AÇÃO DO ÁCIDO PERACÉTICO EM BIOFILME FORMADO POR Salmonella sp. EM SUPERFÍCIE DE POLIURETANO

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1 AÇÃO DO ÁCIDO PERACÉTICO EM BIOFILME FORMADO POR Salmonella sp. EM SUPERFÍCIE DE POLIURETANO S. A. Costa¹, A.M. Schneider 2, G. R. Fonseca 3, M. J. Sereno 4, K. Pegoraro 5, L. S. Bersot 6 1- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: +55 (44) (sarah.almeida@ufpr.br) 2- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: (+55-45) (andressamaisa@ufpr.br). 3- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: +55 (45) (giovanarfonseca@gmail.com) 4- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: +55 (44) (mallusereno@gmail.com) 5- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: +55 (44) (kadigiapegoraro@gmail.com) 6- Departamento de Ciências Veterinárias Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, CEP: Palotina PR Brasil, Telefone: +55 (44) (lucianobersot@gmail.com) RESUMO Biofilme é uma grande preocupação na indústria de alimentos, pois pode levar deterioração e veiculação de patógenos aos humanos. Nesse sentido o objetivo do estudo foi avaliar a capacidade de formação de biofilme de bactérias do gênero Salmonella sp. em superfície de poliuretano (PU) e verificar a eficiência do ácido peracético em diferentes concentrações (0,1%;0,7%;1,5%) e tempos de contato (5,10,15 minutos) sob o biofilme préformado. Foram testados três estirpes, sendo uma forte, uma moderada e uma fraca formadoras de biofilme em superfície de 1 cm² de PU numa concentração de 10 8 UFC/mL de Salmonella sp. em caldo Luria Bertani incubados a 35ºC/96 horas. Os resultados preliminares deste estudo demonstraram que Salmonella sp. foi capaz de formar biofilme em poliuretano e o ácido peracético foi eficiente na remoção de biofilme formado numa concentração mínima de 0,1%, em 5 minutos de contato. ABSTRACT Biofilm is a great concern in food industry, which can cause deterioration and pathogen transmission to humans. For this reason the aim of this study were to analyze the biofilm-prodution ability of Salmonella spp. in polyurethane (PU) and also analyze the tolerance biofilm formed to peracetic acid in different concentrations (0,1;0,7;1,5%) and times (5, 10, 15 minutes). Three strains were tested, each one was classified as strong, moderate and weak biofilm-produce at 1cm² of PU at a concentration of 10 8 CFU/ml of Salmonella sp. in Luria Bertani broth incubated at 35 C/96 hours. The preliminary results of this study demonstrated that Salmonella sp. was able to form biofilms on polyurethane and peracetic acid was efficient in removing biofilm formed in a minimum concentration of 0.1% in 5 minutes of contact. PALAVRA-CHAVES: Salmonella sp.; biofilme; poliuretano; ácido peracético. KEYWORDS: Salmonella sp.; biofilm; polyurethane; peracetic acid.

