GLICEROL COMO CRIOPROTETOR PARA O FUNGO Pleurotus sp

Transcrição

1 GLICEROL COMO CRIOPROTETOR PARA O FUNGO Pleurotus sp ROSA, Tiago Tomaz. 1 BORTOLON, Caroloina. 2 TOZZETO, Altevir. 3 4 RESUMO O cogumelo Pleurotus sp é um basidiomiceto que tem despertado o interesse da comunidade científica em relação às propriedades medicinais. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito inibidor e crioprotetor do glicerol na criopreservação do fungo Pleurotus sp, nas temperaturas de -20 e -70º C. Inicialmente foram realizados testes de inibição de crescimento do fungo com glicerol, e selecionada a concentração do crioprotetor. Fungo crescido em grão de arroz ou disco de meio agar batata dextrose foi criopreservado a -20 ou a -70º C. Após 30 dias fez-se a retirada e avaliou-se a recuperação do crescimento micelial do fungo. O glicerol causou inibição do crescimento do fungo em concentrações de 30% e reduziu o crescimento na concentração de 10%. A criopreservação em grãos de arroz e discos de agar batata dextrose em diferentes temperaturas, utilizando o crioprotetor glicerol a 10% é eficiente. PALAVRAS-CHAVE: Criopreservação, Pleurotus sp, Crioprotetor, Glicerol. ABSTRACT Glycerol as a cryoprotectant for the fungus Pleurotus sp Pleurotus sp is a basidiomycete that shows interest of the scientific community because of its medicinal properties. The objective of this work was to evaluate the inhibiting and cryoprotective effect of glycerol as cryoprotector to preserve Pleurotus sp, at -20 or -70 ºC. Initially a growth inhibition tests were made with different glycerol concentrations to determine the best cryoprotector concentration. Micelia were growth on rice grains or on dextrose potato agar and it was cryopreserved at -20 or -70 ºC with glycerol 10%. After 30 days the fungi growth recupetation was evaluated.the glycerol causes inhibition of the growth at 30% and reduces the mycelia diameter at 10%. The Pleurotus cryopreservation grown on rice grains or on dextrose potato agar disks, using the crioprotector glycerol 10% was efficient for both temperatures. Keys-words: cryopreservation, Pleurotus sp, cryoprotectant, glycerol. 1. INTRODUÇÃO Os métodos de preservação têm como objetivo manter a viabilidade do organismo através da paralisação ou do retardamento do metabolismo celular (14). Existem diversos métodos pelos quais os microrganismos podem ser preservados. Através do óleo mineral (14), repicagem, liofilização, desidratação e criopreservação (1). A criopreservação é um método de preservação que tem como objetivo conservar espécies de interesse econômico pela manutenção do microrganismo em temperatura entre -20ºC e -196ºC. Através desta técnica pode-se assegurar a conservação de material biológico por longos períodos, uma vez que as temperaturas ultra baixas reduzem o metabolismo celular (15). Esta técnica é considerada uma das melhores formas de armazenamento para fungos filamentosos (17). Com esta finalidade são criados bancos de germoplasma onde são armazenadas coleções da variação genética de comunidades, populações ou de um individuo propagado clonalmente. Sua importância vem da necessidade e do interesse de se preservar a diversidade genética (16). Esses recursos genéticos microbianos são de extrema importância para as áreas industriais, farmacêuticas, agropecuárias e de preservação ambiental (5). Segundo Hubálek (11), o uso de crioprotetores reduz os danos da criopreservação às linhagens. Existem diferentes tipos de crioprotetores: os que penetram tanto na parede celular quanto na membrana plasmática, os que penetram apenas na parede celular e por último os não penetrantes. Ainda podem ser classificados quanto ao tempo de penetração. Pode-se dividir em rápida, cerca de até 30 minutos (metanol, etanol, etileno glicol, propileno glicol, dimetilformamida, metilacetamida e DMSO) e lenta, acima de 30 minutos (glicerol; mono, oligo e polissacarídeo, 4 Discente do curso de nutrição da FAG. tiagotomazrosa@gmail.com 4 Discente do curso de medicina da FAG. carolbortolon_@hotmail.com 4 Docente do curso de nutrição da FAG. ajgtozetto@hotmail.com Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional

2 manitol, sorbitol, dextran, HES, metil celulose, albumina, gelatina, outras proteínas, PVP, polietileno glicol, polietileno oxido). A escolha do crioprotetor pode afetar a viabilidade dos microrganismos após o congelamento. O crioprotetor impede a difusão de água no interior da célula e reduz a formação de cristais de gelo, além de estabilizar alguns componentes da membrana celular, impedindo alterações celulares (3). Um dos crioprotetores mais utilizados é o glicerol (12). Este composto age diretamente no citoplasma da célula, reduzindo a formação de cristais de gelo. O Glicerol é utilizado para a criopreservação de diversos microrganismos, como fungos filamentosos e leveduras (11), sendo um produto de fácil aquisição e manipulação. O fungo Pleurotus sp é um basidiomiceto, pode ser encontrado praticamente no mundo todo, sendo freqüente também nas matas brasileiras. Possui importância gastronômica devido o alto valor nutritivo, são ricos em proteínas e vitaminas, além de conter fibras e diversos minerais. Possui também importância medicinal devido à presença de princípios ativos como a lovastatina que é um auxiliar em terapias de cardiopatias e anticolesterolêmico e o D-glucano, que possui ação antitumoral e estimula o sistema imunológico (2). A criopreservação é uma técnica fundamental para uma agricultura sustentável, contribuindo para a preservação do meio ambiente e constituindo uma fonte de suprimento de matéria-prima para a agroindústria através de programas de conservação de germoplasma. É, portanto essencial a manutenção de bancos de germoplasma considerando o crescimento nas expectativas da sociedade em relação a aspectos como meio ambiente, alimentação, saúde e outros (6). Espera-se que este trabalho forneça uma nova técnica de criopreservação utilizando materiais e equipamentos de fácil acesso viabilizando economicamente a implementação de bancos de germoplasma de alta variabilidade genética O objetivo deste trabalho é avaliar a ação inibidora e crioprotetora do glicerol em relação ao fungo Pleurotus sp, visando estabelecer um protocolo de criopreservação específico para este fungo. 2. METODOLOGIA Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense Campus I de Umuarama. Utilizou-se para o experimento a linhagem 8-6 do fungo Pleurotus sp proveniente da micoteca deste laboratório, mantido em meio ágar batata dextrose (BDA) (39g/L) a 25 ºC. Foram selecionados como inóculo placas que apresentaram micélio homogêneo e crescimento radial. O experimento foi dividido em duas etapas: a primeira o teste de inibição do crescimento do fungo (ICF) na presença do agente crioprotetor e a segunda a criopreservação do microrganismo. No teste de inibição o agente crioprotetor glicerol foi adicionado ao meio BDA nas concentrações de 5%, 10% ou 30%. O glicerol adicionado ao BDA foi previamente esterilizado em autoclave. Os meios de cultura foram transferidos assepticamente para placas de Petri. Os meios de cultivo foram inoculados com cilindros de BDA de 5 mm de diâmetro contendo o fungo. Os meios inoculados foram mantidos a 25 ºC em ausência de luz. Todo o experimento foi realizado em quadruplicata. O crescimento do fungo foi acompanhado pela medida do diâmetro de crescimento micelial (mm). Para a segunda etapa experimental, a criopreservação, optou-se pela concentração de glicerol em função dos resultados do teste de ICF e de relatos da literatura. O meio de cultivo para a criopreservação foi composto por grãos de arroz (200g) que foram cobertos de água ultra-pura e mantidos a 90 ºC por 45 min. O excesso de água foi removido e os grãos foram autoclavados. Do inóculo foram transferidos cinco discos de 7 mm de diâmetro para o meio de cultivo. O meio foi mantido a 25 ºC em estufa. Após a colonização do meio de cultivo, cinco grãos contendo o micélio do fungo foram utilizados para cada tubo de criopreservação. Tubos para criopreservação foram preparados utilizando-se canudos plásticos com 6 mm de diâmetro e 70 mm de comprimento, selados em uma das extremidades (4). Os tubos de criopreservação foram autoclavados, receberam 800µl da solução crioprotetora e cinco grãos de arroz colonizados pelo fungo, em seguida foram termoselados e congelados à -20 e -70 ºC. Foram também criopreservados cilindros de meio BDA contendo o fungo, como padrão. A metodologia para retirada do fungo Pleurotus sp foi conforme Herrera et al. (8). Após 30 dias de congelamento, retirou-se três tubos de cada tratamento. Os tubos foram descongelados em banho-maria a 30 ºC por 15 min. Em seguida foram lavados em álcool 70% e depois em álcool 96%. Uma das extremidades foi cortada e o conteúdo transferido para placas de Petri contendo o meio de cultivo BDA (39g/L). As placas inoculadas foram codificadas em A, B e C e dispostas ao acaso para crescimento em estufa a 25 ºC. 2 Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional 2014

