Manutenção de cepas padrão. Dra. Maria Teresa Destro Fac. Ciências Farmacêuticas

Transcrição

1 Manutenção de cepas padrão Dra. Maria Teresa Destro Fac. Ciências Farmacêuticas

2 Tópicos Rastreabilidade e a ISO Materiais de referência Utilidade das culturas de referência Montagem de um cepário Preservação de micro-organismos

3 No século XIX... Fonte: Life

4 Rastreabilidade Chave para credibilidade (e para ISO) Definição Propriedade do resultado de uma medição, ou do valor de um padrão, que pode ser relacionada a referências estabelecidas, geralmente a padrões nacionais ou internacionais, através de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas estabelecidas Fonte: Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia - VIM (2000)

5 Rastreabilidade Chave para credibilidade (e para ISO) Definição Propriedade do resultado de uma medição, ou do valor de um padrão, que pode ser relacionada a referências estabelecidas, geralmente a padrões nacionais ou internacionais, através de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas estabelecidas Fonte: Vocabulário Internacional de Termos Fundamentais e Gerais de Metrologia - VIM (2000)

6 Rastreabilidade Mais clara para metrologia

7 Rastreabilidade Mais clara para metrologia Em laboratórios de ensaio há a necessidade de se relacionar o resultado obtido com referências reconhecidas para assegurar que este seja aceito Materiais de referência

8 Rastreabilidade Materiais de referência Adequados à análise Metais Culturas padrão

9 Item 5.6.3

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11 Materiais de referência Os materiais de referência devem, sempre que possível, ser rastreáveis às unidades de medida SI, ou a materiais de referência certificados. Materiais de referência internos devem ser verificados na medida em que isso for técnica e economicamente praticável.

12 Materiais de referência Os materiais de referência devem, sempre que possível, ser rastreáveis às unidades de medida SI, ou a materiais de referência certificados. Materiais de referência internos devem ser verificados na medida em que isso for técnica e economicamente praticável.

13 Materiais de referência Importantes para Calibrar equipamentos Demonstrar a precisão de resultados Monitorar o desempenho do laboratório Avaliar métodos Quantitativos ou qualitativos Permitir a comparação de métodos

14 Culturas de referência Ponto crítico em lab. de microbiologia Definição Microrganismos definidos ao nível de gênero e espécie, catalogados e descritos de acordo com suas características e preferencialmente identificando sua origem (ISO :2000)

15 Culturas de referência Rastreáveis a fontes reconhecidas Internacionalmente ATCC, NCTC, etc. Nacionalmente INCQS, IAL, CCT-Fund. André Tosello

16 World Data Centre for Microorganisms

17 60 coleções registradas

18 Culturas de referência Rastreáveis a fontes reconhecidas Internacionalmente ATCC, NCTC, etc. Nacionalmente INCQS, IAL, CCT-Fund. André Tosello Cepas comerciais Cultivos de trabalho

19 Culturas de referência Rastreáveis a fontes reconhecidas Ter Pureza Características bioquímicas verificadas e registradas

20 Culturas de referência Rastreáveis a fontes reconhecidas Ter Pureza Características bioquímicas Ser adequada ao experimento! verificadas e registradas

21 Culturas de referência Importantes para Verificar o eficiência de meios de cultura kits Avaliar métodos Treinamento de colaboradores Controle (+) e (-) de ensaios garantia do resultado do ensaio

22 Algumas definições Estoque de referência Conjunto de cultivos separados e idênticos obtidos a partir de um único sub-cultivo da cepa de referência (ISO :2000) Cultivo de trabalho Sub-cultivo primário de um estoque de referência (ISO :2000)

23 Atenção!!!! Cultivos de trabalho não devem ser subcultivados!!! Exceção: p. ex. método recomenda subcultivo por 24h antes de semeadura Cultivos de trabalho não podem substituir estoque de referência! Cepas comerciais de cultivos de referência devem ser usadas como cultivos de trabalho

