Atualidades no Circovírus Suíno Tipo 2 (PCV2) Parte II

Transcrição

1 Sanidade Atualidades no Atualidades no Circovírus Suíno Tipo 2 (PCV2) Parte II Maria Fort Médica Veterinária e Doutora mariafort@gmail.com Hipóteses e objetivos O desenvolvimento da síndrome do emagrecimento progressivo pós-desmame (sigla em inglês, PMWS) parece estar relacionado à replicação massiva do circovírus suíno do tipo 2 (PCV2), enquanto a infecção subclínica a ocorrência mais comum em suínos infectados pelo PCV2 aparentemente pressupõe o controle da carga viral. A formação insuficiente ou retardada de anticorpos anti- PCV2 e, particularmente, a ausência de anticorpos neutralizantes (NA, em inglês) têm sido relacionadas à alta carga viral e ao desenvolvimento da PMWS. Em compensação, pouco se sabe a respeito do papel da imunidade mediada por células. No entanto, certas características da infecção causada pelo PCV2, tal qual a coexistência da viremia persistente e dos altos níveis de anticorpos anti-pcv2, ou o fato do PCV2 ser um vírus estritamente associado a células, sugerem que as respostas humorais poderiam não ser suficientes para lidar com a infecção pelo PCV2. Por essa razão, foi levantada a hipótese de que o controle imunológico da replicação do PCV2 implicaria no envolvimento da imunidade mediada por células. As vacinas contra o PCV2 estão disponíveis atualmente, ou virão a ser, em breve, em todos os países de suinocultura relevante. Embora a eficácia das mesmas venha sendo altamente testada (e provada) em ensaios a campo, poucos dados relativos aos mecanismos imunológicos, implícitos na proteção induzida pela vacina, estão disponíveis. Com base no fato dos NA anti-pcv2 serem protetivos contra a infecção pelo PCV2 e o desenvolvimento da PMWS, foi lançada a hipótese de que o mecanismo primário por trás da proteção conferida pela vacinação seria a indução dos NA. Estudos epidemiológicos recentes sugerem uma mudança nos genótipos predominantes excedentes do PCV2, e os pertencentes ao grupo filogenético PCV2b têm sido considerados mais virulentos que os pertencentes ao grupo filogenético PCV2a. Todas as vacinas comerciais contra o PCV2 são produzidas com base no grupo PCV2a, mas a implementação das mesmas no campo reduz drasticamente a incidência da PMWS em granjas nas quais o PCV2b predomina. Portanto, vacinas baseadas no PCV2a parecem proteger de modo igualitário contra as infecções causadas por ambos os grupos, PCV2a ou PCV2b. A continuação desse trabalho de tese, que teve a sua primeira parte publicada em nossa edição anterior, tem por objetivo caracterizar as respostas imunológicas, no decurso da infecção pelo PCV2 e, posteriormente, à vacinação contra o referido vírus, por meio dos seguintes parâmetros: Caracterização do perfil imunológico desenvolvido por suínos na infecção pelo PCV2 e investigação do papel dos diferentes componentes virais na indução das respostas inatas e adaptativas específicas ao PCV2. Caracterização das respostas imunológicas desenvolvidas por suínos convencionais, após a vacinação com uma e duas doses de uma vacina de subunidades baseada em PCV2a Cap (Porcilis PCV ) e avaliação da sua eficácia frente ao desafio com isolados de PCV2a e PCV2b. Investigação do efeito dos anticorpos maternais na vacinação de leitões contra o PCV2 e, por meio dela, fornecimento de informações a serem utilizadas como um guia, na implementação apropriada de programas de vacinação no campo. Desenvolvimento de imunidade mediada por células frente ao circovírus suíno do tipo 2 (PCV2) em leitões nascidos por meio de cesariana e privados de colostro Introdução Muitos estudos têm sugerido a interação entre o PCV2 e o sistema imunológico como um evento chave na patogenia da PMWS. O PCV2 infecta a linhagem de células monocíticas ( 155,58,192 ), e sua persistência de longa duração no interior de macrófagos e células dendríticas (DC, em inglês) tem sido apontada como um mecanismo potencial de disseminação para o PCV2 por meio