Alessandra Navarini. Comparação entre diferentes métodos laboratoriais para avaliação de. susceptibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus

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1 Alessandra Navarini Comparação entre diferentes métodos laboratoriais para avaliação de susceptibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde São Paulo 2014

2 Alessandra Navarini Comparação entre diferentes métodos laboratoriais para avaliação de susceptibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Marcelo Jenne Mimica São Paulo 2014

3 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Navarini, Alessandra Comparação entre diferentes métodos laboratoriais para avaliação de susceptibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus./ Alessandra Navarini. São Paulo, Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Marcelo Jenné Mimica 1. Staphylococcus aureus 2. Resistência à vancomicina 3. Triagem/métodos 4. Estudo comparativo BC-FCMSCSP/19-14

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5 DEDICATÓRIA Dedico esta tese de Doutorado a mim mesma. Lutadora, guerreira, sonhadora e que nunca, em nenhum momento, perdeu a Fé em DEUS

6 AGRADECIMENTOS Agradeço: À Deus, Que plantou em mim sonho que hoje está se concretizando. Ao Cláudio Meu marido, por toda cumplicidade, amor, dedicação e a oportunidade que me deu de ser mãe. A sua presença é luz e vida. À Minha filha Maria Eduarda, Sempre será o maior presente de Deus! Que ilumina minha vida e que me dá mais ainda força de vencer qualquer obstáculo. Meu Sonho, minha Esperança e minha grande Vitória! Aos meus Pais, por ter me dado a vida. À minha mãe Susete Redondo, pelo magnífico esforço, durante sua vida, com ensinamentos de honestidade, integridade e dignidade. Ao meu Pai Darcio Navarini, uma lição de vida, o tempo pode passar, podemos ficar distantes, mas laços familiares e o amor nunca se acabam e um dia amor volta a florescer. À minha família, com muito carinho aos meus tios, primos, sogra e cunhados por acreditarem que conseguiria vencer todos os obstáculos. Em especial aos meus primos que tenho carinho como se fossem meus filhos, Gabriel Redondo Lima Camargo e Vinícius Redondo Lima Camargo.

7 AGRADECIMENTOS Agradeço: Ao meu querido orientador Prof.Dr.Marcelo Jenne Mímica. Uma dedicação exemplar na orientação e na amizade. E muito obrigada pela sua presença imprescindível nas horas mais difíceis da realização desta tese. Aos meus mestres, Prof.Dr.Igor Mímica, Profa.Dra.Lycia Mara Jenne Mímica e Profa.Dra Marines Dalla Valle Martino por terem me mostrado o caminho extraordinário que é a microbiologia. Aqueles que quando deveriam ser simplesmente professores, foram mestres, nos transmitido seus conhecimentos e experiências; que, quando deveriam ser mestres foram amigos e sua amizade me incentivou a seguir o melhor caminho. Ao Prof.Dr.Waldemar Francisco, pelos ensinamentos e apoio constante. Ao Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, em especial Profa.Dra. Wilma Neves Forte e meu muito obrigada por fazer parte desde grupo. À Disciplina de Microbiologia, Faculdade Ciências Médicas Santa Casa de São Paulo em especial à Profa.Dra Helena Muller minha fiel amiga e que compartilhou cada momento final da escrita do meu trabalho. Á Profa Dra Suely Ueda e Profa.Dra. Rozane de Carvalho muito obrigada por sempre terem boas explicações para minhas dúvidas. Às minhas amigas e companheiras de convívio diário do Laboratório e da Disciplina de Microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo que me ajudaram em toda parte prática da tese: Em especial

8 Suzethe Sasagawa e Lilian de Souza. Maria Felipe da Silva e Maria José Soares Guedes muito obrigada por serem tão prestativas. À minha amiga e comadre Cely Barreto da Silva, o meu eterno agradecimento por ter dado oportunidade trabalhar Santa Casa De Misericórdia que era meu sonho. E por tanto tempo compartilhando por este caminho tão difícil, superando todos os obstáculos e compartilhando felicidades. Aos meus queridos amigos Dr.Thiago Sinsly Sampaio Camargo, Prof.Dr.João Marcelo Guedes, Prof.Dr.Irineu Massaia, Adenilde Andrade Silva, Cristina Garcia e Maria Aparecida Genaro da Silva, pela amizade incondicional. Aos meus amigos Serviço de Controle de Infecção Hospitalar da Santa Casa de São Paulo e ao Laboratório Central, por serem prestativos e companheiros. À amiga Sadia Mustaffa pela delicadeza no atendimento para elaboração ficha catalográfica, e revisão das referências bibliográficas. À Secretaria geral do curso de pós-graduação em especial a secretária e amiga Mirtez Dias de Souza, pela forma gentil com que sempre me receberam. A toda equipe da Creche Dona Antonieta Altenfelder, Pelo cuidado e dedicação à minha querida filha Maria Eduarda, enquanto estou trabalhando e desenvolvendo minhas pesquisas e término desta tese. À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, que me deram oportunidade de poder desenvolver toda minha habilidade profissional. A todos os amigos que me acompanharam em toda essa minha jornada e que fizeram esta vida valer cada vez mais a pena. Muito obrigada!

9 Sonhar, viver... E Todo dia Agradecer... E rezar, para você ser a última a morrer... ESPERANÇA... (Aliados)

10 LISTA DE ABREVIATURAS MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus.staphylococcus aureus resistente à meticilina. MSSA: methicillin-susceptible Staphylococcus aureus.staphylococcus aureus sensível à meticilina. CA-MRSA: community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus.staphylococcus aureus resistente à meticilina (oxacilina) adquirido na comunidade. HCA-MRSA: healt care-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus.staphylococcus aureus resistente à meticilina associado aos serviços de saúde. HCA-MSSA: healt care-associated methicillin-susceptible Staphylococcus aureus.staphylococcus aureus sensível à meticilina associado aos serviços de saúde. CIM: Concentração inibitória mínima. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute. PBP: penicillin binding protein/ proteína ligante de penicilina. SCCmec: Staphylococcal cassete chromosome MEC. VISA: vancomcycin-intermediate Staphylococcus aureus/ Staphylococcus.aureus com resistência intermediária à vancomicina. VRSA: vancomcycin-resistant Staphylococcus aureus/ Staphylococcus aureus resistente à vancomicina.

