação constante, liberando fragmentos ou células, o que pode comprometer a qualidade microbiológica dos alimentos e consequentemente a saúde humana (Costerton et al., 1995). Campylobacter jejuni tem mostrado habilidade de formação de biofilmes sob condições similares em superfícies abióticas e ambientes bióticos de hospedeiros animais, envolvendo baixa disponibilidade de nutrientes e alta concentração de oxigênio (Svensson et al., 2008). Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de formação de biofilmes por C. jejuni em temperaturas de refrigeração (3 C e 9ºC), ambiente (25ºC), ótima para mesófilas (36ºC) e de termotolerância e ótima para C. jejuni (42ºC) em placa de poliestireno. Foram utilizados dois caldos de cultivo, sendo o caldo Bolton e o caldo TSB sem glicose e incubação sob condições de aerobiose e microaerofilia num intervalo de 24 horas. 2. MATERIAL E MÉTODOS As cepas de Campylobacter jejuni foram previamente isoladas de carcaças de frango resfriadas, coletadas em abatedouro avícola e confirmadas por metodologia convencional (ISO / 2006) e pela técnica de Multiplex-PCR (Perdoncini et al., 2015). Neste experimento, as 7 cepas utilizadas foram designadas como CJ03, CJ35, CJ42, CJ127, CJ134, CJ135, CJ136. A cepa padrão de C. jejuni utilizada foi a ATCC Para reativação, as cepas foram semeadas em ágar mccda e incubadas em condições de microaerofilia, sob temperatura de incubação de 42 C por 48 horas. As colônias de C. jejuni foram inoculadas em dois caldos de pré-enriquecimento, caldo Bolton e caldo Triptona de soja (TSB) sem glicose, e a turvação dos caldos foi ajustada até a escala 1 de MacFarland. Para o ensaio da formação de biofilmes, após o ajuste das turvações, 200 μl de cada suspensão bacteriana juntamente com as cepas ATCC, foram inoculadas individualmente, em triplicata, em placas de microtitulação de poliestireno com 96 poços estéreis. Como controle negativo, foi utilizado caldo TSB sem glicose, inoculado em triplicata. As placas de poliestireno foram incubadas a 42±1ºC, 36±1ºC, 25±1ºC, 9±1ºC e 3±1ºC por 24 horas em condições atmosféricas ambiente (aerobiose) e de microaerofilia.

3 Após período de incubação, procedeu-se o tratamento das microplacas conforme metodologia descrita por Stepanovic et. al (2000) e modificada por Rodrigues et al. (2009). Em seguida, a absorbância foi lida utilizando um leitor de placas de ELISA a 550 nm. A densidade óptica (DOa) de cada uma das cepas foi obtida pela média aritmética da absorbância dos três poços e este valor foi comparado com a absorvância média dos controles negativos (DOcn). A seguinte classificação foi utilizada para a determinação da formação de biofilme: não formação de biofilme (DOa DOcn), fraca formação de biofilme (DOcn < Doa 2.DOcn), moderada formação de biofilme (2.DOcn < DOa 4.DOcn) e forte formação de biofilme (4.DOcn < DO) (RODRIGUES et al., 2009). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO As cepas de C. jejuni foram capazes de formar biofilme em todas as condições ambientais analisadas. Conforme pode se observar nas Figuras de 1 a 3, as 7 amostras de C. jejuni foram fracamente formadoras de biofilmes nas temperaturas, caldos e ambientes de microaerofilia e aerobiose testados, e algumas amostras, não foram capazes de aderir em determinadas condições. Não houve destaque entre as condições testadas, porém, nota-se que as cepas formaram mais biofilme em caldo TSB e em condições de aerobiose. Figura 1. Formação de biofilme por amostras de C. jejuni em placa de poliestireno na temperatura de 3 C (1) e 9ºC (2). Legendas: (A) caldo Bolton em aerobiose; (B) caldo TSB em aerobiose; (C) caldo Bolton em microaerofilia; (D) caldo TSB em microaerofilia. CN= controle negativo. Leitura da densidade óptica (DO) a 550 nm. As barras de erros correspondem ao desvio padrão das médias da DO.