do organismo ( 192 ). Adicionalmente, o PCV2 prejudica a habilidade das células mononucleares do sangue periférico (PBMC, em inglês) em responder aos mitógenos ( 31 ), e o DNA viral tem se revelado um bloqueador da atividade das células produtoras naturais de interferon (NIPC, em inglês), responsáveis pela produção de interferon alpha (IFN-α), o que por sua vez afeta a habilidade dessas células em mediar respostas antivirais no processo da infecção ( 194 ). Além disso, o PCV2 tem se revelado um indutor da secreção de interleucina-1 (IL-1), em PBMC (células mononucleares do sangue periférico) cultivadas in vitro ( 31,82 ), levando à regulação descendente de outras citocinas, produzidas durante a resposta a um antígeno contra o qual o animal já esteja sensibilizado (recall antigen, em inglês) ( 82 ). Os autores desses estudos mais recentes sugerem o envolvimento da IL- 1 na supressão das respostas Th1 (caracterizadas pela produção de interferon 32 Suínos & Cia Ano VI - nº 36/21

2 gama ou IFN-γ) observadas durante o decurso da PMWS. Essa hipótese também é apoiada por outros trabalhos, realizados com suínos inoculados experimentalmente com PCV2, nos quais a elevação dos níveis séricos de IL-1 estaria relacionada com o desenvolvimento da PMWS ( 176 ) ou com o aumento da carga viral sérica do PCV2 ( 34 ). Esses dados, em conjunto, sugerem que os mecanismos utilizados pelo PCV2 para neutralizar as defesas imunológicas do hospedeiro encontramse, provavelmente, no âmbito da atividade imuno-moduladora de seus componentes virais. A maioria das infecções causadas pelo PCV2 são subclínicas, e diferentes fatores têm sido sugeridos como desencadeadores em potencial para o desenvolvimento da doença. Os modelos experimentais mais bem sucedidos incluem a co-inoculação com o parvovírus suíno, ou PPV ( 5 ), e o uso de substâncias moduladoras do sistema imunológico, tais como a metaloproteína KLH (keyhole limpet haemocyanin, em inglês) em adjuvante incompleto de Freund ( 87 ). Ocasionalmente, a PMWS também tem sido reproduzida com o uso do PCV2 sozinho ( 5,83 ). Embora nenhum desses modelos tenha sido demonstrado e repetido com consistência em suínos convencionais, evidências apontam na direção de uma alteração da resposta imunológica induzida pelo PCV2 sozinho ou por outros fatores, como desencadeantes do desenvolvimento da PMWS. Lipopolissacarídeos (LPS) vêm sendo utilizados em trabalhos preliminares, na tentativa de reproduzir uma doença respiratória multifatorial induzida por vírus, por meio da inoculação de suínos ou com o vírus da PRRS (PRRSv) ou com o coronavírus respiratório suíno (PRCv) ( 189, 19 ). Resultados desses estudos demonstraram que o efeito imunomodulador dos LPS, visto como uma expressão gênica de certas citocinas pró-inflamatórias, foi considerado correlato com a forma clínica da doença. Adicionalmente, outro estudo realizado por Chang et. al. em 26 demonstrou que os LPS foram capazes de induzir, in vitro, a regulação ascendente da replicação do PCV2 em macrófagos suínos de origem pulmonar. A nossa intenção, com o presente trabalho, foi a de obter uma percepção mais profunda da resposta imune gerada na infecção pelo PCV2, por meio do estudo em suas formas inata e adaptativa, em animais inoculados experimentalmente, PCV-2 - IFN - γ - SC/milhões PBMC PCV-2 - IFN - γ - SC/milhões PBMC A tanto com o PCV2 sozinho como em combinação com os LPS, imunoestimulantes em potencial. Os parâmetros avaliados foram usados para estabelecer um modelo de referência, para ser comparado mais tarde com os eventos que ocorrem no decurso da PMWS. Materiais e métodos Desenho experimental B Todos os detalhes relativos à origem e ao alojamento dos animais, assim como as condições experimentais, Dias pós infecção Dias pós infecção IFN-γ ELISPOT IPMA Anticorpos neutralizantes PCV2 Q-PCR Figura 2.2.: Valores médios de células secretoras de IFN-γ-PCV2 (IFN-γ-PCV2-SC), anticorpos anti- IPMA (IPMA), anticorpos neutralizantes (NA) e