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Número de cepas que apresentaram crescimento em placas de BHI com diferentes concentrações de vancomicina de acordo com os resultados da microdiluição e do Etest (mg/l) Tabela 2. Comparação entre resultados da microdiluição e Etest

12 SUMÁRIO DEDICATÓRIA I AGRADECIMENTOS II LISTA DE ABREVIATURAS VI LISTA DE TABELAS VII 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS CASUÍSTICA E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO ANEXOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 35 RESUMO 40 ABSTRACT 42 APÊNDICE 44

13 1 - INTRODUÇÃO Staphylococcus aureus, um dos microrganismos comuns no ambiente hospitalar e na comunidade, é catalase positiva, diferenciando-se de outras espécies, e é um importante patógeno para os humanos (1). Os Staphylococcus são células esféricas Gram-positivas que geralmente se dispõe em cachos irregulares. O gênero é constituído por pelo menos 30 espécies, sendo as de maior importância no ambiente hospitalar os Staphylococcus aureus, S. saprophyticus e S. epidermidis (1). Essas bactérias são encontradas no solo, na água e em produtos derivados de animais, como queijo, ovos, carne e leite. Entretanto, habitam mais frequentemente pele, glândulas da pele e regiões membranosas de mamíferos e pássaros, muitas vezes também encontradas na boca, nas glândulas mamárias e nos tratos gastrointestinal, urinário e respiratório alto. São muito resistentes ao meio ambiente. Podem também, após meses, ser isoladas em secreções orgânicas ressecadas. São mortas rapidamente pela exposição aos desinfetantes, como clorexidina e fenóis sintéticos, e pelo calor a 60ºC por 30 minutos (2). As infecções causadas por S. aureus podem se localizar na pele ou em regiões mais profundas. Quando na pele recebem diferentes designações, tais como foliculite, furunculose, carbúnculo e impetigo, de acordo com a localização e outras características. O hordéolo ou terçol é a infecção de uma glândula sebácea marginal das pálpebras (3). Em indivíduos debilitados por doenças crônicas, traumas físicos, queimaduras ou imunossupressão, esse microrganismo pode causar 1

14 infecções de caráter mais grave (3,4). Entre as infecções profundas destacamse a osteomielite, a bacteremia (frequentemente associada a abcessos metastáticos), a endocardite, a pneumonia e, ocasionalmente, a meningite e a artrite bacteriana (3,4). Além dessas infecções, o S. aureus pode causar vários tipos de intoxicações, seja na vigência de um processo infeccioso ou não. A primeira possibilidade pode ser exemplificada pela síndrome da pele escaldada ou doença de Ritter. As intoxicações que ocorrem na ausência de processos infecciosos são de dois tipos: intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico (5,6). Em uma população normal, aproximadamente 30-40% dos indivíduos sem doença de base e sem relação com o ambiente hospitalar carreiam grande número de Staphylococcus aureus como parte de sua microbiota (7). Adicionalmente, são considerados os principais agentes de infecções hospitalares. O microrganismo pode ser encontrado em várias partes do corpo como fossas nasais, garganta, intestino, pele, cavidade nasal e mãos (8-10). A capacidade de colonizar, multiplicar e invadir a superfície epitelial e mucosa do hospedeiro e a habilidade de sobreviver no meio ambiente contribui para o sucesso da colonização e disseminação das amostras de MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (11). Vários são os fatores de risco descritos para a colonização ou infecção por MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) hospitalar: tempo prolongado de hospitalização ou pacientes admitidos no hospital durante surtos de infecções por MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus); uso prévio de antimicrobianos; internações em UTIs ou em unidade 2

15 de queimados; doença de base crônica; exposições a profissionais ou a pacientes colonizados; cirurgia e uso de procedimentos invasivos (12-14). Staphylococcus aureus tem ocupado lugar de destaque na etiologia das infecções hospitalares e sua alta versatilidade em adquirir resistência aos antimicrobianos tornou-se uma preocupação universal (15). No Brasil estudos têm demonstrado prevalência de infecções hospitalares por S. aureus variando entre 17% a 26 % e aproximadamente 70% são causadas por amostras multirresistentes (15,16). aureus 1.1. Evolução da resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus Antes da introdução dos antimicrobianos na prática clínica, a letalidade da bacteremia por S.aureus ultrapassava 80%, e mais de 70% dos pacientes desenvolviam infecções metastáticas (17). No início da década de 40, com a introdução da penicilina, o prognóstico destes pacientes melhorou bastante (17,18). No entanto, já em 1942 foram relatadas cepas de cepas de S.aureus resistentes à penicilina, através da produção de beta-lactamases,enzimas predominantemente extracelulares que possibilitam a hidrólise do anel beta-lactâmico (18). A resistência à penicilina foi reconhecida e cresceu antes em cepas hospitalares e depois na comunidade, sendo que no final dos anos 60 as taxas de resistência tanto hospitalares como comunitárias chegavam a 90% e 70% respectivamente em alguns lugares da Europa (19). Atualmente, a imensa maioria dos S.aureus que causam infecção ou simplesmente colonizam adultos saudáveis são resistentes à penicilina (20). 3

16 Este padrão de evolução da resistência, primeiro nos hospitais e depois na comunidade é hoje um padrão conhecido que recorre a cada introdução e uso de um antimicrobiano na prática clínica. E a evolução da resistência à oxacilina guarda grande similaridade com este padrão (21). Em 1959 o isolamento do ácido 6-aminopenicilânico tornou possível a produção de penicilinas semi-sintéticas. Modificações na cadeia deste precursor da penicilina resultarem em proteção do anel betalactâmico contra a ação hidrólítica das beta-lactamases. Os primeiros destes agentes antimicrobianos disponíveis para uso clínico foram a oxacilina e a meticilina, que solucionaram temporariamente o problema causado pela resistência do S.aureus à penicilina (18). Porém, o uso destes agentes foi rapidamente seguido pelo surgimento de cepas resistentes já 1961 (18). A resistência à oxacilina no S.aureus requer a presença de gene localizado no cromossomo, o gene meca (17), gene responsável pela síntese das PBP2a (penicillinbinding protein 2ª), também chamada PBP2, que substitui as outras PBPs na membrana, e que têm baixa afinidade não só para oxacilina como também para outros antimicrobianos betalactâmicos. Desde então as taxas de resistência de S.aureus à oxacilina aumentaram vertiginosamente. No inicio os MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) estavam restritos a centros médicos de referência e hospitais terciários, mas logo se alastraram para serviços e centros de saúde menores. Estudos de vigilância recentes feitos em várias partes do mundo mostram prevalência variável de MRSA, dependendo do país, principalmente do hospital ou setor do hospital estudado. No entanto, o MRSA não pode ser considerado um patógeno relacionado exclusivamente às infecções relacionadas aos serviços de saúde. A partir dos anos 90 começaram os relatos de infecções por MRSA adquiridas na comunidade (CA- MRSA: community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus) em 4

17 pacientes sem fatores de risco identificáveis contato frequente, direto ou indireto com serviço de saúde que pudesse explicar a infecção por MRSA associado aos cuidados de saúde (HCA-MRSA: health-care associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus) (21-23). Das principais diferenças entre as cepas CA-MRSA e as associadas ao ambiente hospitalar (HA-MRSA), podemos destacar manifestações clínicas, em sua maioria associadas a infecções de pele e partes moles, além de muitos casos de infecções respiratórias e da corrente sanguínea. Outra característica extremamente importante é o perfil de resistência a antibióticos, pois, enquanto o HA-MRSA se caracteriza por uma ampla resistência a diversos antibióticos, as cepas CA-MRSA mostram uma sensibilidade (entre 85% e 100%) a drogas, como clindamicina, gentamicina, ciprofloxacina, sulfametazol/trimetoprim e vancomicina, mostrando-se resistente, em geral apenas à oxacilina e a outros betalactâmicos, além da eritromicina. (24, 25) O perfil de resistência diferenciado entre as cepas HAMRSA e CA-MRSA parece ser explicado pela distribuição e pelo tamanho dos cassetes cromossomiais que contêm o determinante de resistência à meticilina (SCCmec) (24,25). Entre os cinco tipos de SCCmec (I, II, III, IV e V), somente os tipos I, II e III são encontrados em cepas HA-MRSA, enquanto que os tipos IV e V podem ser observados em cepas CA-MRSA, nas quais o tipo IV é menor e, provavelmente, facilita a perda dos genes de resistência a diversos antibióticos, conservando-a para betalactâmicos. Outra característica importante do CA-MRSA é a presença dos genes lukf-pv e luks-pv, que codificam a leucocidina de Panton-Valentine (PVL), uma toxina capaz de induzir a destruição de leucócitos humanos e causar grande dano tecidual, sendo considerada um fator de virulência associado a infecções de pele primárias severas e pneumonias necrotizantes (24-26). 5