3 3. ANÁLISES E DISCUSSÕES Na Fig. 1 é apresentado o resultado do teste de inibição de crescimento do fungo Pleurotus sp com glicerol. Segundo Hubálek (11) a faixa de concentração de glicerol utilizada como crioprotetor para microrganismos em geral é de 2% a 55%. A média citada na literatura é de 10% (4). Conforme a Fig. 1, pode-se observar que não houve nenhum desenvolvimento do fungo na concentração de 30% de glicerol e houve uma grande inibição do crescimento a 10%. Isto pode ter ocorrido, por que o glicerol possui a capacidade de desnaturar proteínas e também de lesar a membrana das células microbianas (13). Isto explica porque o glicerol, que é um álcool trihidratrado (19) que pode ser utilizado como anti-séptico e desinfetante (13), demonstrou toxicidade ao fungo. Glicerol 5% Glicerol 10% Glicerol 30% Figura 1. Inibição do crescimento do fungo Pleurotus sp na presença de crioprotetor Glicerol em diferentes concentrações, após 14 dias de crescimento. Os resultados indicam que concentrações de glicerol de até 10% não inibem totalmente o crescimento do fungo sendo ela a concentração adequada, já que se opta por utilizar para a criopreservação a maior concentração do crioprotetor que não iniba totalmente o crescimento do fungo. Maiores concentrações do crioprotetor ligam maiores quantidades de água, o que afeta diretamente a sua capacidade de proteger as células do frio. A Tabela 1 apresenta os resultados da recuperação micelial após a criopreservação com glicerol. Utilizando-se o grão de arroz ou o plug de BDA nas temperaturas de -20 ou -70 ºC a recuperação foi de 100%, demonstrando a eficiência do glicerol como crioprotetor. Este é um crioprotetor penetrante à parede celular e à membrana plasmática (11). Os fungos não apresentam parede celular tão resistentes quanto as demais células, sendo assim os efeitos do glicerol sobre a membrana plasmática podem ser acentuados pela ação direta deste crioprotetor. Tabela 1. Porcentagem de recuperação crescido em ágar batata dextrose ou em grãos de arroz criopreservado em diferentes temperaturas na presença de Glicerol (10%), após 30 dias de congelamento. Meio de Porcentagem de recuperação Temperatura cultivo das placas Arroz % Arroz % BDA % BDA % Segundo Thomas e Smith (20), taxas lentas de congelamento de células de fungos na presença de glicerol armazenadas abaixo de -139 ºC em nitrogênio líquido, mostraram bons resultados. Stalpers et al. (18), relatam 96,9% de recuperação para basidiomicetos depois de 12 anos armazenados em nitrogênio líquido em solução a 10% de glicerol. Homolka et al. (10) obtiveram 100% de recuperação de quatro espécies do gênero Agaricus, e 95-97% de recuperação total das 356 linhagens testadas. Onde foram submetidas a dois anos de criopreservação em nitrogênio líquido, sendo utilizado o crioprotetor glicerol a 10%. Isto demonstra a capacidade deste crioprotetor para basidiomicetos, o que concorda com os resultados obtidos neste trabalho. Apesar dos processos de criopreservação terem sido bastante estudados para o Glicerol e para fungos basidiomicetos, nosso resultado tornam-se importantes por obter resultados Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional

4 expressivos de recuperação do crescimento de Pleurotus sp criopreservado a -20 ºC, em temperatura utilizada comercialmente e de fácil obtenção. A Fig. 2 mostra o vigor de crescimento do micélio do fungo após recuperação da criopreservação a -70ºC, crescido em grãos de arroz (a) e meio BDA (b). O vigor de crescimento é semelhante nos dois casos, confirmando a grande capacidade crioprotetora do glicerol, que nas condições apresentadas neste experimento apresentou 100% de recuperação ao micélio do fungo (Tabela 1). Na criopreservação à -20ºC (Fig. 3) ambas as amostras apresentaram 100% de recuperação do crescimento, no entanto o vigor de crescimento do fungo criopreservado crescido em grãos de arroz foi maior que o apresentado em discos de BDA. Este resultado pode ser explicado pelo fato do amido presente nos grãos de arroz formar um gel que atua como crioprotetor às hifas do fungo que penetraram no grão (7). Sendo assim há um aumento na proteção às células do fungo, proporcionando maior vigor de crescimento após a recuperação. a) Grãos de arroz b) Discos de BDA Figura 2. Vigor de crescimento do fungo Pleurotus sp crescido em ágar batata dextrose ou em grãos de arroz e criopreservado a -70ºC. a) Grãos de arroz a) Discos de BDA Figura 3. Vigor de crescimento do fungo Pleurotus sp crescido em ágar batata dextrose ou em grãos de arroz e criopreservado a -20ºC. Os resultados desta pesquisa são importantes para o desenvolvimento de métodos de criopreservação para o fungo Pleurotus sp, bem como para o estabelecimento de protocolos específicos para este fungo. A criopreservação a - 20 e -70 ºC torna a técnica acessível a universidades e centros de pesquisa, colaborando para incrementar a pesquisa e a produção de cogumelos. 4 Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional 2014