4 Figura 2. Formação de biofilme monoespécie por amostras de C. jejuni em placa de poliestireno na temperatura de 25 C (1) e 36ºC (2). Legendas: (A) caldo Bolton em aerobiose; (B) caldo TSB em aerobiose; (C) caldo Bolton em microaerofilia; (D) caldo TSB em microaerofilia. CN= controle negativo. Leitura da densidade óptica (DO) a 550 nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das médias da DO. Figura 3. Formação de biofilme monoespécie por amostras de C. jejuni em placa de poliestireno na temperatura de 42 C. Legendas: (A) caldo Bolton em aerobiose; (B) caldo TSB em aerobiose; (C) caldo Bolton em microaerofilia; (D) caldo TSB em microaerofilia. CN= controle negativo. Leitura da densidade óptica (DO) a 550 nm. As barras de erro correspondem ao desvio padrão das médias da DO. Estes resultados demonstraram que, apesar de requerer condições especiais para crescimento e ser um microrganismo fastidioso, C. jejuni consegue formar biofilme quando submetido em diferentes condições ambientais, tanto favoráveis como desfavoráveis para sua sobrevivência. Este microrganismo formou biofilme de maneira semelhante em meio de cultivo seletivo para Campylobacter, no caso do caldo Bolton e no meio de cultivo não-seletivo, o TSB sem glicose, em ambos ambientes de incubação, com destaque às condições de aerobiose. Logo, nota-se que na forma de biofilmes, este microrganismo possui maior resistência às condições adversas.

5 Um estudo semelhante foi realizado por Reeser et al. (2007) induziu a formação de biofilme de uma amostra de C. jejuni M129 foi testada em três meios diferentes, sendo Mueller-Hinton, Brucella, e caldos Bolton e em diversas superfícies de contato, como PVC, poliestireno e vidro. Observou-se que houve maior formação de biofilme em caldo Mueller-Hinton, que possui menos nutrientes, a 37 C em 10% de atmosfera de CO2 (microaerofilia) e em superfície de poliestireno. Além disso, foi formado mais biofilme a 37 C em 10% de CO2 do que a 25 C nas mesmas condições, e ainda, maior formação de biofilme a 25 C em condições aeróbicas do que em 10% de CO2. A formação de biofilmes colabora para justificar o fato deste patógeno permanecer viável em alimentos como a carne de frangos e, portanto, ser considerado o maior causador de surtos de gastroenterite em humanos no mundo. As temperaturas utilizadas neste experimento mimetizaram as temperaturas preconizadas em abatedouros avícolas: 3±1ºC (temperatura de resfriamento, máximo a 4 C); 9±1ºC (temperatura de refrigeração; e temperatura de sala de cortes para exportar para UE, máximo de 12 C); 25±1ºC (temperatura ambiente); 36±1ºC (padrão ótimo para crescimento de mesófilos) e 42ºC±1ºC (temperatura ótima de C. jejuni). A maior preocupação se dá ao fato deste patógeno ter formado biofilmes em baixas temperaturas. A adesão nas temperaturas de refrigeração pode revelar que microrganismos patogênicos podem se aderir quando no momento do resfriamento de carcaças, como a água do chiller nos tanques de aço inoxidável e na cadeia de frio utilizada para conservação dos alimentos. 4. CONCLUSÕES O estudo da formação de biofilmes por Campylobacter jejuni e seu controle em abatedouros avícolas é importante, pois pode ser uma forma de reduzir os surtos de DTA relacionados a este patógeno. Além disso, como surtos pelo gênero Campylobacter são subnotificados no Brasil, é necessária a implementação de métodos efetivos para detecção deste patógeno em humanos e alimentos como a carne de frango. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Carvalho, A. F., Silva, D. M., Azevedo, S. S., Piatti, R. M., Genovez, M. E., & Scarcelli, E. (2010). Detecção dos genes da toxina citoletal distensiva em estirpes de Campylobacter jejuni isoladas de carcaças de frangos. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., 62(5), CDC. Centers for Disease Control and Prevention. (2016). Multistate Outbreak of Listeriosis Linked to Packaged Salads Produced at Springfield, Ohio Dole Processing Facility. Disponível em: Acesso em: fev/2016. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., & Lappin-Scott, H. M. (1995). Microbial biofilms. Annual Reviews in Microbiology,49(1), Forsythe, S. J. (2013). Microbiologia da segurança dos alimentos (2ed). Porto Alegre: Artmed. Perdoncini, G. (2015). Avaliação de Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em etapas do processamento de frangos de corte. (Tese de Doutorado em Ciências Veterinárias na com ênfase em Sanidade Avícola). Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. Stepanovic, S., Vuković, D., Dakić, I., Savić, B., & Švabić-vlahović, M. (2000). A modified microtiterplate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. Journal Microbiology Methods, 40,

6 Oliver, J. (2005). The Viable but Nonculturable State in Bacteria. The Journal of Microbiology. 43, Reeser, R. J., Medler, R. T., Billington, S. J., Jost, B. H.; & Joens, L. A. (2007) Characterization of Campylobacter jejuni biofilms under defined growth conditions. Appl. Environ. Microbiol., 73, Svensson, S. L., Frirdich, E., & Gaynor, E.C. Survival strategies of Campylobacter jejuni: stress responses, the viable but nonculturable state, and biofilm. In: Campylobacter, 3rd Edition. Nachamkin, I., Szymanski, C. M. and Blaser, M. J. (eds.). ASM Press: Washignton, D.C., p ,