18 O combate às infecções provocadas pelas cepas de S. aureus resistentes aos glicopeptídios à vancomicina tem como alternativas terapêuticas as estreptograminas (quinupristina/dalfopristina), as oxazolidinonas, a glicilciclina (Tigeciclina ), além da associação de vancomicina com um antibiótico betalactâmico antiestafilocócico (27). As estratégias para o controle dessas cepas, por outro lado, incorporam as medidas profiláticas convencionais de combate às infecções em geral (lavagem das mãos uso de luvas e manipulação adequada de dejetos e secreções); vigilância epidemiológica; isolamento; uso racional dos glicopeptídios e tratamento dos pacientes infectados (28, 29). A opção tem sido, nas últimas décadas, principalmente a vancomicina. É um antimicrobiano da classe dos glicopeptídeos, que age ligando-se à porção terminal D-ala-D-ala dos precursores do peptideoglicano, inibindo assim a síntese da parede celular (30). Com aumento das taxas de resistências do Staphylococcus aureus à oxacilina, a prescrição de vancomicina tem sido cada vez mais frequente, muitas vezes de forma indiscriminada. Era uma questão de tempo para cepas resistentes a este antimicrobiano surgissem na prática clínica Staphylococcus aureus com resistência intermediárias à vancomicina (VISA) Em 1996 foi identificado no Japão o primeiro isolado de S.aureus com susceptibilidade reduzida à vancomicina (VISA:vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus). O primeiro VISA foi isolado de uma criança recebendo vancomicina devido a uma infecção de sítio cirúrgico esternal. O isolado não possuía o gen vana. A susceptibilidade reduzida desta cepa foi atribuída à presença de uma 6

19 parede celular mais espessa que habitual, contendo peptídeos capazes de se ligar à vancomicina impedindo sua ação (31,32). Outros isolados de VISA foram então relatados em várias parte do mundo (25), inclusive no Brasil (20). Atualmente as cepas são conhecidas como GISA (glycopeptide intermediateresistant S.aureus) e GRSA (glycopeptide-resistant Staphylococcus aureus) por também se mostrarem resistentes a teicoplanina, estando distribuídas em todo mundo, com baixa frequência, e seu aparecimento está associado aos tratamentos com o uso prolongado com glicopeptídeos (33). Estes isolados apresentavam algumas características peculiares, além de parede celular espessada: pareciam crescer forma mais lenta e não eram diagnosticados como resistentes pelo teste de disco-difusão com vancomicina (34). Porém resistência era detectada quando utilizados método de microdiluiçao em caldo e em placa de Agar para screening contendo 4 a 6 mcg/ml de vancomicina. O Critério do CDC para diagnosticar VISA era naquele momento, uma concentração inibitória mínima (CIM) de vancomicina de 8 a 16 mcg/ml microdiluição em caldo, 6 a 16 por Etest e crescimento na placa screening com Agar brain herat infusion suplementado com 6 mcg/ml de vancomicina. Se dois destes três parâmetros fossem positivos, o isolado era classificado como tendo susceptibilidade reduzida para vancomicina (28) Staphylococcus aureus com resistência vancomicina (VRSA) Em junho de 2002 o primeiro S.aureus com resistência plena à vancomicina (VRSA: vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) foi identificado em Michigan EUA (27). Foi primeiro caso conhecido de S.aureus resistente à vancomicina que possuía gene vana. Esta cepa foi obtida de material colhido do orifício de saída de 7

20 um cateter e de uma úlcera no pé, de um paciente em diálise. A CIM para vancomicina desta cepa era de 1024 mcg/ml cerca de 1000 vezes a CIM habitual da vancomicina para S.aureus. O mecanismo pelo qual esta cepa adquiriu o gene vana,tn 1546, de um Enterococcus faecalis resistente à vancomicina para S.aureus resistente à oxacilina (MRSA), que já possuía um plasmídeo codificando resistência à gentamicina e produção de beta-lactamase. O transposon foi incluído no plasmídio estafilocócico e o restante do plamídio enterocóccioco perdeu-se (35). Este novo plasmídeo manteve a capacidade de ser transmitido para outros Staphylococcus e de se expressar de forma plena a resistência à vancomicina (36). Centenas de culturas de vigilância foram realizadas pelo Departamento de Saúde coletiva de Michigan e pelo CDC em pacientes, profissionais de saúde, família e amigos que tiveram contato com paciente. Nenhuma foi positiva para VRSA (27). Dois meses depois um segundo foi isolado VRSA na Pennsylvania-EUA(CDC, 2002) e uma terceira de VRSA foi descrita em Nova Iorque-Eua depois de mais um ano e meio (CDC, 2004).O quarto, quinto e sexto foram isolados em Michigan, o último em janeiro de 2006 (37). Em junho 2012 foi isolado Staphylococcus aureus em São Paulo, o paciente apresentou reincidência do quadro de infecções de pele e tecidos moles e foi novamente tratado com antibiótico.foi colhida amostras de hemocultura e não houve crescimento (hemocultura negativa). O paciente continuou internado, devido à quimioterapia para tratar do câncer de pele. Em julho de 2012 foi isolada primeira cepa VRSA em São Paulo, em um paciente com infecção por MRSA e colonização VRE em tratamento com 8

21 vancomicina. Houve mais uma vez transmissão horizontal de uma cepa gene vana do VRE para MRSA que tornou-se VRSA (38) Diagnóstico laboratorial da susceptibilidade à vancomicina Estudos relatam discrepância entre os resultados dos testes de suscetibilidade a vancomicina e a resposta terapêutica. Os testes usados podem não detectar o aumento progressivo da concentração inibitória mínima (CIM) em alguns isolados. Quanto aos métodos laboratoriais para detecção de resistência, o CLSI modificou seus critérios para avaliação da susceptibilidade in vitro à vancomicina em Staphylococcus aureus em 2006 (30). Os novos pontos de corte de concentração inibitória mínima (CIM), uma diluição reduzidos em relação aos anteriores, refletiam evidências clínicas de má resposta terapêutica em casos de cepas com CIM 4mcg/mL (39). Desde então, são consideradas sensíveis as cepas com CIM 2mcg/mL, resistentes (VRSA) aquelas com CIM 16 mcg/ml e resistentes intermediárias (VISA) as com CIM entre 4 e 8 mcg/ml. É importante lembrar que teste de disco-difusão não tem sido recomendado para detecção de resistência à vancomicina, já que não apresenta boa acurácia para tal, principalmente na faixa de intermediária, sendo necessário um teste que avalie a CIM (teste de microdiluição) (40). O pontos de corte de CIM do EUCAST também consideram sensíveis as cepas com CIM 2 mcg/ml. Além disso, este comitê também não indica a utilização do teste disco-difusão, pelos mesmos motivos expostos acima (41). 9