viremia (Q-PCR) de grupos C (A) e D (B) inoculados com o PCV2, dos sete aos 29 dias PI (apenas suínos dos quais PBMC foi coletada estão incluídos). foram previamente descritos ( 53 ). Resumidamente, 54 leitões com uma semana de idade, nascidos de cesariana (identificados, em inglês, pela sigla CDCD), foram alocados nesse estudo. Eles foram distribuídos, ao acaso, em quatro grupos: A (n = 1), B (n = 8), C (n = 18) e D (n = 18). No grupo A, os suínos foram mantidos como controles não vacinados; no grupo B, foram inoculados por via intraperitoneal, com 5 μg/kg de LPS, originários da bactéria Salmonella thyphimurium (Sigma-Aldrich, L7261); no grupo C, os suínos foram inoculados com 1 5,2 doses infecciosas 5% (em inglês, TCID 5 ), produzidas em cultura de tecidos (células PK-15) do PCV Ano VI - nº 36/21 Suínos & Cia 33

3 Práticas Experimentais (GEP, em inglês) e com a aprovação do Comitê de Ética e Bem-Estar Animal da Universidade Autônoma de Barcelona. Estudos virológicos e sorológicos Determinação da carga viral: no soro, pela média de uma prova de PCR quantitativa (Q-PCR) ( 128 ); no tecido, usando o processo ISH (hibridização in situ) ( 155 ). Respostas humorais ao PCV2 foram acessadas por meio de um teste de IPMA (prova de imunoperoxidase em monocamada) e de neutralização viral (VNT, em inglês), como descrito anteriormente ( 154 ). cepa Burgos (1 ml por via oral e 1 ml por via nasal); e no grupo D, os suínos receberam, simultaneamente, PCV2 e LPS nas mesmas dosagens descritas anteriormente. Com o objetivo de se estudar os eventos característicos dos estágios iniciais da infecção, foram sacrificados e sequencialmente necropsiados 32 leitões durante os primeiros oito dias do experimento, para a coleta de tecidos, amostras de soro e PBMC (células mononucleares do sangue periférico). Os suínos restantes foram acompanhados durante o período experimental, tendo sido sangrados nos Grupo Inóculo Dose dias zero, 7, 14, 21 e 29 pós-inoculação (pós-infecção), para coleta de soro (todos eles) e PBMC (células mononucleares do sangue periférico) [dois de cada grupo controle (A e B) e cinco de cada grupo inoculado com o PCV2 (C e D)]. Durante o período experimental, os sinais clínicos foram monitorados diariamente, e os suínos foram pesados três vezes por semana, até o 29 dia pós-infecção (eutanásia). A Tabela 2.1, a seguir, resume o desenho experimental. O cuidado com os animais, atividades e procedimentos do estudo foram conduzidos de acordo com o guia de Boas Tabela 2.1. Resumo do desenho experimental Dias pós infecção N de suínos examinados por dia A MME* 2 ml B C D LPS PCV2 PCV2 + LPS 5 µg/ kg ,2 TCID B + C Nº total de suínos * Meio Mínimo Essencial Dias pós inoculação Figura 2.1.: Níveis de IFN-α (pg/ml) detectados no plasma, expressos como média ± desvio padrão (em inglês, S.D.) de suínos positivos em cada grupo experimental (A a D), de zero a 29 dias pósinfecção. O número de suínos positivos em cada ponto de tempo está indicado. Determinação do perfil das citocinas ex vivo Os níveis de IFN-α, IL-1, IL-1β, IL-8 e TNF-α (fator de necrose tumoral alfa) das amostras de plasma foram examinados por meio de métodos de captura ELISA, utilizando anticorpos disponíveis comercialmente (anticorpos anti-ifn-α, da PBL Biomedical Laboratories, Piscataway/NJ, EUA; anti-il-1β, anti-il-8 e anti- TNF-α, da R&D Systems, Espanha e anti-il-1, da Biosource, Espanha). Para cada ELISA, o valor de corte foi calculado como sendo a média da densidade óptica dos controles negativos, mais três desvios-padrão. As concentrações das citocinas foram determinadas por regressão linear composta pelas densidades ópticas dos padrões de citocinas usados em cada teste. Determinação do perfil das citocinas in vitro PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foram separados do sangue total por meio de centrifugação por gradiente de densidade, utilizando-se para tanto o Histopaque 1.77 (Sigma- Aldrich). Células foram cultivadas por 2 horas, a 37 C, em 5% de CO 2 (5 1 5 células/poço), na presença do PCV2 [multiplicidade de infecção ou m.o.i. (em inglês), à base de,1 TCID 5 /célula], de PHA (polímero do tipo poli-hidroxialcanoato) a 1μg/mL ou foram estimuladas por simulação com o sobrenadante de cultivo 34 Suínos & Cia Ano VI - nº 36/21