24 Preparo genérico de cultivos de trabalho (Eurachem, EA4/10) Cepa referência fonte reconhecida Não permitido Uso 1 sub-cultivo * Estoque de referência 1 sub-cultivo Manutenção condições especificadas Cultivo de trabalho Avaliar pureza e resultados bioquímicos condições e tempo de estocagem det. Avaliar pureza e resultados bioquímicos * Descongelar/ reconstituir

25 Todas as etapas devem ser documentadas Registros detalhados devem ser mantidos

26 Montagem de um cepário Adquirir o cultivo referência Reativar Avaliar a pureza Determinado no Manual da Qualidade: Vai abrir 1/ano? 1/6 meses? 1/ mês? Armazenar de maneira apropriada Preparar n o necessário de tubos estoque referência Congelado; liofilizado; meio de conservação (?) - Identificar de forma inequívoca: 1/10, 2/10, etc

27 Pq preservar microrganismos? Repiques constantes podem levar à: Contaminação Diminuição de viabilidade Mutação Fonte: Filippis, 2010

28 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Crio-preservação Congelamento e preservação em N 2 líquido Fase líquida ou gasosa Congelamento e preservação a -70 o C Fonte: Filippis, 2010

29 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Crio-preservação Dessecação Preservação por centrifugação Preservação por L-drying Preservação por liofilização Mais conhecida Fonte: Filippis, 2010

30 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Crio-preservação Dessecação Metabolicamente ativas Repiques periódicos ágar meio líquido Fonte: Filippis, 2010

31 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Crio-preservação Dessecação Metabolicamente ativas Repiques periódicos Manutenção em slants com óleo mineral Fonte: Filippis, 2010

32 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Crio-preservação Dessecação Metabolicamente ativas Repiques periódicos Manutenção em slants com óleo mineral Preservação em água Fonte: Filippis, 2010

33 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Congelamento -20 o C Vantagens: barato, equip.simples, contaminação reduzida, necessidade de pouco espaço Desvantagens: monitoração do equip., manutenção frequente dos mos., estruturas biológicas instáveis Fonte: Filippis, 2010

34 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Congelamento -20 o C Congelamento -70 o C Vantagens - estabilidade, armazenamento por longos períodos Desvantagens: custo equip./manutenção constante Fonte: Filippis, 2010

35 Métodos de preservação Congelamento Importante a escolha do crio-preservador Glicerol: Mais utilizado Congelamento de -20 o C a -196 o C Procedimento simples Sol. aquosa a 10% - 20% Fonte: Filippis, 2010

36 Métodos de preservação Metabolicamente inativas Liofilização Vantagens: Produção, distribuição e armazenamento de lotes Alta viabilidade durante a estocagem (50 anos) Produção de grande número de ampolas/lote Armazenamento simples/pouco espaço Desvantagens: Difícil para laboratórios pequenos Alto custo inicial Utilização de diversos reagentes/mat. laboratório Fonte: Filippis, 2010

37 Métodos de preservação Metabolicamente ativas Repiques Vantagens: barato, não requer equipamentos especiais Desvantagens: mutações, contaminações, manutenção frequente, espaço Fonte: Filippis, 2010

38 Métodos de preservação Metabolicamente ativas Repiques Slants com óleo mineral Repiques menos frequentes, menor taxa de contaminação/mutações Fonte: Filippis, 2010

39 Estabelecimento de um cepário Adquirir o cultivo referência Reativar Avaliar a pureza Armazenar de maneira apropriada Preparar n o necessário de tubos estoque referência Reativar Preparar tubos de cultivo de trabalho Uso na rotina Avaliar a pureza - Tantos quanto necessários para atender ao estabelecido no MQ p. ex.: 1/ semana? 2/ semana? -Identificar de forma inequívoca: 1/10 S1a; 1/10 S1b; 1/10 S2a; etc.

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42 Obrigada!