22 Entre subpopulações de S.aureus sensíveis à vancomicina, tem sido notada, em alguns centros, uma tendência de aumento gradual das CIMs de vancomicina. A esse fenômeno conferiu-se o nome MIC creep. É importante lembrar que o mesmo não tem sido descrito de forma universal, sendo que há também lembrar relatos de estabilidade e até redução gradual das CIMs (39). Quando dados de diversos centros agrupados, como programa SENTRY, essas tendências tendem a se neutralizar. Essas variações se devem, provavelmente, a diferenças clínico-epidemiológicas entre as populações de pacientes estudadas (39). As infecções causadas por S.aureus com maiores CIMs, mesmo aquelas 2 mg/ml, que são classificadas pelos critérios atuais como sensíveis, têm sido associadas com pior prognóstico (42). É importante notar que CIMs mais elevadas de vancomicina têm sido descritas tanto em MRSA como S.aureus sensíveis à oxacilina MSSA (43,44), e que infecções por MSSA com maiores CIMs para vancomicina foram associadas a maior mortalidade mesmo com uso de oxacilina (44). Esses resultados devem ser avaliados com cuidado, pois há alguns complicadores importantes em sua interpretação. Clonalidade e heterorresistência à vancomicina são fatores que devem ser considerados. Outro problema é que a heterogenicidade entre os estudos é grande, havendo marcada variação entre eles quanto à mortalidade, às taxas de CIM elevadas, e ao método de susceptibilidade utilizado (39,42). Existe diferença significante entre os valores de CIM fornecidos por métodos automatizados, microdiluição ou Etest. Enquanto os automatizados tendem a subestimar os valores em relação ao método de microdiluição, considerando padrão, o Etest tende a superestima-los (27,39). 10

23 Além disso, outras evidências recentes da literatura parecem apontar para o lado oposto (45), não demonstrando qualquer correlação entre mortalidade e CIM para vancomicina, independente da avaliação ter sido por Etest ou por microdiluição. Assim para tomar as devidas decisões terapêuticas, é necessário que sejam levados em conta, além da CIM, outros parâmetros importantes, sendo o principal a resposta clínica do paciente ao tratamento (46,47). Quanto à escolha de que testes o laboratório deve utilizar e como deve relatar os resultados ainda existe dúvida. Além da heterogeneidade entre os resultados fornecidos pelos diferentes métodos de avaliação de CIM, boa parte dos laboratórios ao redor do mundo não realiza, por motivos práticos e econômicos estes testes de rotina. Existe a necessidade de um teste mais prático e baixo custo, que sirva ao menos como triagem laboratorial para detecção destas cepas de S. aureus com CIMs aumentadas para vancomicina. 11

24 2. OBJETIVOS -Comparar diferentes Métodos Laboratoriais para Avaliação de Susceptibilidade à Vancomicina em Staphylococcus aureus. -Avaliar a possibilidade de uso de uma placa de BHI (brain heart infusion), suplementada com vancomicina como método de triagem para detecção de cepas com susceptibilidade diminuída à vancomicina. 12

25 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Amostras bacterianas Foram estudadas amostras cepas Staphylococcus aureus isoladas de pacientes hospitalizados no período compreendido entre julho 2011 até junho Isoladas de amostras de Hemoculturas do Hospital Irmandade Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Como a tolerância e a resistência à vancomicina em S. aureus são fenômenos instáveis e induzidos e as formas tolerantes e resistentes podem voltar ao comportamento regular da espécie quando armazenadas inadequadamente em laboratórios ou, ainda, podem desaparecer na ausência da pressão seletiva do antimicrobiano, todas as amostras foram testadas imediatamente após o isolamento e a realização do antibiograma, quando a determinação da CIM não foi possível dentro do prazo previsto, as cepas de S. aureus foram imediatamente conservadas em caldo BHI (brain heart infusion), adicionado de 15% a 20% de glicerol, e armazenadas em freezer a 80 C (11). Todas as cepas foram identificadas por meio da coloração de Gram e das provas de catalase e coagulase. Em seguida, foram separadas para ser feitos testes adicionais com meio específico. Para teste susceptibilidade foi aplicado quatro metodologias foram aplicadas, discodifusão, Etest vancomicina e oxacilina, microdiluição à vancomicina e placa BHI suplementada com vancomicina com concentrações 6 µg /ml, 4 mcg /ml, 2 µg /ml, 1.5 mcg /ml. 13

26 Figura 1: Staphylococcus aureus 3.2. Identificação: Coloração pelo método do Gram A partir das culturas acima foram feitos esfregaços, os quais, após fixados, são cobertos com solução de cristal violeta por 1 min. Em seguida, as lâminas São lavadas em água corrente e cobertas com lugol por 1 min. Após nova lavagem em água corrente, os esfregaços foram descorados com álcool/acetona, sendo então lavados em água corrente. A contra-coloração foi realizada com uma solução de fucsina do Gram. Em seguida, a lâmina foi lavada com água e deixada ao ar para secar. As cepas que se 14

27 apresentaram na forma de cocos Gram-positivos (azul escuro) foram então avaliadas, quanto aos outros testes. Figura 2: Coloração Gram Coco Gram positivo 3.3. Prova da Catalase Esta prova foi realizada para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus. Esta detecta a presença da enzima catalase capaz de converter: 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 PROCEDIMENTO: Da placa recolheu-se pequena amostra e foi transferida para o tubo com peróxido de hidrogênio H 2 O 2 a 3%. Reação imediata: 15

28 Houve borbulha intensa na superfície do tubo Reação (+) São Catalase (+): Staphylococcus Figura 3: Prova da Catalase 3.4. Prova da Coagulase Esta prova foi realizada para diferenciar Staphylococcus aureus de outros Staphylococcus. É uma proteína conhecida quimicamente em sua função protrombínica capaz de converter o fibrinogênio em fibrina.usamos o Staphy test da Probac, que são hemácias de carneiro previamente sensibilizada com hemolisina e fibrinogênio. Foi colocada em uma lâmina uma gota de R de Staphy test e em seguida recolhido com a alça poucas colônias da placa para emulsionar na gota. Aglutinação positiva Staphylococcus aureus Figura 4: Prova Coagulase 16

29 3.5. Disco-Difusão - Método de Kirby-Bauer Para a realização do teste de sensibilidade através do disco-difusão (Método de Kirby-Bauer) qualitativo - foi feita uma semeadura em três direção em Agar Mueller-Hinton a partir de uma suspensão 0,5 McFarland para cada cepa foram colocados os discos dos seguintes antimicrobianos: em uma placa Muller-hinton foi testado Polidisco Coco Gram positivo em outra placa Muller-hinton mais Nacl foi testado 1 µg de oxacilina e 30 µg de cefoxitina. Após 24 horas de incubação em estufa 35 C. foi realizada a leitura através da medição halos de inibição formados ao redor dos discos. Figura 5: Escala MacFarland 17