4 de células PK-15 não infectadas. Os cultivos foram realizados, pelo menos, em triplicata, e os sobrenadantes correspondentes aos mesmos, animal e estímulo, foram misturados para a análise. Foram executadas provas de ELISA de captura para IFN-γ (BD, Madri/Espanha), IL-2, IL-4 e IL-1 (Biosource, Espanha), tendo as concentrações de citocinas sido calculadas como já explicado anteriormente. As frequências de PCV2-IFN-γ- SC (células secretoras interferon-gama) em PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foram determinadas por ELISPOT (spot de imunoadsorção enzimática) aos 7, 14, 21 e 29 dias PI, por meio do uso de anticorpos monoclonais (mabs) comerciais (kits Swine IFN-γ Cytosets, Biosource, Espanha), de acordo com um protocolo previamente descrito ( 39 ). Resumidamente, placas de poliestireno de fundo chato com 96 poços (Costar 359, Corning, EUA) foram cobertas com anticorpos anti-ifn-γ, na proporção de 8,3 μg/ml, em tampão carbonato-bicarbonato (ph 9,6), e mantidas assim durante toda a noite. As placas foram lavadas três vezes com tampão fosfato salino (PBS) e preenchidas com PBS contendo 1% de soro fetal bovino (FBS), por uma hora, a 37 C. Após a remoção da solução bloqueadora, 1 μl contendo PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foram depositados por poço e foi realizada a estimulação, ou pelo PCV2 (m.o.i. =,1), PHA (1μg/mL) ou por simulação, durante 2 horas, a 37 C e na presença de 5% de CO 2. Células foram removidas e poços foram incubados por uma hora, a 37 C, com 5μL de anticorpos conjugados à biotina (recurso utilizado para aumentar a sensibilidade em ensaios imunológicos) a 2,5 μg/ml, em PBS contendo,5% de Tween 2 e,5% de soro-albumina bovina (PBS-T-BSA). Após três enxágues com PBS-T as placas foram incubadas por uma hora com Streptavidin-horseradish peroxidase ou HRP (Biosource, Espanha), à base de,5 μg/ml em PBS-T-BSA e, finalmente, o 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine (TMB) azul (Calbiochem, Espanha) foi utilizado para revelar a reação. PCV2-IFN-γ-SC foi calculado pela subtração do número de manchas contadas nos poços submetidos à simulação das manchas presentes nos poços estimulados pelo PCV2. Os resultados foram expressos como número de IFN-γ-SC por milhão de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico). Determinação do subconjunto de leucócitos Os subconjuntos de PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foram caracterizados, do ponto de vista fenotípico, por meio da citometria de fluxo para células CD3 + (BD #559582), CD4 + (BD #12516), CD8 + (Southem Biotec #452-9), CD21 + (Southem Biotec #453-2) e SWC3/CD172a (Southem Biotec #4525-9). 5 μl de uma suspensão de células ajustada para células/ml em um meio para citometria de fluxo (FCM, em inglês) com PBS contendo,1% de BSA, foi semeado em uma placa de 96 poços e incubado durante 3 minutos com 5 μl de cada mab, seguido por dois enxágues com FCM. Com exceção das CD21 +, que já estavam conjugadas com isotiocianato de fluoresceína, (FCM) e das CD8 + e SWC3, conjugadas com ficoeritrina (PE, em inglês), uma Ig-FITC antirroedor, de origem leporina (Dako, Dinamarca), foi usada como um anticorpo secundário. Finalmente, as PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) foram enxaguadas duas vezes em FMC contendo,3% de paraformaldeído. A análise foi realizada utilizando-se um citômetro de fluxo EPICS_XL MCL (Beckman- Coulter, EUA). Foram usados isótipos de anticorpos pareados irrelevantes, como controles de fundo. Análise estatística A análise estatística usada para comparar as médias dos diferentes parâmetros entre grupos foi realizada pela metodologia do modelo linear geral (GLM), por meio do software SAS 9.1 (SAS Institute Inc., Cary, North Carolina/EUA). Quando nenhuma diferença atribuída ao efeito dos LPS era detectada, os dados eram analisados considerando a inoculação do PCV2 como a única variável classificatória, sendo os grupos A+B considerados controle, e os grupos C+D inoculados com o PCV2. O nível de significância (α) foi fixado como,5. Resultados Achados clínicos e patológicos Detalhes sobre dados clínicos e patológicos poderão ser vistos em Fernandes et. al. (27). No final do estudo (dia 29 PI), os grupos inoculados com o PCV2 demonstraram baixa média de peso corporal (6,6 ± 2,3 kg no grupo C e 6,6 ± 2,7 no D), comparados com os grupos controle (8, ± 1,72 kg no grupo A e 7,5 ± 1,6 no B), p <,5. Entretanto, nenhum dos suínos desenvolveu sinais clínicos compatíveis com a PMWS durante a totalidade do estudo. Um dia PI (pós-infecção), todos os suínos que receberam os LPS (grupos B e D), tiveram temperatura corporal (medida pela via retal) significativamente mais alta, comparado com os grupos A e C (39,2 ±,9 vs 38,4 ±,4; p <,1); daí em diante não se observou diferença na temperatura retal entre os grupos. Com relação a estudos patológicos, animais sacrificados entre os primeiros 8 dias PI (pós-infecção) não tinham lesões, tampouco vírus detectáveis nos tecidos, pela prova de ISH. Em contraste, dos 2 suínos necropsiados no final do estudo (dia 29 pós-infecção), 9/12 animais inoculados com o PCV2 demonstraram a presença de lesões suaves, semelhantes às causadas pelo PCV2 no tecido linfóide, associadas a quantidades baixo-moderadas de DNA de PCV2 nas mesmas, de acordo com a prova de ISH (5/6 no grupo C e 4/6 no grupo D). Viremia e resposta humoral ao PCV2 Resultados de Q-PCR demonstraram que o DNA do PCV2 surgiu, primeiramente, no soro de suínos inoculados com o PCV2 ao redor do 7 dia PI (pósinfecção), com o aumento dos títulos até o dia 14 PI (pós-infecção) no grupo C (6,4 1 5 ± 1,3 1 5 cópias virais/ml) e o dia 21 PI (pós-infecção) no grupo D (1,3 1 6 ± 2,8 1 5 cópias virais/ml), p <,5. Suínos não inoculados com o PCV2 permaneceram livres do vírus durante todo o estudo. O desenvolvimento da resposta humoral iniciou-se nos suínos inoculados com o PCV2 (grupos C e D), com o surgimento dos anticorpos detectados na prova de soro-neutralização (IPMA), principalmente entre 7 e 14 dias PI (pós-infecção), com o aumento dos títulos até o dia 29 PI (pós-infecção) (média de título de IPMA = 1,3 ± 1,2 log 2 ). A soroconversão para anticorpos neutralizantes (NA) ocorreu entre 21 e 29 dias PI (pós-infecção), com um título médio de 5, ± 1,1 log 2. Não 36 Suínos & Cia Ano VI - nº 36/21

5 foram observadas diferenças entre os grupos C e D relativas a títulos detectados por IPMA e NA. Respostas às citocinas ex vivo No dia 1 PI (pós-infecção) todos os leitões inoculados com o PCV2 tiveram um aumento transitório de IL-8 no soro (3/3 no grupo C: 17 ± 38 pg (picogramas)/ml e 3/3 no grupo D: 2 ± 23 pg/ ml), ao passo que os controles não inoculados permaneceram negativos. Durante o tempo em que a IL-8 baixou, os níveis de IFN-α começaram a ser detectados no soro de suínos inoculados com o PCV2. Deste modo, no segundo dia PI (pós-infecção), um animal do grupo C e um do grupo D eram positivos para essa citocina e, no quinto dia PI (pós-infecção), o soro de todos os suínos inoculados com o PCV2 tinha IFN-α detectável (3/3 no grupo C: 151 ± 12,7 pg/ml e 3/3 no grupo D: 149,7 ± 39,1 pg/ml). Subsequentemente, resultados positivos foram detectados apenas esporadicamente (Figura 2.1.). Com relação à detecção da IL- 1 no soro, somente um animal (nº.51) do grupo C foi positivo (dia 7 PI (pósinfecção); 154 pg/ml). Para a IL-1β e a THF-α, a maioria dos leitões foi negativa e essas citocinas eram detectadas apenas esporadicamente, não obstante o status da inoculação (dados não mostrados). Respostas às citocinas in vitro Após o tratamento in vitro da PBMC (células mononucleares do sangue periférico) com o PCV2 não foi observada nenhuma indução em IL-2, IL-4 ou IFN-γ. Por outro lado, os níveis de IL-1 detectados em sobrenadantes de PBMC (células mononucleares do sangue periférico) estimuladas com o PCV2 foram significativamente mais altos que os detectados em cultivos submetidos à simulação (p <,1). De fato, a IL-1 liberada induzida pelo vírus foi observada em todos os dias de coleta, sem diferenças entre os tratamentos, embora resultados individuais demonstrem certa variação no interior do mesmo grupo, ao longo do estudo. Deste modo, no grupo A, 9/1 suínos foram detectados como positivos (variação de 17,2-273,9 pg/ml), 8/8 no grupo B (variação de 19,3-194,4 pg/ml), 16/18 no grupo C (variação de 13,1-298,3 pg/ml) e 15/18 no grupo D (variação de 36,3-282,4 pg/ml). O desenvolvimento de IFN-γ- SC (células secretoras interferon-gama) PCV2 específico foi observado apenas nos grupos inoculados com o PCV2 (C e D), tendo sido iniciado, principalmente, entre 14 e 21 dias PI (pós-infecção). Desse modo, no dia 21 PI (pós-infecção), 4/5 suínos do grupo C e 3/4 do grupo D foram positivos, com frequências médias de 77 ± 3 e 84 ± 49 IFN-γ-SC (células secretoras interferon-gama) PCV2 por milhão de PBMC (células mononucleares do sangue periférico) (p >,5), respectivamente. No dia 29 PI (pós-infecção) todos os suínos estavam positivos (média IFNγ-SC (células secretoras interferon-gama) PCV2 de 73 ± 3 e 59 ± 49 nos grupos C e D, respectivamente; p >,5). A Figura 2.2. mostra valores médios de IFN-γ-SC (células secretoras interferon-gama) em suínos inoculados com o PCV2 (grupos C e D), juntamente com a média dos títulos de anticorpos anti-pcv2 e da viremia. Determinação do subconjunto de leucócitos Nas análises de citometria de fluxo, a maioria das mudanças na proporção relativa dos subconjuntos celulares foi esporádica e transitória, não podendo ser atribuída aos tratamentos recebidos. De qualquer modo, suínos infectados pelo PCV2 demonstraram um decréscimo nas proporções relativas das células CD4 + SwC3 + (,3 ±,2 vs 1,1 ±,4; p <,1), do mesmo modo que nos linfócitos CD4 + CD8 + (3,5 ±,8 vs 5,9 ± 1,9; p <.1) nos dias 14 e 21 PI (pós-infecção), respectivamente, comparado com suínos livres de PCV2. Adicionalmente, uma mudança nas células CD21 + foi observada nos grupos inoculados com o PCV2, comparativamente aos grupos controle nos mesmos dias (1,7 ±,7 vs 3,3 ± 1,; p <,5 e 2,1 ±,7 vs 3, ±,5; p =,56 respectivamente). No dia 29 PI (pós-infecção) aquelas diferenças desapareceram. Discussão A patogenia da PMWS ainda não é totalmente compreendida, não havendo um parâmetro isolado ou grupo de parâmetros que possam ser usados como prognosticadores confiáveis do desenvolvimento da doença. Relatos anteriores sugeriam que a interação do complexo hospedeiro-vírus e a resposta imune gerada subsequentemente poderiam ser determinantes críticos para o entendimento da doença ( 123,176,194 ). Em nosso estudo tentamos caracterizar alguns dos parâmetros das respostas imune inata e adaptativa contra o PCV2, em animais que passam pela infecção sem desenvolver sintomas clínicos. Até agora, embora a reprodução da PMWS tenha sido possível com a utilização de vários modelos experimentais ( 188 ), nenhum deles tem conseguido reproduzir o problema de modo consistente em suínos convencionais. Entre eles, o uso de imunoestimulantes e de co-infecções, seguidos da infecção pelo PCV2 é aparentemente a estratégia mais bem-sucedida para reproduzir experimentalmente a doença clínica, sugerindo a ativação do sistema imunológico como um fator desencadeante em potencial para a PMWS ( 188 ). No presente estudo, o efeito da imunoestimulação no decurso da infecção pelo PCV2 foi avaliado em leitões CDCD com uma semana de idade, por meio da injeção dos mesmos com LPS, simultaneamente à inoculação oronasal do PCV2. Embora os LPS tenham sido considerados como detentores de um efeito positivo na replicação da infecção causada pelo PCV2 nos macrófagos pulmonares ( 22 ), nossos