5 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS De acordo com os resultados obtidos conclui-se que o glicerol causa inibição do crescimento do fungo Pleurotus sp em concentrações acima de 30% e reduz o diâmetro do micélio na concentração de 10%. - A criopreservação em grãos de arroz e discos de BDA, utilizando o crioprotetor glicerol a 10% é eficiente para as temperaturas de -20 e -70 ºC para 30 dias. REFERENCIAS (1) Alcarde, A.R.; Basso, L. C. Efeito da trealose na manutenção da viabilidade de células de leveduras desidratadas por liofilização. Sci. Agric., 54 (3), (2) Bano, Z.; Rajarathnam, S. Pleurotus mushrooms: Part II. Chemical composition, preservation and role an human food. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 27: , (3) Campos, A. K. Mota, M. A.; Araújo, J. V.; Cecon, P. R. Atividade predatória, crescimento radial e esporulação de fungos predadores de nematóides Macrosporium spp, submetido à criopreservação. Ciên. Rural, 34: , (4) Challen, M.; Elliott, T. J. Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen. J. Microbiol. Meth., 5: 11-23, (5) Diniz, M. F.; Ferreira, L. T. Bancos genéticos de plantas, animais e microrganismos. Biotecnol. Ciên. Desenvol., 13: 34-38, (6) Embrapa. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Disponível em: < em:16/10/2007. (7) Fennema, O. R. Química de los alimentos. Acribia, Zaragoza, 1993, 1051p. (8) Herrera, I. L.; Mata, G.; Hernández, R. G. Evaluation of the viability of Pleutorus spp. Strains after liquid nitrogen cryopreservation, Rev. Microbiol., 29 (3), (9) Hoffmann, P. Cryopreservation of fungi.w. J. Microbiol. Biotechnol., 7: 92-94, (10) Homolka, L.; Lisá, L.; Nerud, F. Viability of basidiomycete strains after cryopreservation: comparison of two different freezing protocols. Folia Microbiol., 48: , Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional

6 (11) Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, 46: , (12) Mata, G.; Salmones, D.; Ortega, P. M. Viability and mushroom production of Lentinula edodes and L. boryana strains (Fungi: Basidiomycetes) after cryogenic storage of spawn stocks. W. J. Microbiol. Biotechnol., 16: , (13) Pelczar, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R. Microbiologia conceitos e aplicações. Markon Books, São Paulo, 1997, 524 p. (14) Putzke, J; Putzke, M.T.L. Os reinos dos fungos. EDUNISC, Santa Cruz do Sul, 1998, 606p (15) Santos, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal a alternativa para a conservação a longo prazo. Biotecnol. Ciên. Desenvol., 20: 60-65, (16) Silva, A. M. D.; Procópio, C. D.; Santos, R. C. Sistema de informações de banco ativo de germoplasma. AGROSOFT 97, Disponível em: < em:17/10/2007 (17) Smith, D.; Thomas, V. E. Cryogenic light microscopy and development of cooling protocols for the cryopreservation of filamentous fungi. W. J. Microbiol. Biotechnol., 14: 49-57, (18) Stalpers, J. A. De Hoog, A.; Vlug, I.J. Improvement of the straw technique for the preservation of fungi in liquid nitrogen. Mycologia, 79: 82-89, (19) Thain, M.; Hickman, M. The penguin dictionary of biology. New Edition, London, 1996, 664 p. (20) Thomas, V.; Smith, D. Cryogenic light microscopy and the development of long term cryopreservation techniques for fungi. Outl. Agricult., 23 (3), , Anais do 12º Encontro Científico Cultural Interinstitucional 2014