30 3.6. Etest (AB Biodisk, Suécia) Para cada cepa foi feita uma suspensão de 0,5 da escala nefelométrica de McFarland e feita semeadura em superfície em três sentidos em Agar Mueller-Hinton, seguido da colocação das fitas de Etest (AB Biodisk, Suécia) de Vancomicina. As leituras foram feitas após 24 horas de incubação em estufa 35ºC e considerado o valor da Concentração Inibitória Mínima o local da intersecção do halo de inibição (elipse) para cada droga estudada. Figura 7: Método Epsilometrico 18

31 Figura 7: Método Epsilometrico Figura 9: Método de Etest 19

32 3.7. Microdiluição para vancomicina: No documento CLSI (40) vigente, o critério interpretativo para vancomicina pelo método da difusão do disco foi retirado da tabela M100-S19, e foram incluídos os pontos de corte pelo método quantitativo (CIM) para Staphylococcus spp. Esta alteração trouxe algumas dificuldades para maioria dos laboratórios clínicos, que não tem como prática rotineira, a determinação de CIM pelo método da microdiluição para vancomicina (48-50). No presente trabalho utilizamos o painel para microdiluição de vancomicina da Probac do Brasil. Procedimento: A) Materiais: - Solução fisiológica (SF) estéril: 1 tubo com 2 ml e 2 tubos com 5mL. - Pipeta automática de volume variável P200 e P1000 (ou sorológica estéril de 1mL). - Ponteiras estéreis: ponteira amarela e azul. B) Preparo do inóculo: A partir do isolamento da cepa teste, foi utilizado as colônias bem isoladas com 18 a 20 horas de incubação. - Tubo 1: com 2 ml de SF estéril, foi preparado o inóculo na escala 0,5 MacFarland (10 8 UFC/mL). - Tubo 2: Foi retirado 50 mcl da SF com auxílio da pipeta P200 foi adicionado 50 mcl do inoculo ajustado na escala 0,5 MF. Equivale a uma diluição de 1:100, e o inóculo será de (10 6 UFC/mL). 20

33 - Tubo 3: Foi retirado 500 mcl ou 0,5 ml da SF e foi adicionado 500 mcl ou 0,5 ml da suspensão bacteriana do tubo 2, equivale a uma diluição de 1:10, e o inóculo será de (10 5 UFC/mL). C) Inoculação: - Da suspensão ajustada a 105 UFC/mL, foi inoculado 100 mcl/poço no controle de crescimento (CC) e nos poços de 0,125 a 64 mcg/ml, com auxílio de uma pipeta automática P200. Observar o sentido de inoculação que deve ser primeiramente no CC e depois do poço de menor concentração para o de maior concentração. D) Incubação: Foi recolocada a microplaca na embalagem original e foi incubada por 24 horas em estufa aeróbia a 35 o C. Leitura: A Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi considerada a primeira concentração onde não houve crescimento bacteriano. O resultado foi liberado em mcg/ml e a interpretação seguiu os critérios no documento vigente do CLSI. 21

34 Figura 9: Painel Microdiluição vancomicina Figura 9: Painel Microdiluição vancomicina 22

35 3.8. Placa BHI suplementada com Vancomicina com concentrações: 6µg/ml, 4µg/ml, 2µg/ml e 1.5 µg/ml Este meio é formulado com Agar BHI (Brain Heart Infusion) suplementado com vancomicina. De acordo com o meio, ASM ( American Society for Microbiology) e o CLSI (Clinical and Standards institute) recomendam o teste com o meio 6µg/ml. Procedimento: Foi preparado o inóculo em caldo 0,5 escala de MCFarland e feita a semeadura. Incubado a 35 C.por 24 horas. Feita a leitura considerando o aparecimento de crescimento indica que o isolado é resistente a vancomicina. Figura 10: Placas BHI suplementada com Vancomicina com concentrações:6µg/ml, 4µg/ml, 2µg/ml e 1.5 µg/ml 23

36 Teste Disco-Difusão, MIC por Etest, Microdiluição em caldo e placas BHI suplementada com vancomicina foram determinadas segundo as instruções do fabricante. E seguindo os prazos de validade. Cepas controle testadas neste trabalho foram: - Staphylococcus aureus ATCC (MIC) - Staphylococcus aureus ATCC (MRSA) - Staphylococcus aureus ATCC (MSSA) - Staphylococcus aureus ATCC (Disco-Difusão) - Enterococcus faecalis ATCC (Resistente Vancomicina) - Enterococcus faecalis ATCC (Sensível Vancomicina) 24

37 4. RESULTADOS Foram incluídas neste estudo 125 cepas. Todas as cepas foram consideradas sensíveis à vancomicina pelo teste de disco-difusão e pela microdiluição. O valor máximo de CIM observado foi 2,0 mg/l pela microdiluição, em 55 cepas, e 4,0 mg/l pelo Etest, em apenas uma cepa. Nenhuma das cepas cresceu no BHI suplementado com 6,0 mg/l de vancomicina, e apenas uma cepa cresceu no placa de BHI com 4 mg/l. Comparando o Etest e a microdiluição (e aproximando os valores de Etest entre duas diluições para o valor superior), 58% (n=73) das cepas tiveram resultados similares pelos dois métodos, enquanto 38% (n=47) tiveram um resultado de CIM por Etest uma diluição superior ao resultado da CIM por microdiluição. Uma cepa teve uma CIM por Etest duas diluições maior e quatro cepas uma CIM uma diluição menor que a microdiluição. Uma CIM de 2,0, quando comparada a uma CIM <2,0, foi significativamente mais frequente em MRSA (42/76) que em MSSA (13/49), tanto quando avaliada por microdiluição quanto por Etest (p=0,0018 and p=0,0001, respectivamente). Entre as placas de BHI com diferentes concentrações de vancomicina, a única com acurácia para a detecção de cepas com CIMs aumentadas para vancomicina foi a placa suplementada com 2,0 mg/l de vancomicina. Esse método apresentou uma sensibilidade de 100% para detectar cepas com CIM 2,0 determinadas pelo Etest e 91% de sensibilidade na detecção de cepas com CIM 2,0 pela microdiluição. As especificidades foram, respectivamente, 25

38 de 63% e 38%. Para cepas com CIM 1.5 mg/l pelo Etest, a sensibilidade foi de 74% e a especificidade 65%. Tabela 1. Amostras de S.aureus isoladas de hemoculturas Santa Casa de São Paulo apresentaram crescimento em placas de BHI com diferentes concentrações de vancomicina de acordo com os resultados da microdiluição e do Etest (mg/l) Microdiluição N BH 1,5 BHI 2 BHI 4 BHI 6 0, , Total 125 Etest N 0, , Total 125 Tabela 2. Comparação entre resultados da microdiluição e Etest Amostras de S.aureus isoladas de hemoculturas Santa Casa de São Paulo Microdiluição (MD) x Etest Número de cepas Resultados semelhantes de MD e Etest após aproximação do Etest para diluição superior 73 Resultado de Etest 1 diluição maior que MD 47 Resultado de Etest 2 diluições maior que MD 1 Resultado de Etest 1 diluição menor que MD 4 Total