2 1. INTRODUÇÃO A definição de biofilme vem sendo mudada e adaptada nos últimos 25 anos, segundo Donlan e Costerton (2002) biofilme é uma comunidade bacteriana séssil, que está irreversivelmente aderida a uma superfície e incorporada a uma matriz extracelular de exopolissacarídios, que possibilitam a troca de genes e nutrientes entre os micro-organismos pertencentes a ele. A grande preocupação da indústria de alimentos envolvendo os biofilmes, esta relacionada à sua potencialidade de resistir aos sanitizantes e aos tratamentos com antimicrobianos, além de ser uma fonte constante de micro-organismos que podem causar deterioração, perda da qualidade e veiculação de patógenos aos alimentos processados (Weng et al, 2016; Kasnowski et al, 2010; Flash et al., 2005; Schlisselberg e Yaron, 2013). Salmonella spp. é uma das principais causas de enfermidades transmitidas por alimentos (Bell e Kyriakides, 2002). Segundo Foodborne Diseases Active Surveillance Network (2013), nos Estados Unidos houve casos de enfermidades causadas por consumo de alimentos em 2013, com hospitalizações e 80 mortes. Salmonella spp. foi o patógeno que apresentou maior porcentagem de participação nestes casos, com 15.19% (7.277 casos confirmados). Tem sido demonstrado que micro-organismos do gênero Salmonella apresentam capacidade de formação de biofilmes, o que favorece a permanência desse patógeno na indústria de alimentos por longos períodos (Corcoran et al., 2013) e pode aumentar a capacidade de sua resistência aos agentes sanitizantes utilizados na higienização de superfícies e equipamentos (Lejeune, 2003). Dentre os sanitizazantes empregados em indústria de processamento de alimentos, o ácido peracético é um dos agentes mais amplamente utilizados, por ter um forte poder de oxidação, sendo apropriado para desinfecção de utensílios e superfícies. Porém, assim como acontece com outros desinfetantes, sua eficiência é influenciada pela presença de biofilme (Wessels et al., 2013). A resistência dos mesmos está claramente associada com a organização das células bacterianas dentro da matriz polimérica e essa organização reduz a penetração dos agentes antimicrobianos ao biofilme (Ziech et al., 2016). Assim, o presente trabalho teve como objeto induzir a formação de biofilmes por culturas de Salmonella spp. em poliuretano (PU) e logo após, submeter este biofilme a três concentrações e três tempos de exposição ao ácido peracético, para verificar a efetividade da remoção do biofilme pré-formado. 2. MATÉRIAL E METÓDOS O estudo for realizado entre agosto de 2015 e maio de 2016, para tal foram selecionadas três estirpes de Salmonella sp. com diferentes capacidades de formação de biofilmes, isoladas em um estudo prévio conduzido por Viana (2014) e classificadas como fortemente, moderadamente e fracamente formadora de biofilme por Ziech et al. (2016). As culturas de Salmonella sp. foram recuperadas em ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) (Difco TM ) e colônias características de cada cepa foram selecionadas e repicas para caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Difco TM ). Para a formação dos biofilmes, foram utilizados cupons

3 de 1 cm 2 de PU seccionados, lavados e autoclavados, adicionados em frascos com 150ml de caldo Luria Bertani (LB) (Difco TM ) a uma concentração de 10 8 UFC/mL (0,5 na escala de MacFarland) de cada cepa selecionada e purificada. Posteriormente, os frascos foram mantidos por 96h a 37ºC sob agitação de 100 rpm em Orbital Shaker (BIOSAN ) como protocolo para a formação do biofilme. Após esse período de incubação, os cupons foram retirados do caldo LB, lavados com 10 ml de Solução Salina Tamponada (PBS) para eliminação das células não aderidas e, em duplicata, foram adicionados nas diferentes concentrações de ácido peracético (Peracid ), 0,1%, 0,7% e 1,5%, onde foram mantidos em cada concentração por 5, 10 e 15 minutos. Também foi realizado um controle positivo, em duplicata, para cada cepa testada. Para este controle, os cupons não passaram pelo processo de sanitização, ou seja, não foram submetidos às diferentes concentrações de ácido percético, apenas lavagem com PBS. Para a remoção e contagem das células que permaneceram viáveis após o tratamento com o sanitizante e também para o controle positivo, foram friccionados swabs em uma das superfícies dos cupons (1 cm 2 ), os quais foram homogeneizados em 2ml de solução salina durante 10 segundos em vortex, seguido de semeadura em Ágar Triptona Soja (Difco TM ) e incubados a 35 o C/24h, de acordo com metodologia proposta por Nguyen e Yuk (2013) adaptada. Os resultados foram expressos em log 10 UFC/cm 2 e são provenientes de quantificação única. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os dados apresentados são preliminares e foram avaliados somente sob o aspecto descritivo e não estatístico. Duas novas repetições serão realizadas para finalização do delineamento experimental e tratamento estatístico. Nesse estudo as três estirpes de Salmonella sp. testadas mostraram capacidade de aderência em PU dentro do período de 96 horas. Dados similares com os que Ziech et al. (2016) e Chia et al. (2009) encontraram, mostrando assim a capacidade desse micro-organismo em formar biofilme neste material. Na tabela 1 estão os dados da contagem em UFC/cm² das cepas sem tratamento do sanitizante (controle positivo) e dos tratamentos com concentrações de 0,1%, 0,7% e 1,5% nos tempos 5, 10 e 15 minutos. Tabela 1. Resultados obtidos (log10 UFC/cm 2 ) de cada cepa de Salmonella testada frente a diferentes concentrações de ácido peracético e tempos de contato. Tempo de contato com o AP (minutos) Cepa Concentração testada a do AP b Controle c Cepa Fraca Cepa Moderada Cepa Forte 0,7% 0,95 0, ,94 0,1% 0,30 0,30 ND d 1,5% ND ND 0,48 0,1% 0,90 0,30 ND 0,7% ND ND ND 4,93 1,5% ND 0,30 ND 0,1% ND ND ND 0,7% ND ND ND 4,63 1,5% 0,84 ND ND a Cepas (fraca, moderada, forte) = dados obtidos em um estudo prévio (Ziech et al., 2016) b AP = ácido peracético c Controle positivo = média da contagem de dois cupons sem contato com o AP

4 d ND = Não detectado Estes resultados mostram a sensibilidade das cepas de Salmonella sp. quando exposta ao ácido peracético, um sanitizante amplamente utilizado na indústria de alimentos. Sua eficiência contra bactérias gram-negativas já havia sido relatada por Leaper (1984) devido a sua ação em lipoproteínas, o que pode se equivaler a membrana lipoproteica. Rossoni e Gaylarde (2000) mostraram a eficácia do ácido peracético frente a outros micro-organismos gramnegativos como Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens. Já em micro-organismos grampositivos este efeito não foi observado, como mostra o estudo realizado com Staphylococcus sp., que quando exposto ao sanitizante por 10 minutos apresentou resistência (Briñez et al., 2006). Com base nos resultados da tabela 1, em todos os tratamentos se verificou uma redução mínima de quatro ciclos logarítmicos das contagens em relação ao controle positivo, independente da concentração do ácido peracético utilizado e do tempo de contato. Segundo Møretrø et al. (2009), a eficiência de um sanitizante é verificada por sua capacidade em reduzir 4 log10 na contagem dos micro-organismos. Assim, este estudo evidenciou a eficiência do ácido peracético nas concentrações de 0,1%, 0,7% e 1,5% na redução de biofilme formado pelas três cepas em superfícies de poliuretano. Sendo a recomendação do fabricante a utilização do ácido peracético em concentrações que variam de 0,1% a 1,5. Contudo, no estudo dirigido por Ziech et al. (2016), o ácido peracético reduziu somente 1,87 log10 quando testado na concentração de 0,2%. Na indústria de alimentos, muitos desinfetantes utilizados apresentam ação de inibição frente aos micro-organismos do gênero Salmonella sp. (Møretrø et al., 2009). Nguyen et al. (2013) mostraram que o cloro apresentou uma maior eficiência, seguido da amônia quaternária, enquanto Ziech et al. (2016) mostraram que o detergente alcalino clorado foi superior na remoção de células aderidas quando comparado com o ácido peracético. Deve-se lembrar que a eficiência do ácido peracético, assim como os demais desinfetantes está diretamente relacionada com a matriz extracelular em que os micro-organismos estão envolvidos (Wessels et al., 2013). 4. CONCLUSÃO Os resultados preliminares deste estudo demonstraram que Salmonella sp. foi capaz de formar biofilme em poliuretano e o ácido peracético foi eficiente na remoção de biofilme formado numa concentração mínima de 0,1%, em 5 minutos de contato. Novas repetições serão realizadas a fim de se obter dados conclusivos definitivos para o experimento. 5. AGRADECIMENTOS Costa, G. R. Fonseca, L. S. Bersot, recebem apoio do CNPq; A. M. Schneider, recebe apoio da Fundação Araucária, PR; M. J. Sereno, recebe apoio da CAPES e K. Pegoraro, recebe apoio do MEC.

