PROSPECÇÃO DE FUNGOS LIPOLÍTICOS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORES EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS PROPESQ GU3 # 003/2010

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1 PROSPECÇÃO DE FUNGOS LIPOLÍTICOS DO ESTADO DO TOCANTINS PROMISSORES EM APLICAÇÕES INDUSTRIAIS PROPESQ GU3 # 003/2010 Leonardo Alves dos Santos 1 ; Ezequiel Marcelino da Silva 2. 1 Aluno do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; leonardogpi_alves@hotmail.com PIBIC/UFT 2 Orientador do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; ezequielsilva@mail.uft.edu.br RESUMO Lipases são enzimas com alto potencial de aplicação industrial, pois as mesmas atuam de uma forma estereosseletiva na obtenção de produtos enriquecidos com ácidos graxos essenciais, ésteres, emulsificantes, biodiesel e lipídeos estruturados. De um ponto de vista econômico e industrial, as lipases obtidas pelo cultivo de micro-organismos são mais atrativas do que as de origem pancreática animal devido ao baixo custo de isolamento das lipases obtidas pelo cultivo microbiano. Em especial, a produção de lipases de origem fúngica tem uma alta valorização devido à mesma não obter lipases com um grau de patogenicidade à saúde do homem. Com base nessas informações, o objetivo deste experimento foi o isolamento de fungos presentes em cinco amostras de frutos em decomposição (acerola, buriti, pequenos cocos nativos, manga e tamarindo), o cultivo dos mesmos (média de dois fungos por amostra) em determinadas condições e a quantificação das atividades lipolíticas dos fungos advindos dessas fontes pela reação das lipases obtidas com palmitato de p-nitrofenila (p-npp), avaliada em uma absorbância de 410 ηm e realizada em triplicata para cada amostra. Observou-se que a produção de lipases de fungos provenientes do buriti em decomposição foi a mais expressiva (média de 4,92 U). Tal resultado demonstra que os fungos lipolíticos advindos do buriti em decomposição possuem um grande potencial em aplicações industriais na região. Palavras-chave: Lipases; fungos lipolíticos; aplicação industrial.

2 INTRODUÇÃO Graças a uma melhor concepção de bioquímica, de processos fermentativos e de métodos de purificação, um número cada vez maior de enzimas pode ser produzido de forma acessível. Os avanços tecnológicos em relação aos métodos de utilização têm ampliado a sua demanda industrial. Vale ressaltar que, em função das diversas reações que as enzimas podem catalisar, a quantidade de enzimas empregadas comercialmente continua a expandir. Lipases (triacilglicerol acil-hidrolases EC ) são enzimas de apreciável potencial industrial, por catalisarem a hidrólise dos triacilgliceróis em glicerol e ácidos graxos livres. São biocatalisadores encontrados na natureza, podem ser obtidos através de fontes microbianas, animais ou vegetais. Em contrapartida às esterases, as lipases são ativadas somente quando há a interface óleo-água e, assim, não hidrolisam substratos que se encontram dissolvidos, não necessitam de cofatores, são régio-específicas e operam em ampla faixa de ph. Em eucariotos, as lipases são envolvidas em várias fases do metabolismo lipídico incluindo digestão de gorduras, a absorção, a reconstituição, e lipoproteína de metabolismo. Em plantas, as lipases são encontradas em tecidos de energia de reserva (BALASHEV et al., 2001). Lipases utilizadas comercialmente são geralmente obtidas de microrganismos que produzem uma diversidade de lipases extracelulares, o que confere métodos mais simplificados de isolamento e, dessa forma se tornam mais estáveis. Várias lipases são ativas em solventes orgânicos, na qual catalisam reações como esterificação, transesterificação, acilação de glicóis, síntese de peptídeos e outros produtos químicos. Hoje, as lipases são industrialmente importantes, assim como as proteases e as carboidrases. MATERIAIS E MÉTODOS A seleção dos microrganismos foi realizada através do mapeamento de pontos estratégicos no Estado do Tocantins onde se encontram a produção agrícola de grãos e frutos oleaginosos, estação de tratamento de resíduos de matadouro, de laticínios, entre outros.