39 5. DISCUSSÃO Nos últimos anos, tem sido motivo de grande preocupação o surgimento de cepas com resistência plena ou intermediária à vancomicina (27,51) Não foram encontradas, entre as cepas testadas no presente estudo, nenhuma cepa com CIM 4 pelo método padrão (microdiluição) recomendado pelo CLSI (52), apenas uma cepa com CIM de 4 pelo Etest, demonstrando que, ao menos em nosso serviço, a resistência deve ser incomum ou até ainda inexistente. A única cepa isolada com CIM de 4 mcg/ml pelo método do Etest e BHI de 4 mcg/ml o paciente ficou Internado por 10 dias no Pronto socorro Central de emergência com politraumatismo, sendo 7 dias na UTI e foi tratado com oxacilina por 4 dias. Resultado Hemocultura paciente com MRSA e Enterococcus sp, sensível todos antibióticos testados. Uma importante característica dos métodos de detecção laboratorial da susceptibilidade à vancomicina é a heterogeneidade entre os mesmos. Em nosso estudo, os resultados das concentrações inibitórias mínimas pelo Etest foram muitas vezes uma e até duas diluições maiores que os da microdiluição. Essa diferença entre esses dois métodos já tem sido demonstrada de forma consistente na literatura (53,54). Reconhecer as potenciais diferenças entre os resultados fornecidos por cada um desses métodos é vital para a correta interpretação e a aplicação clínica destes dados. As CIM de 2,0, comparadas a menores CIMs, foram mais frequentes em MRSA que em MSSA. No entanto, as CIMs de 2,0 ocorreram mesmo entre os MSSA. Embora as CIMs aumentadas sejam demonstradas pela literatura como sendo realmente mais comuns em MRSA, outros autores também relataram MSSA com susceptibilidade reduzida à vancomicina (44, 55-57). 27

40 A alta sensibilidade da placa de screening de BHI suplementada com 2,0 mg/l de vancomicina faria esse teste uma opção interessante como um teste de screening inicial. A baixa especificidade, por outro lado, faria necessária a confirmação de cepas positivas através de Etest ou microdiluição. Outros estudos (58,59) também avaliaram a acurácia da placa de screening, mas com o objetivo primário de detectar cepas com resistência intermediária (CIM entre 4 e 8), e não cepas sensíveis mas com CIMs aumentadas (susceptibilidade reduzida), como fez o nosso. Apesar de algumas limitações, como o número relativamente pequeno de cepas e a ausência de cepas com resistência intermediária à vancomicina, nossos resultados demonstraram, além da susceptibilidade atual das cepas do nosso serviço à vancomicina, e das diferenças entre os resultados do Etest e da microdiluição, a possibilidade de uso de uma placa de BHI suplementada com vancomicina para a triagem de cepas com CIMs 2. Apesar de toda discussão acerca do significado clínico de diferentes CIMs, esse pode e deve ser um parâmetro adicional utilizado pelo clínico nas decisões terapêuticas. Esta placa de screening seria uma importante ferramenta para os laboratórios que frequentemente só realizam teste de discodifusão para vancomicina, não podendo realizar, sobretudo por motivos financeiros e de infraestrutura, testes de CIM em todas as cepas isoladas. A realização dessa triagem, prática e barata reservaria os testes de CIM para um número significativamente menor de cepas. Cabe lembrar que aplicação rotineira deste tipo de placa de triagem depende de mais estudos e que os benefícios de seu uso dependem muito da rotina já existente de cada laboratório e da frequência de cepas com diferentes concentrações inibitórias mínimas (C.I.M). 28

41 6. CONCLUSÕES -Os resultados de CIM fornecidos por Etest são comumente maiores do que aqueles resultantes do teste de microdiluição em caldo. - A placa de BHI suplementada com 2,0 mg/l de vancomicina parece ser um método acurado para a triagem de cepas com CIMs 2. 29

42 7.Anexo NUMERO INICIAIS MIC VANCO BHI 1.5 BHI 2.0 BHI 4 BHI 6 Etest Van Etest OX DD OXA DD CFO MH/OX/CFO ATCC R R R ATCC R R R GGRS S S S MFF 1, S S S SSF R R R SAS S S S APJ S S S S S S FWL R R R AGC S S S MBS R R R GKRM R R R YSSC MICROCC YBE S S S MUS CONTAMI MUS R R R EK R R R MCMS S S S SGP S S S MA R R R MPSL S S S JM R R R MBS S S S MJFS R R R MHJAS S S S TGA R R R 30

43 DN R R R DPM ,00 R R R RN R R R MSD R R R JSO R R R NJOC S S S NEPF S S S MLPS R R R MTC R R R AGS R R R LGO R R R AB R R R PJR S S S SADM R R R SCS S S S ASB R R R EAO R R R SLO S S S ARSS R R R JES S S S FJF S S S LMS S S S VAV S S S GPS R R R AST S S S CTS S S S OFG S S S EOL R R R MAT R R R 31

44 S.G R R R FMS R R R CSP R R R JM R R R JBR R R R MAF R R R MNS R R R OC R R R LGS R R R CVM R R R SP R R R ZMS R R R CRB R R R IVS N/CRES SC S S S PGR S S S LCS R R R AOM S S S VM S S S VVS S S S JAR S S S ACPS R R R VER R R R MMSF S S S MBS R R R SRO S S S RLB S S S JPA S S S CRB R R R 32

45 IJS R R R LRS R R R JVOS R R R MÊS R R R DDPB R R R RNNDI S S S LCB R R R JSS R R R CFB R R R ICAS R R R EE S S S ODE R R R WJS S S S MHF S S S JMS R R R SL S S S MRA S S S RS S S S LFNA S S S MDA R R R JMS S S S EVP R R R PRCS N/CRESC AM R R R EMPM R R R DPN R R R SAA R R R MSS R R R EOB N/CRESC 33

46 MFVS R R R JCL R R R ACF R R R LALA S S S JRS R R R JSS S S S HCA R R R LSS R R R RCHM R R R LBP R R R FCO S S S CRO R R R MCA S S S MKK R R R TMS S S S VBR R R R LEJA S S S MPO R R R MGSL R R R 34

47 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Brooks GF, Butel JS, Morse JA. Microbiota normal do corpo humano. In: Brooks GF, Butel JS, Morse JA, editores. Jawetz, Melnik & Adelberg s Microbiologia médica. 21ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; p Fekety FR Jr.The epidemiology and prevention of staphylococcal infection. Medicine. 1964; 43: Waldvogel FA. Principles and practice of infections diseases: Staphylococcus aureus (including toxic shock syndrome. In: Mandel GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principles and practice of infectious diseases. 4 th ed. New York: Churchill Livingstone; p Longworth DL. Diagnosing infective endocarditis. Cleve Clin J Med. 1994;61: Schechter M, Marangoni DV. Doenças infecciosas: conduta, diagnóstico e terapêutica. 2 a ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; p. 6. Rogolsky M. Nonenteric toxins of staphylococcus aureus. Microbiol Rev. 1979; 43: Sader H. Resistência bacteriana a antimicrobianos. In: Veronesi R. & Focacci R. editores. Tratado de infectologia. 3ªed. São Paulo: Atheneu; p Williams REO. Healthy carriage of Staphylococcus aureus: its prevalence and importance. Bacteriol Rev. 1963; 27: Oliveira DC, Tomasz A, de Lencastre H: The evolution of pandemic clones of methicillin resistant Sthaphylococcus aureus. Identification of two ancestral genetic backgrounds and the associated mec elements Microb Drug Resist. 2001; 7: Boyce JM. Methicillin- resistant Staphylococcus aureus in hospitals and longterm care facilities: microbiology, epidemiology and preventive measures. Infect Control Hosp Epidemiol. 1992; 13: Boyce JM, Jackson MM, Pugliese G, Batt, MD, Fleming D, Garner JS, et al. Methicillin- resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a briefing for acute care hospitals and nursing facilites. The AHA Technical Panel on Infections Within Hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 1994; 15: Kluytmans J, van Belkum A, Verbrugh H. Nasal carriage of Staphylococcus aureus: epidemiology, underlying mechanisms, and associated risks. Clin Microbiol Rev. 1997; 10: Adams BG, Marrie TJ. Hand carriage of aerobic Gram-negative rods by health care personnel. J Hyg (Lond). 1982; 89:

48 14. Gould D. Nurses hands as vectors of hospital-acquired infection: a review. J Adv Nurs. 1991; 16: Ribeiro Filho N. Resistência bacteriana aos antibióticos. In: Fernandes AT, Fernandes MOV, Ribeiro Filho N. Infecção hospitalar e suas interfaces na área da saúde. São Paulo: Atheneu; p Tavares W. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo, do enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Rev Soc Bras Med Trop. 2000; 33: Lowy FD. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus. J Clin Invest. 2003;111: Maranan MC, Moreira B, Boyle-Vavra S, Daum RS. Antimicrobial resistance in Staphylococci. Epidemiology, molecular mechanisms and clinical relevance. Infect Dis Clin North Am. 1997; 11: Jessen O, Rosendal K, Bulow P, Faber V, Eriksen KR. Changing staphylococci and staphylococcal infections: a ten-year study of bacteria and cases of bacteremia. N Engl J Med 1969; 281: Oliveira GA, Dell Aquila AM, Masiero RL, Levy CE, Gomes MS, Cui L, et al. Isolation in Brazil of nosocomial Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin. Infect Control Hosp Epidemiol. 2001;22: Chambers HF. The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Infect Dis. 2001; 7: Gorak EJ, Yamada SM, Brown JD. Community-acquired ethicillin-resistant Staphylococcus aureus in hospitalized adults and children without known risk factors. Clin Infect Dis. 1999; 29: Herold BC, Immergluck LC, Maranan MC, Lauderdale DS, Gaskin RE, Boyle- Vavra S, et al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in children with no identified predisposing risk. JAMA. 1998; 279: Lopes HV. CA-MRSA: um novo problema para o infectologista. Rev Panam Infectol. 2005; 7: Ribeiro J, Boyce JM, Zancanaro PQ. Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) among patients visiting the emergency room at a tertiary hospital in Brazil. Braz J Infect Dis ; 9: Larcombe L, Waruk J, Schellenberg J, Ormond M. Rapid emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) among children and adolescentes in northern Manitoba, Can Commun Dis Rep. 2007; 33: Chang S, Sievert DM, Hageman JC, Boulton ML, Tenover FC, Downes FP, et al. Infection with vancomycin-resistent Satphylococcus aureus containing the vana resistance gene. N Engl J Med. 2003; 348:

49 28. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Interim guidelines for prevention and control of Staphylococcal infection associated with reduced susceptibility to vancomycin. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1997; 46:626-8, Wenzel RP, Edmond MB. Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus: infection control considerations. Clin Infect Dis. 1998; 27:245-9; quiz Appelbaum PC. The emergence of vancomycin-intermediate and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect. 2006; 12(Suppl.1): Hanaki H, Kuwahara-Arai K, Boyle-Vavra S, Daum RS, Labischinski H, Hiramatsu K. Activated cell-wall synthesis is associated with vancomycin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strains Mu3 and Mu50. J Antimicrob Chemother. 1998;42: Cui L, Murakami H, Kuwahara-Arai K, Hideaki H, Hiramatsu K. Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed by Staphylococcus aureus Mu50. Antimicrob Agents Chemother. 2000; 44: Santos AL, Santos DO, Freitas CC, Ferreira BLA, Afonso IF, Rodrigues CR, et al. Staphylococcus aureus: visitando uma cepa de importância hospitalar. J Bras Patol Med Lab. 2007; 43: Tenover FC, Lancaster MV, Hill BC, Steward CD, Stocker SA, Hancock GA, et al. Characterization of staphylococci with reduced susceptibilities to vancomycin and other glycopeptides. J Clin Microbiol. 1998;36: Weigel LM, Clewell DB, Gill SR, Clark NC, McDougal LK, Flannagan SE, et al. Genetic analysis of a high-level vancomycin-resistant isolate of Staphylococcus aureus. Science. 2003; 302: Severin A, Tabei K, Tenover F, Chung M, Clarke N, Tomasz A. High level oxacillin and vancomycin resistance and altered cell wall composition in Staphylococcus aureus carrying the staphylococcal meca and the enterococcal vana gene complex. J Biol Chem. 2003; 279: Somsel P. The bugs fight back: VRSA, CA-MRSA and QRNG. [on line] LabLink - Michigan Department of Community Health Bureau of Laboratories. Available from: [23 Nov 2014]. 38. Rossi F, Diaz L, Wollam A, Panesso D, Zhou Y, Rincon S, et al. Transferable vancomycin resistance in a community-associated MRSA lineage. N Engl J Med. 2014; 370: Dhand A, Sakoulas G. Reduced vancomycin susceptibility among clinical Staphylococcus aureus isolates ( the MIC Creep ): implications for therapy.f1000 Med Rep. 2012; 4: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrocrobial Susceptibility Testing; Twenty-second informational Supplement, M100-S22. [on line]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory 37

50 Standards Institute; Available from: [12 jan 2014]. 41. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Clinical. EUCAST 2012 breakpoint table v 2.0. [on line]. 01 Dec Available from: %5D=13&cHash=717f ff88378a8f93d72ec3d98 [12 dez 2013] 42. Van Hal SJ, Lodise TP, Paterson DL. The clinical significance of vancomycin minimum inhibitory concentration in Staphylococcus aureus infections:a systematic review and meta-analysis. Clin infect Dis. 2012; 54: Wang G, Hindler JF, Ward KW, Bruckner DA. Increased vancomycin MICs for Staphylococcus aureus clinical isolates from a university hospital during a 5- year period. J Clin Microbiol. 2006; 44: Holmes NE, Turnidge JD, Munckhof WJ, Robinson JO, KORMAN TM, O Sullivan MV, et al. Antibiotic choice may not explain poorer outcomes in patients with Staphylococcus aureus bacteremia and high vancomycin minimum inhibitory concentrations. J Infect Dis. 2011; 204: Rojas L, Bunsow E, Muñoz P, Cercenado E, Rodríguez-Créixems M, Bouza E. Vancomycin MICs do not predict the outcome of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bloodstream infections in correctly treated patients. J Antimicrob Chemother. 2012; 67: Liu C, Bayer A, Cosgrove SE, Daum RS, Fridkin SK, Gorwitz RJ, et al. Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of America for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in adults and children. Clin Infect Dis. 2011; 52:e Humphries RM, Hindler JA. Should Laboratories Test Methicillin-Resistant staphylococcus aureus for elevated vancomycin minimum inhibitory concentrations by etest as driver of treatment changes? Clin Infect Dis. 2012; 55: Hindler J. Antimicrobial susceptibility testing. In: Isemberg HD. Clinical microbiology procedures handbook. Washington, D.C.: ASM Press; v.1, section Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfalle MA. Manual of clinical microbiology. 9 th ed. Washington, DC: American Society for Microbiology ; v. 50. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Wayne, PA: Clinical and Labratory Standards Institute; Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, Yabuta K, Oguri T, Tenover FC. Methicillinresistant Staphylococcus aureus clinical strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother. 1997; 40: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Third Informational Supplement, 38