5 6. REFERÊNCIAS Bell, C. & Kyriakides, A. (2002). Salmonella: A practical approach to the organism and its control in foods. Osney Mead, Oxford: Blackwell Science, 330 p. Briñez, W.J., Roing-Sagués, A. X., Herrero M.M.H., Pedemonte, T.L. & Guamis B. (2006). Bactericidal efficacy of peracetic acid in combination with hydrogen peroxide against pathogenic and non pathogenic strains of Staphylococcus spp., Listeria spp. and Escherichia coli. Food Control, 17(7) CDC, (2013). Food borne Diseases Active Surveillance Network (Food Net): Food Net Surveillance Report for 2013 (Final Report). Atlanta, Georgia: U.S. Department of Health and Human Services, CDC Disponível em: Chia, T.W.R., Goulter, R.M., McMeekin, T., Dykes, G. A. & Fegan, N. (2009). Attachment of different Salmonella serovars to materials commonly used in a poultry processing plant. Food Microbiology, 26(8), Corcoran, M., Morris, D., De Lappe, N., O'connor, J., Lalor, P. & Dockery, P., et al. (2013). Commonly used disinfectants fail to eradicate Salmonella Enterica biofilms from food contact surface materials. Applied and Environmental Microbiology, 80(4), Dolan, R.M. & Costerton, J.M., (2002). Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Review, 15(2), Flach, J., Karnopp, C. & Corção, G. (2005). Biofilmes formados em matéria-prima em contato com leite: fatores de virulência envolvidos. Acta Scientiae Veterinariae, 33 (3), Kasnowski, M. C., Mantilla, S. P. S., Oliveira, L. A. T. & Franco, R. M. (2010). Formação de biofilme na indústria de alimentos e métodos de validação de superfícies. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária, 8 (15), Leaper, S. (1984). Synergistic killing of spores of Bacillus subtilis by peracetic acid and alcohol. Journal of Food Technology, 19, Lejeune, P. (2003). In M. Wilson, & D. Devine (Eds.), Biofilms. Cambridge: University of Cambridge. Møretrø, T., Vestby, L. K., Nesse, L. L., Storheim, S. E., Kotlarz, K. & Langsrud, S. (2009). Evaluation of efficacy of disinfectants against Salmonella from the feed industry. Journal of Applied Microbiology, 106(3), Nguyen, H. D. N., & Yuk, H. G. (2013). Changes in resistance of Salmonella Typhimurium biofilms formed under various conditions to industrial sanitizers. Food Control, 29(1), Rossoni, E.M.M. & Gaylader C.C. (2000). Comparison of sodium hypochlorite and peracetic acid as sanitising agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence microscopy. International Journal of food microbiology, 61(1) Schlisselberg, D. B. & Yaron, S. (2013). The effects of stainless steel finish on Salmonella Typhimurium attachment biofilm formation and sensitivity to chlorine. Food Microbiology, 35, (1), Viana, C. (2014). Uso de aspersão de água sobre a contaminação superficial de esteiras sanitárias condutoras de cortes de frango em frigoríficos de aves. (Dissertação de mestrado). Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina. Weng, X., Niekerk J. V. & Neethirajan S. (2016). Characterization of antimicrobial efficacy of photocatalytic polymers against food-borne biofilms, Food science and technology, 68, 1-7. Wessels, S., & Ingmer, H. (2013). Modes of action of three disinfectant active substances: a review. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 67(3), Ziech, R. E., Perin A. P., Lampugnani C., Sereno M. J., Viana C., Mendonça V. S., J Pereira, J. G., Pinto J.P.A.N. & Bersot L.S. (2016). Biofilm-producing ability and tolerance to industrial

6 sanitizers in Salmonella spp. isolated from Brazilian poultry processing plants. Food Science and Technology, 68,