dados revelaram um efeito não significativo do LPS na evolução da infecção causada pelo PCV2 e nos parâmetros imunológicos avaliados durante o experimento. Esses resultados sugerem que a replicação viral induzida pelo LPS relatada in vitro aparentemente não ocorra in vivo, ou não seja suficientemente extensiva para desencadear a PMWS, sob as atuais condições experimentais. Contudo, estudos adicionais do tipo efeito local do LPS nos tecidos-alvo do PCV2 deveriam ser conduzidos, no sentido de concluir o assunto, uma vez que não foi detectada a indução significativa de citocinas pró inflamatórias, atribuída ao LPS. Com relação à resposta imune inata contra o PCV2, o evento mais imediato detectado a seguir da infecção pelo PCV2 foi um aumento na IL-8 em nível sérico (dia 1 PI (pós-infecção). A habilidade do PCV2 em induzir a produção de IL-8 nos macrófagos alveolares ou PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) dos suínos havia sido relatada previamente ( 31, 21 ) e combina com a natureza inflamatória dos lesões usualmente vista em animais infectados pelo PCV2. Ano VI - nº 36/21 Suínos & Cia 37

6 No presente estudo, outras citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-1β ou a TNF-α não foram detectadas no soro, em um modelo consistente. Entretanto, o fato dessas citocinas não terem sido detectadas no plasma não as exclui de ter uma participação importante nas fases iniciais da infecção, pois elas poderiam ter tido uma atuação local (no sítio da replicação viral) sem, entretanto, ter atingido níveis altos o suficiente para serem detectadas no soro. Em contraste, uma resposta IFN-α foi observada em suínos inoculados com o PCV2, no dia 5 PI (pósinfecção). A IFN-α é considerada uma citocina crucial para a defesa antiviral do hospedeiro, estando envolvida não apenas na resposta inata, mas também na regulação da resposta imune adaptativa, gerada frente a uma infecção viral. De fato, a habilidade de antagonizar respostas mediadas pela IFN-α por caminhos distintos e, por meio disso, interferir no mecanismo imunológico do hospedeiro, tem sido relatada no caso de várias viroses ( 57 ). No caso do PCV2, estudos recentes mostraram que o vírus ou estruturas PCV2-CpG (oligo deoxinucleotideos) podem inibir ou induzir as respostas IFN-α ( 193, 2 ) dependendo do subconjunto de células envolvido e da estrutura dos CpGs. Vincent et. al. (27) relatou que o PCV2 seria capaz de bloquear a indução IFN-α nas NIPC (células naturalmente produtoras de interferon), sugerindo a atividade imunomoduladora do PCV2 como sendo um evento chave na patogenia da PMWS. A esse respeito, aqueles animais que passam pela infecção sem desenvolver sintomas clínicos estariam aptos a neutralizar a atividade inibitória do PCV2, provavelmente por meio de fortes respostas inatas. Em nosso estudo, a detecção de IFN-α no soro de todos os suínos inoculados com o PCV2, nos estágios iniciais da infecção, indicou a geração do desenvolvimento de uma resposta imune inata contra o vírus. O fato de não terem sido encontrados genomas de PCV2, tampouco lesões associadas ao PCV2 nos tecidos dos suínos necropsiados inicialmente, pode ser atribuído à habilidade do PCV2 em persistir nas células de linhagem monocíticas sem promover replicação ativa ( 193 ) e, então, não ser detectado pela técnica padrão HIS. Esses resultados somados ao fato do PCV2 ser conhecido como mediador da inibição da capacidade de resposta das NIPC sugerem que o equilíbrio entre a habilidade do hospedeiro em montar uma resposta inata antiviral apropriada e a habilidade viral em deprimi-la, pode ser determinante para a evolução da infecção e o desencadeamento da doença. Níveis elevados de IL-1 no soro foram detectados somente em um suíno inoculado com o PCV2, no dia 7 PI (pósinfecção). Contrastando com esse fato, resultados in vitro mostraram uma indução da liberação de IL-1, em resposta ao estímulo do PCV2 junto ao PBMC (células mononucleares do sangue periférico). Esse fato ocorreu independentemente do tratamento administrado aos animais. O envolvimento da IL-1 na patogenia da PMWS tem sido sugerido em vários estudos. Darwich et. al. (23b) encontrou uma super-expressão de IL-1 mrna no timo de suínos afetados pela PMWS, em correlação com lesões linfóides. A avaliação do perfil de citocinas em amostras de sangue de suínos inoculados experimentalmente com o PCV2 também mostrou uma associação entre níveis plasmáticos elevados de IL-1 e o desenvolvimento da PMWS ( 176 ). In vitro, o PCV2 tem demonstrado a capacidade de induzir a secreção de IL-1 em cultivos de PBMC, os quais, sucessivamente, levam à repressão de outras citocinas ( 82 ). Todos juntos, esses dados indicam que a habilidade do PCV2 em induzir IL- 1 poderia contribuir para a condição de imunossupressão observada no decurso da PMWS. Em nosso estudo, nenhum dos suínos desenvolveu sinais clínicos, e a viremia diminuiu no 29º dia, menos em um deles (nº.51). É interessante ressaltar que esse animal foi o único a ter IL-1 detectável no soro. Esses resultados sugerem que alguns suínos aqueles que controlam a progressão da infecção poderiam neutralizar a habilidade do PCV2, de induzir a liberação de IL-1. Com relação às respostas adaptativas, anticorpos IPMA anti-pcv2 surgiram ao redor do 14º dia PI (pós-infecção), enquanto os NA (anticorpos neutralizantes) apareceram de sete a 14 dias mais tarde. O desenvolvimento atrasado ou ineficaz da imunidade mediada por anticorpos anti-pcv2 havia sido previamente correlacionado com o alto nível de replicação 127, 123, do vírus e efeito da doença clínica ( 54 ). Entretanto, certo atraso na resposta neutralizante tem sido observado também em suínos infectados subclinicamente pelo PCV2, nos quais a PMWS não se desenvolveu ( 54 ). A análise citométrica indicou que suínos infectados sofreram um decréscimo nas células CD4 + SwC3 +, CD4 + CD8 + e CD21 + aos 14 e 21 dias PI (pós-infecção), tendo estes valores voltados à normalidade no final do estudo. Mudanças nos subconjuntos de PBMC (células mononucleares do sangue periférico), em suínos que não desenvolveram a doença, haviam sido previamente relatadas ( 33, 126 ) e diferem daquelas observadas em suínos afetados pela PMWS ( 126 ); enquanto que a leucopenia observada nos suínos infectados subclinicamente parece ser transitória, a leucopenia nos animais afetados pela PMWS aparece mais cedo, é mais forte e está correlacionada ao surgimento da doença clínica. A regra para os mecanismos de defesa celular específicos, na provisão da proteção contra a PMWS, ainda não foi elucidada. Nesse nosso estudo descrevemos pela primeira vez o desenvolvimento do IFN-γ-SC, em resposta à infecção pelo PCV2. O IFN-γ é considerado uma citocina chave para a polarização do Th 1 ; por meio do controle da diferenciação das células T CD4 ainda não expostas ao antígeno (em inglês, naïve CD4 T cells) para efetores Th 1, essa citocina media a imunidade celular contra infecções virais. Ainda nesse estudo, o desenvolvimento da IFN-γ-SC em resposta à infecção subclínica de animais pelo PCV2 iniciou-se na maioria das vezes entre 14 e 21 dias PI, tendo sido coincidente com o decréscimo da carga viral no sangue de todos os suínos, exceto um deles. Nossos resultados sugerem que as respostas mediadas por células, mensuráveis como IFN-γ-SC, possam também contribuir juntamente com o desenvolvimento dos PCV2 NA (Anticorpos neutralizantes) com a derrota do PCV2. Concluindo, os resultados desse estudo sugerem que, no caso de suínos infectados pelo PCV2, uma resposta precoce de IFN-α juntamente com o desenvolvimento do IFN-γ-SC e dos NA anti-pcv2 possam ser prognosticadores adequados da evolução da infecção pelo PCV2, os quais deveriam ser explorados em experimentos com o objetivo de elucidar mecanismos que possam ser a razão das diferentes consequências clinicas da referida infecção nos suínos. Referências Bibliográficas estão disponíveis no site: 38 Suínos & Cia Ano VI - nº 36/21