51 M100-S23. [on line]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; Available from: file:///c:/users/lenovo/downloads/clsi%202013%20m100-s23.pdf [20 Jan 2014]. 53. Mason EO, Lamberth LB, Hammerman WA, Hulten KG, Versalovic J, Kaplan SL. Vancomycin MICs for Staphylococcus aureus vary by detection method and have subtly increased in a pediatric population since J Clin Microbiol. 2010; 47: Vaudaux P, Huggler E, Bernard L, Ferry T, Renzoni A, Lew DP. Underestimation of vancomycin and teicoplanin MICs by broth microdilution leads to underdetection of glycopeptide-intermediate isolates of Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54: Holmes NE, Turnidge JD, Munckhof WJ, Robinson JO, Korman TM, O'Sullivan MV, et al. Vancomycin minimum inhibitory concentration, host comorbidities and mortality in Staphylococcus aureus bacteraemia. Clin Microbiol Infect. 2013; 19: Pillai SK, Wennersten C, Venkataraman L, Eliopoulos GM, Moellering RC, Karchmer AW. Development of reduced vancomycin susceptibility in methicillin-susceptible Staphylococcus aureus. Clin Infect Dis. 2009; 49: Aguado JM, San-Juan R, Lalueza A, Sanz F, Rodríguez-Otero J, Gómez- Gonzalez C, Chaves F. High vancomycin MIC and complicated methicillinsusceptible Staphylococcus aureus bacteremia. Emerg Infect Dis. 2011; 17: Burnham CA, Weber CJ, Dunne WM Jr. Novel screening agar for detection of vancomycin-nonsusceptible Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2010; 48: Riederer K, Shemes S, Chase P, Musta A, Mar A, Khatib R. Detection of intermediately vancomycin-susceptible and heterogeneous Staphylococcus aureus isolates: comparison of Etest and Agar screening methods. J Clin Microbiol. 2011; 49:

52 Resumo: Os Staphylococcus aureus tem ocupado lugar de destaque na etiologia das infecções hospitalares e sua alta versatilidade em adquirir resistência aos antimicrobianos tornou-se uma preocupação universal. A vancomicina tem sido uma das principais opções terapêuticas para cepas resistentes aos demais antimicrobianos. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) deste antimicrobiano parece estar intimamente relacionada a desfechos clínicos, sendo que as infecções por cepas com CIMs aumentadas, mesmo na faixa suscetível, são de pior prognóstico. No entanto, existe diferença significante entre os valores de CIM fornecidos por métodos automatizados, microdiluição ou Etest. Além disso esses testes têm custo relativamente alto e são, em geral, trabalhosos. Existe a necessidade de um teste mais prático e barato, que sirva ao menos como triagem laboratorial para detecção destas cepas de S. aureus com CIMs aumentadas para vancomicina. Objetivos: Comparar diferentes métodos laboratoriais para avaliação de susceptibilidade à vancomicina em Staphylococcus aureus e avaliar a possibilidade de uso de uma placa de BHI suplementada com vancomicina como método de triagem para detecção de cepas com susceptibilidade diminuída à vancomicina. Materiais e Métodos: Foram estudadas 125 cepas de Staphylococcus aureus em de pacientes hospitalizados, isoladas no período compreendido entre julho 2011 até junho As cepas foram isoladas de Hemoculturas do Hospital Irmandade Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Todas as cepas foram identificadas por meio da coloração de Gram, prova da catalase e coagulase, e submetidas aos seguintes testes de susceptibilidade à vancomicina: Disco-difusão, Etest, microdiluição e placa de BHI suplementada com vancomicina em concentrações 6 µg /ml, 4 µg /ml, 2 µg /ml, 1.5 µg /ml. Resultados: Todas as 40

53 cepas foram consideradas sensíveis à vancomicina pelo teste de discodifusão e pela microdiluição.o valor máximo de CIM observado foi 2,0 mg/l pela microdiluição, em 55 cepas, e 4,0 mg/l pelo Etest, em apenas uma cepa. Com relação à comparação entre microdiluição e Etest, 38% (n=47) tiveram um resultado de CIM por Etest uma diluição superior ao resultado da CIM por microdiluição. Nenhuma das cepas cresceu no BHI suplementado com 6,0 mg/l de vancomicina, e apenas uma cepa cresceu no placa de BHI com 4 mg/l. A placa com 2,0 mg/l de vancomicina apresentou uma sensibilidade de 100% para detectar cepas com CIM 2,0 determinadas pelo Etest e 91% de sensibilidade na detecção de cepas com CIM 2,0 pela microdiluição. As especificidades foram, respectivamente, de 63% e 38%. Conclusões: Os resultados de CIM fornecidos por Etest são comumente maiores do que aqueles resultantes do teste de microdiluição em caldo. A placa de BHI suplementada com 2,0 mg/l de vancomicina parece ser um método acurado para a triagem de cepas com CIMs 2. Palavra-Chave: 1. Staphylococcus aureus 2.Resistência à vancomicina 3. Triagem/métodos 4. Estudo comparativo 41

54 Abstract: Staphylococcus aureus has been a leading cause of both nosocomial and community associated infections. Vancomycin is frequently used for the treatment of infections caused by antimicrobial resistant isolates. High vancomycin minimum inhibithory concentrations (MICs), even within the susceptible range, have been associated with worse clinical outcomes. However, laboratoy methods used for this purpose produce heterogeneous results. In addition, they are costly and time consuming. There is a need of a reliable, unexpensive and practical method for screening of isolates with high vancomycin MICs. Aims: To compare different vancomycin susceptibility methods and to evaluate the possibility of use of a BHI plate supplemented with vancomycin as a screening method for isolates with high vancomycin MICs. Materials and Methods: We included 125 S. aureus bloodstream isolates from hospitalized patients between July 2011 and June Identification was performed using Gram stain, catalase test and coagulase tests. Isolates were submitted to different vancomycin susceptibility tests, including disk-diffusion, Etest, microdilution and a screening BHI plate supplemented with vancomycin, in concentrations of 6 µg /ml, 4 µg /ml, 2 µg /ml, 1.5 µg /ml. Results: All isolates were considered susceptible to vancomycin by diskdiffusion and microdilution. Maximum MIC by microdilution was 2.0 mg/l, in 55 isolates, and 4.0 mg/l by Etest, in only one isolate. None of the isolates grew in the 6.0 mg/l BHI plate, and only one isolate grew on the 4.0 mg/l plate. The 2.0 mg/l plate had 100% sensitivity to detect isolates with MICs 2,0 by Etest and 91% to detect isolates with MICs 2,0 by microdilution. Specificities were, respectively, 63% and 38%. Conclusions: MIC results by Etest are frequenty higher than those by microdilution. A BHI plate suplemented with 42

55 2 mg/l of vancomycin is an accurate screening method for the detection of isolates with MIC 2 mg/l. 43

56 Apêndice: 44