3 3.1 Coleta de Microrganismos Lipolíticos do Estado do Tocantins. A coleta de microrganismos foi realizada transferindo as amostras para frascos de 50 ml contendo tampão fosfato 50 mm, ph 7,0. Os frascos foram acondicionados em caixa térmica com gelo para transporte e transferidos para câmara refrigerada a 5 C. 3.2 Isolamento de Fungos Em placas de Petri contendo como meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA 2%) foram transferidos 50 μl das amostras coletada em campo e espalhadas com o auxílio de pérolas de vidro e incubadas à temperatura ambiente para o crescimento do microrganismo, devido a eventual presença de esporos. Nesta etapa, as espécies foram repicadas quantas vezes fossem necessárias para o completo isolamento do fungo filamentoso. 3.3 Seleção dos Fungos Lipolíticos A seleção dos fungos lipolíticos foi realizada pela repicagem dos isolados em placas de Petri contendo meio BDA enriquecido com Tween 80. As placas de Petri receberam um papel quadriculado por baixo com identificação numérica de cada quadrado. Os isolados foram repicados em cada quadrado e incubados a temperatura de 30 C por até 5 dias. Os isolados que apresentaram a formação de halo em volta do micélio, devido à hidrólise do Tween 80 foram identificados e repicados no mesmo meio de cultura em tubos de ensaio inclinado. As amostras foram mantidas sob refrigeração até tratamento de conservação. 3.6 Cultivo dos Microrganismos Produtores de Lipase Cultivo de fungos filamentos Os fungos filamentos selecionados foram cultivados em Erlermeyers de 250 ml contendo 100 ml de meio cultura elaborado com extrato de malte a 2% enriquecido com óleo de oliva extra-virgem a 2%. As culturas foram incubadas em estado estacionário a 30 C por 10 dias. Os micélios dos fungos foram coletados e liofilizados até massa constante para manutenção dos isolados. O sobrenadante foi filtrado em papel filtro Whatman n 1 e ensaiado quanto à atividade de lipase. 3.7 Ensaio Enzimático Palmitato de p-nitrofenila

4 A determinação da atividade de lipase foi realizada em triplicata utilizando p-npp (Sigma St. Louis, USA) como substrato. A concentração p-nitrofenol liberado após ação da lipase foi determinada pela leitura da absorbância a 410 ηm. Os valores de absorbância obtidos foram transformados em μmoles de p-nitrofenol liberados em comparação à curva de calibração de p-nitrofenol. O método consiste em acompanhar a reação de 800 μl de p-npp (4mM) com 200 μl de extrato enzimático a 50 C por 30 min. A reação é cessada pela adição de 2,0 ml de bicarbonato de sódio a 10%. RESULTADO E DISCUSSÃO Com os resultados obtidos das cinco amostras avaliadas em triplicatas, tendo em média dois fungos isolados por cada amostra, pode ser observar que o extrato enzimático proveniente da amostra de buriti (B), obteve a maior média na taxa de atividade lipolítica total em relação aos outros extratos, seguido pelos extratos provenientes da tamarindo (T) e pequenos cocos nativos (C). Analisando-se cada extrato em particular, verifica-se que no caso do extrato enzimático proveniente de fungos presentes na amostra de acerola (A) há uma atividade enzimática total mediana com o menor desvio padrão observado dentre as triplicatas do experimento. Apesar dessa característica, tal fonte de isolamento de fungos não é atrativa devido às atividades enzimáticas observadas nas triplicatas serem baixas em relação aos outros extratos. No caso do extrato enzimático fúngico proveniente do buriti (B) observou-se dentre as triplicatas a maior atividade enzimática total do experimento e um desvio padrão mediano. No caso do extrato proveniente das amostras de pequenos cocos nativos da cidade (C) observouse a segunda maior atividade lipolítica em uma de suas triplicatas. Porém, quando é avaliada, em particular, a média da atividade enzimática total observada na amostra, verifica-se que tal resultado é mediano em comparação as outras médias observadas, quase se igualando a observada no extrato de acerola (A), além de ter um dos maiores desvios padrão observado. Já em relação ao extrato proveniente da amostra de tamarindo (T) observou-se um pequeno desvio padrão entre as triplicatas trabalhadas, além da segunda maior média de atividade enzimática total no experimento. Tal resultado demonstra que, assim como o buriti, a tamarindo em decomposição possui potencial de possível fonte de isolamento fúngico para obtenção de lipases. Por fim, no

5 caso do extrato proveniente da amostra fúngica presente na amostra de manga (M) verifica-se que dentre todas as médias de atividade total obtida, a média desse extrato foi a de menor valor em relação ás outras, além de ter o maior desvio padrão apresentado na avaliação, demonstrando assim que tal fonte não é muito atrativa no quesito de busca de fungos lipolíticos. Tais resultados demonstram que a fonte de isolamento mais atrativa para a prospecção de fungos lipolítica é o buriti em decomposição, fonte fúngica que mostrou ter boas atividades lipolíticas em cada triplicata e também na média geral. Tal singularidade observada no experimento deve estar relacionada com o fato de que o buriti possui uma boa composição lipídica em relação aos outros frutos, e isso favoreça o desenvolvimento de fungos com boa capacidade lipolítica. Tabela 1: Dados referentes à análise em triplicata de extratos enzimáticos obtidos a partir de amostras de 100ml contendo fungos provenientes de acerola (A), buriti (B), pequenos cocos nativos (C), tamarindo (T) e manga (M) em estado de decomposição. LITERATURA CITADA BALASHEV K, JENSEN TR, KJAER K, BJORNHOLM T. Novel methods for studying lipids and lipases and their mutual interaction at interfaces: Part I. Atomic force microscopy. Biochimie 2001;83: ZAIA, D.M.A., ZAIA, C.T.B.V., LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v.21, n.6, p , AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT.